Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

Resumo

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Resumo

Nós projectamos um dispositivo de carregamento que seja capaz de aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um tecido de engenharia biocompósitos fabricadas para transplante. Enquanto o dispositivo funciona principalmente como um biorreactor que imita as tensões mecânicas nativas, também está equipado com uma célula de carga para fornecer feedback força ou teste mecânico das construções. Os sujeitos dispositivo projetado construções cartilagem biaxial carga mecânica com grande precisão de dose de ataque (amplitude e freqüência) e é compacto o suficiente para caber dentro de uma cultura de tecidos incubadora padrão. Ele carrega amostras directamente numa placa de cultura de tecidos e em vários tamanhos de placas são compatíveis com o sistema. O dispositivo foi projetado com componentes fabricados para aplicações de laser guiadas com precisão. Carga bi-axial é realizada por duas fases ortogonais. As fases têm uma faixa de percurso 50 mm, e são conduzidos independentemente por actuadores do motor de passo, controlado porum motorista de circuito fechado do motor deslizante que possui capacidades de micro-stepping, permitindo tamanhos de passo de menos de 50 nm. Uma polissulfona de carregamento cilindro está acoplada à plataforma em movimento bi-axial. Movimentos dos estágios são controlados por Thor-laboratórios de Tecnologia Avançada de Posicionamento (APT) software. O excitador do motor de passo é usado com o software para ajustar os parâmetros de carregamento de frequência e amplitude de cisalhamento e compressão, tanto independentemente como simultaneamente. Realimentação de posição é fornecida por codificadores ópticos não lineares que têm uma repetibilidade bidireccional de 0,1 um e uma resolução de 20 nm, traduzindo-se uma precisão de posicionamento inferior a 3 um sobre o total de 50 mm de curso. Estes encoders fornecer o necessário feedback de posição no sistema eletrônico da unidade para garantir verdadeiras capacidades nanoposicionamento. A fim de proporcionar a realimentação de força para detectar e avaliar respostas contacto de carga, uma célula de carga em miniatura precisão está posicionado entre o cilindro de carregamento e o movendoplataforma g. A célula de carga tem grandes precisões de 0,15% a 0,25% da escala total.

Introdução

Nós projetamos um biorreator de carga que é capaz de aplicar uniaxial ou biaxial tensão mecânica a um tecido biocompósitos engenharia fabricados para transplante. Este dispositivo é concebido principalmente como um biorreactor para substituições de engenharia para a cartilagem articular, mas também poderia ser utilizado para outros tecidos estruturais no corpo humano. A nossa motivação neste projeto biorreator decorre Drachman e Sokoloff ^1, que fez a observação seminal de formação anormal da cartilagem articular em embriões de galinha paralisadas devido à falta de movimento. Da mesma forma, o exercício físico é essencial para o desenvolvimento do músculo normal e osso. De acordo com este conceito, muitos grupos de pesquisa têm investigado como diferentes modos de estímulos físicos durante o cultivo in vitro modula as propriedades bioquímicas e mecânicas dos biocompósitos célula-biomaterial e explantes de tecido ^2-7. O conceito de engenharia de tecidos funcionaisenvolve a utilização in vitro de estímulos mecânicos para melhorar as propriedades funcionais de tecidos, isto é, as propriedades mecânicas, que permitem que o tecido para resistir ao esperado no stress in vivo e coe ^8,9. Numerosos estudos relatam o uso carregamento mecânico em termos de cisalhamento e compressão para estimular construções cartilagem de engenharia para juntas articulares. Mauck et al. ¹⁰ sugerem que a carga mecânica sozinha pode induzir condrogénese de células estaminais mesenquimais, mesmo na ausência de factores de crescimento que são consideradas vitais. Aplicação de carregamento mecânico intermitente, tais como a compressão de cisalhamento ou durante o cultivo de tecidos tem sido mostrado para modular a formação do osso e cartilagem, no entanto, a dosimetria óptima de alimentação varia com as propriedades do tecido celular e ^11.

A função mais importante das cartilagens articulares é a capacidade de resistir a forças de compressão e de corte dentroa articulação, portanto, ele tem que ter alta compressão e módulos de cisalhamento. A falta de resistência mecânica funcional e ultra fisiológico na cartilagem engenharia resultou na degradação em neo-cartilagem in vivo e a insuficiência das estratégias de substituição de cartilagem em articulações. Apesar de compressão e de cisalhamento têm sido comumente demonstrado modular e melhorar a resistência mecânica da cartilagem articular biocompósitos, uma abordagem combinada é raro ^6,12-15. Wartella e Wayne ¹⁶ projetou um biorreator que se aplica a tensão e compressão para produzir substitutos de cartilagem do menisco. Waldman et al. ¹⁵ concebido para aplicar um dispositivo de compressão e de cisalhamento de condrócitos em cultura num substrato poroso polifosfato de cálcio. Bian et al. ¹⁷ demonstraram propriedades mecânicas correspondentes cartilagem nativa com a cultura in vitro de condrócitos caninos adultos em geles e aplicação de biaxial Mechmecânicos de carregamento (compressão deformational carga e deslizamento de carga de contato).

O biaxial biorreator carregamento mecânico foi originalmente concebido por Danielle Chu em nosso laboratório com o objetivo geral de induzir adaptações morfológicas em tecido de cartilagem engenharia constrói resultando em módulos de compressão e de cisalhamento mais elevadas do que as actualmente disponíveis ^18. Acreditamos que esta pesquisa irá aumentar significativamente a nossa compreensão mais ampla de como mechanotransduction pode ser modulada para engenheiro de tecidos clinicamente relevantes.

Protocolo

1. Biaxial Carregando biorreator projeto

1. O biorreactor emprega duas fases produzidos pela Thor-labs (Newton, MA) para aplicações de laser guiadas com precisão para a aplicação uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para engenharia de tecidos, com uma grande precisão da dose de carga (amplitude e frequência), e aplicação a uma ampla variedade de condições de cultura de tecidos a partir de único para placas de 24 poços (Figura 1).
2. Carga bi-axial é realizada por duas fases Travelmax (LNR50SE). Esses estágios são montados ortogonalmente numa configuração XZ. A fase horizontal proporciona movimentos de cisalhamento dinâmico oscilando ao longo do eixo-X. A fase de carga de compressão vertical prever dinâmico oscilando ao longo do eixo-Z. Estes estágios têm uma faixa de deslocamento 50 mm e são conduzidos de forma independente por atuadores de motor de passo (DRV014), controlada por um motorista do motor de ciclo fechado de passo (BSC102), que possui capacidade de micro-stepping, permitindo tamanhos de passo de menos de50 nm.
3. O dispositivo é montado sobre uma rígida 25 centímetros x 30 cm x 12,5 mm placa base de alumínio que é usado como uma plataforma para a montagem dos componentes da máquina e para a montagem de placas de cultura de tecidos. Paragens ajustáveis ​​cinemáticos são usados ​​para bloquear as placas de cultura de tecidos no local sobre a placa base de alumínio. Essas paradas cinemáticas têm parafusos de ajuste fino para permitir o alinhamento preciso que não é possível de outra forma com a mão. O design modular do prato de base permite a colocação flexível dessas paragens cinemáticos para acomodar placas de diferentes tamanhos e formas (placas de Petri vs placas de poços múltiplos).
4. A custom-usinado polysulfone carregamento cilindro é acoplado à plataforma móvel bi-axial através de um sinal de maior precisão usinadas. Material de Polysulfone foi escolhido devido à sua biocompatibilidade, facilidade de usinagem e facilidade de esterilização.
5. Movimentos dos estágios são controlados pela Tecnologia Avançada de Posicionamento 'Thor-labs (APT) software. O condutor do motor de passo nos éed em combinação com o software que permite o ajuste dos parâmetros de carregamento de frequência e amplitude de cisalhamento e compressão, tanto independentemente como simultaneamente.
6. Realimentação posicional é fornecida por encoders ópticos lineares que estão ligados a cada plataforma móvel e estão integrados com o software. O sistema codificador tem uma repetibilidade bidirecional de 0,1 mM e uma resolução de 20 nm, traduzindo-se a precisão posicional de menos de 3 mM sobre os total de 50 mm de curso. Estes encoders fornecer o necessário feedback de posição no sistema eletrônico da unidade para garantir verdadeiras capacidades nanoposicionamento e uma leitura direta da posição absoluta.
7. A fim de proporcionar a realimentação de força necessária para a detecção de contacto entre a prensa e as amostras e avaliar as respostas de carga, uma célula de carga em miniatura precisão (Honeywell Modelo 31) está posicionada entre o cilindro de carregamento e a plataforma móvel (figura 2). A célula de carga tem alta precisão de0,15% a 0,25% da escala total. A unidade de exibição (SC500) para a célula de carga também pode fornecer medições de carga de até 5 casas decimais. Além disso, tem uma porta RS-232 para permitir a recolha de dados de um computador.

2. Célula-semeado de agarose Construções

1. Prepare a 4% de agarose: Adicionar 0,8 g de agarose de 20 ml de DMEM (sem aditivos) num frasco de 50 ml, fervura, e, em seguida manter a 70 ° C no forno até à sua utilização.
2. Ajustar o volume de suspensão celular para dobro da densidade de semeadura de células desejado. Esta suspensão é misturada com um volume igual de 4% w / v de agarose para criar um gel de agarose a 2% para a densidade desejada a semeadura.
3. Colocar ambos a suspensão de células e uma pipeta de 10 ml na incubadora.
4. Configure o sistema de fundição gel. Uma 1,5 mm e uma 0,75 milímetros placa separadora devem ser colocados juntos para criar um gel grosso 2,25 milímetros. Outras placas espaçadoras tamanho pode ser usado para criar diferentes espessuras de gel. O sistema de fundição de gel não é grande o suficiente para manter estas placas togetela, então eles devem ser firmemente gravado para evitar vazamentos.
5. O próximo passo é misturar rapidamente a suspensão de células com a agarose previamente preparadas e pipeta no interior do molde de gel, antes da agarose solidificar. Remover o líquido de agarose do forno e colocar um termómetro estéril no mesmo. A agarose deve arrefecer até 42-43 ° C antes da mistura com as células. Aqueça a suspensão de células a 37 ° C. Uma vez que a agarose atinge 43 ° C, de forma rápida, pipetar-se a quantidade desejada e, em seguida, pipeta imediatamente a suspensão de células para cima e para baixo algumas vezes para misturar. Em seguida, pipeta imediatamente toda a mistura para dentro do molde do gel.
6. Permita que o gel solidificar por 10-15 min e, em seguida, incline-o cuidadosamente para a posição horizontal.
7. Remova a placa de vidro superior e discos perfurados com a biópsia. Os discos podem ser pego com uma pequena espátula estéril. Em nossa experiência, a 9 ml gel era grande o suficiente para fazer mais de uma centena de discos de 5 mm de diâmetro.

3. Cultura dos Discos

1. Coloque um disco em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços não-tecido tratado.
2. Adicionar 2 ml de meio de diferenciação sem soro condrogénica a cada poço.
3. Colocar as placas em incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).
4. De alterações na mídia, substitua 1 ml por poço a cada 2-3 dias.

4. Imobilização de amostras para Carregamento mecânico

1. Prepare a 4% de agarose (nenhuma suspensão de células adicionado) e o gel deve ser mais fino do que as próprias amostras (para evitar interferência durante o carregamento). A espessura recomendada é de 1,5-1,9 mm (para as amostras de 2,25 milímetros de espessura).
2. Uma vez gelificada, os discos 16 mm de diâmetro perfurados para placas de 24 poços. Em cada disco, perfurador um milímetro furo 5 para a amostra a ser colocado dentro Se desejado, perfurador outro orifício 5 mm na extremidade do disco para a pipeta para ser colocada durante mudanças de meio.
3. Uma vez que os poços de agarose foram feitas, no lugar da placa de 24 poços, conforme mostrado na Figura 3.
4. Uma vez que a agarose wvaras estão na placa de 24 poços, prima caber amostras em cada poço. A amostra deve sobressair a partir do cimo do poço de agarose.

5. Carga mecânica

1. Esterilizar cilindro (Figura 2).
2. Fixe a placa de alumínio para carregar celular. Seguro de carga placa / montagem placa de células / alumínio da carga para o palco.
3. Ligue o controlador de motor de passo (interruptor na parte de trás).
4. Ligue o PC e programa aberto "APT User" (Figura 4).
   1. Tela para a esquerda controla horizontal motor de passo. Tela direita controles verticais motor de passo. Em cada tela, a aba "Graphical Control" permite um posicionamento manual e guia "Move Sequencer" permite a automação. Todas as unidades são mm.
5. Vá para a aba "Control Gráfico" em ambas as telas e pressione o botão "Home / Zero". Ambos os motores passo a passo tem um intervalo de 50 mm. Pressionando "Home / Zero" vai enviar dois motores de passo para a posição zero (superior e à direita a maioria das posições).
6. Prepare as amostras da placa de 24 poços para o carregamento por alguns meios de remoção de cada poço. Não mais do que 1 ml de meio deve ser deixado em cada poço para evitar transbordamento durante o carregamento. Certifique-se de que a mídia suficiente no poço para manter a amostra coberta.
   1. Note-se que a incubadora seja mantida em condições de baixa humidade para evitar falha do instrumento.
7. Lugar de 24 poços placa em biorreator e alinhar-se com cuidado com o rolo.
   1. A placa é presa ao bioreactor utilizando quatro localizadores cinemáticos ajustáveis. Para tornar mais fácil para alinhar o rolo, os dois localizadores esquerdo foram pré-posicionada. Aperte os dois localizadores de direito para que o prato é seguro. Certifique-se de alinhar a placa nivelada com a frente da base do biorreator.
   2. Na aba "Control Gráfico", uma posição específica motor de passo pode ser digitado manualmente, clicando na caixa de posição. Use esse recurso para reduzir lentamente o cilindro e movê-lo na horizontal para alinhar com a placa.
   3. Uma vez que a placa está perto de entrar em contato com as amostras, começar a trazer o rolo para baixo em incrementos muito lento (0.1 mm) até chegar à posição inicial pré-determinado (ver parte 6).
   4. Uma vez que a posição inicial é alcançado, vá em "Mover Sequencer" guia e carregar a seqüência de movimento desejado pressionando "Load". Em seguida, pressione "Executar" para começar. (Figura 5) Ver parte 7. Escrevendo um protocolo de tratamento.
   5. Quando terminar de carregar, levantar manualmente a exposição. Se todas as amostras estão presos à placa, cuidadosamente colocá-los de volta para o adequado bem com uma espátula estéril.
   6. Remover 24 poços placa de biorreator e substituir os meios de comunicação.
   7. Cuidadosamente retire o cilindro da célula de carga e, em seguida, desligue instrumentos.

   6. Calibrar Carregando Platen

   Para garantir que as estirpes adequadas sejam aplicadas às amostras, cada cilindro tem de ser cuidadosamente calibrada antes de se iniciar um ensaio.

   1. Siga os passos 5,1-5,8.
   2. Colocar manualmente horizontal motor de passo na posição de 25 mm.
   3. Cuidadosamente abaixe cilindro até que mal entra em contato com a base do biorreator. Célula de carga irá mostrar aumento de cargas neste momento. Tome nota da posição exata da vertical motor de passo (ser tão precisa quanto possível, todas as medições de deformação de compressão serão computados a partir deste valor).
   4. Registrar a posição. Este valor será usado para escrever um protocolo de tratamento baseado nas dimensões da amostra e estirpes desejadas.

   7. Escrevendo um protocolo de tratamento

   1. O bioreactor é capaz de aplicar tensão, tanto à compressão e ao cisalhamento, simultaneamente ou individualmente. Três parâmetros principais devem ser decididas: tara compressão tensão, amplitude de tensão dinâmica e carregamento de freqüência.
   2. Uma estirpe de tara é aplicada a fim de impedir a decolagem do cilindro a partir da amostra.
   3. Exemplo de amplitude de tensão de carga dinâmica e frecia são escolhidos.

   Neste estudo, definimos tensão de compressão e de cisalhamento, como se segue:
   

   Exemplo Biaxial Protocolo de Dosagem
   Espessura da amostra: 2,25 milímetros
   Estirpe da embalagem (compressão): 10% da espessura da amostra (0,225 milímetro)
   Amplitude de deformação dinâmica (compressão): 10% (+ / - 5% da espessura da amostra)
   Frequência (compressão): 1 Hz
   A amplitude dinâmica Strain (cisalhamento): 25% da espessura da amostra (0,5625 milímetro): Tensão de cisalhamento é
   aplicada à amostra pela placa móvel horizontalmente.
   Frequência (cisalhamento): 0,5 Hz
   Protocolo de tratamento típico é de 3 horas de carga por dia.

   Neste exemplo, a carga dinâmica e de corte é aplicada simultaneamente em vez de consecutivamente. Acreditamos que este padrão melhor MIMics as condições de carga no complexo do joelho humana.

   4. Uma vez que o protocolo de tratamento foi selecionado, um programa de seqüência movimento de compressão deve ser escrita.
   5. A seqüência de movimento é exatamente o que parece, de uma lista de posições que o motor de passo vai passar para a uma aceleração e velocidade máxima especificada.
   6. Calcule posições verticais desejadas de acordo com a dosagem de protocolo e cilindro valor de calibração (da parte 6).
   7. Exemplo cálculos para expositor 1 são apresentados a seguir:

   	Diferença em relação ao valor de calibração	Posição Vertical
   Platen valor de calibração (toques fundo do biorreator)	0 milímetros	29,7700 milímetros
   Platen faz contato com amostra (2,25 milímetros da amostra)	4,4140 milímetro	25,3560 milímetros
   Stchuva (5% de espessura)	4,3015 milímetro	25,4705 milímetros
   Strain (10% de espessura)	4,1890 milímetro	25,5810 milímetros
   Strain (15% Espessura)	4,0765 milímetro	25,6955 milímetros

   8. Uma vez que as posições são computados, experiência com valores de aceleração e velocidade máxima para obter a freqüência correta. O número de ciclos deve ser escolhido em conformidade (por exemplo, 10.800 ciclos de 3 horas a 1 Hz).
   9. Exemplo programação da sequência de movimento de compressão dinâmica (10% de compressão de tara, 10% de amplitude de tensão dinâmica, 1 Hz) (Figura 5)
   10. Programa seqüência movimento de cisalhamento dinâmico: O número de ciclos deve ser escolhido de acordo com a frequência e duração desejada (por exemplo, 5.400 ciclos de 3 horas a 0,5 Hz).
   11. Exemplo programação da sequência de movimento de cisalhamento dinâmico (10% de compressão da tara, 0,5625 milímetros (25% da espessura), amplitude de deformação de cisalhamento dinâmico, 0,5Hz) (Figura 5).

Resultados

O aparelho foi testado utilizando géis de agarose semeada com 20 milhões de células / ml e condrócitos cultivados na presença de uniaxial (compressão) ou biaxial (compressão e ao cisalhamento) a carga mecânica. Condrócitos porcinos primários foram isolados a partir da cartilagem articular de porcos de 2-4 meses de idade. Mm de diâmetro, e as amostras de espessura 1,5 milímetros 5 foram cultivados em 2 ml de meio de cultura condrogénica definida (glicose elevada DMEM, 1% de ITS + Premix, com 100 U / ml de pe...

Discussão

Nós projetamos um dispositivo de carga que é capaz de aplicar uniaxial ou biaxial tensão mecânica de tecido construções engenharia fabricados para transplante. O dispositivo pode ser usado como um biorreactor de cultivo in vitro de biocompósitos engenharia ou como um dispositivo de teste para descrever as características mecânicas do tecido nativo ou após outros tratamentos anteriores. Os sujeitos de dispositivos concebidos para construções de tecido biaxial de carregamento mecânico com grande prec...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM, High glucose, pyruvate	Invitrogen	11995
Agarose Type II	Sigma	CAS 39346-81-1
Penicillin Streptomycin Glutamine 100X	Invitrogen	10378-016
ITS+ Premix	BD Biosciences	354352
Pen Strep Glutamine	Invitrogen	10378-016
Amphotericin B	Invitrogen	041-95780
Ascorbic Acid	Sigma	A-2218
Nonessential Amino Acid Solution 100x	Sigma	M-7145
L-proline	Sigma	P-5607
Dexamethasone	Sigma	D-2915
Recombinant Human Transforming Growth Factor β1	R&D Systems	240-B-010
EQUIPMENT
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Single Channel Display	Honeywell	SC500
50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator	Thorlabs	LNR50SE/M
Two Channel Stepper Motor Controller	Thorlabs	BSC102
50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)	Thorlabs	DRV014
Adjustable Kinematic Locator (4)	Thorlabs	KL02
Precision Right Angle Plate	Thorlabs	AP90/M
Vertical Mounting Bracket	Thorlabs	LNR50P2/M
Solid Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB3030/M
Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates	BioRad	#1653312 and #1653310
Disposable Biopsy Punch, 5 mm	Miltex, Inc.	33-35
16 mm hollow punch	Neiko Tools
Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom	BD Biosciences	351147
Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens	McMaster-Carr	86735k19	Custom-machined