Дизайн двухосных механических биореактор загрузка для тканевой инженерии

Резюме

Мы разработали новую механической загрузки биореактора, которые могут применяться одноосные или двухосные механические напряжения хряща биокомпозитные до трансплантации в дефекта суставного хряща.

Аннотация

Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Пока устройство в основном функционирует в качестве биореактора, который имитирует родной механических напряжений, он также оснащен датчиком нагрузки для обеспечения обратной силы или механических испытаний конструкций. Устройство субъектов инженерии хряща конструкции для двухосных механических нагрузках с большой точностью нагрузочной дозы (амплитуда и частота) и достаточно компактен, чтобы поместиться внутри стандартной культуре ткани инкубатора. Он загружает образцов непосредственно в планшет для тканевых культур и разных размеров пластины совместимы с системой. Прибор был разработан с использованием компонентов, выпускаемых для высокоточного применения лазеров. Би-осевой нагрузки осуществляется двумя ортогональными этапов. Ступени имеют 50 мм Диапазон перемещения и приводятся в действие независимо от шаговых приводов двигателя, контролируемогозамкнутой шаговым двигателем водитель, который имеет микро-шаговый возможности, что позволяет шаг размерами менее 50 нм. Полисульфона загрузки валик соединен с двухосной подвижной платформе. Перевозкой этапы контролируются Тор-Labs Расширенные технологии позиционирования (APT) программного обеспечения. Драйвер шагового двигателя используется вместе с программным обеспечением для настройки параметров нагрузки от частоты и амплитуды и сдвиг и сжатие независимо и одновременно. Позиционная обратная связь обеспечивается линейными оптическими датчиками, которые имеют двунаправленный повторяемости 0,1 мкм и разрешением 20 нм, переводя к позиционной точностью менее 3 мкм по всей 50 мм хода. Эти датчики обеспечивают необходимую обратную связь по положению на электронику винчестера обеспечения подлинной нанопозиционирования возможностями. Для обеспечения обратной связи по усилию для обнаружения контакта и оценивать загрузку реакций, точность миниатюрного датчика нагрузки расположена между валиком загрузки и двигаешьсяг платформы. Датчик обладает высокой точностью 0,15% до 0,25% от полной шкалы.

Введение

Мы разработали загрузки биореактора, что позволяет наносить одноосной или двухосной механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Это устройство предназначено главным образом в качестве биореакторов для инженерии замены суставного хряща, она также может быть использована для других несущих тканей в организме человека. Наша мотивация в этом биореакторе дизайна связано с Drachman и Соколов ^1, который сделал семенные наблюдения аномальных формирование суставного хряща в парализованном куриных эмбрионов из-за отсутствия движения. Кроме того, физические упражнения необходимы для нормального развития мышц и костей. В соответствии с этой концепцией, многие исследовательские группы исследовали, как различные виды физических раздражителей во время выращивания в пробирке модулирует биохимические и механические свойства клеточного биоматериала биокомпозитами и ткани эксплантов ^2-7. Понятие функциональной тканевой инженериивключает в пробирке использованием механических стимулов для повышения функциональных свойств тканей, т.е. механические свойства, которые позволяют ткани выдерживать ожидаемые в естественных условиях стресса и напряжение ^8,9. Многочисленные исследования сообщают об использовании механической нагрузки в терминах сдвига и сжатия, чтобы стимулировать инженерных конструкций хряща суставных соединений. Mauck соавт. ¹⁰ показывают, что механическая нагрузка может вызвать только хондрогенезе мезенхимальных стволовых клеток даже в отсутствие факторов роста, которые считаются жизненно важными. Применение прерывистой механической нагрузки, такие как сжатие или сдвиг во время культивирования тканей было показано, модулирует хрящевой и костной формации, однако оптимальный дозиметрии нагрузки отличается от клеток и тканей свойствами ^11.

Наиболее важная функция суставного хряща является способность выдерживать сжатие и поперечных сил всустава, поэтому он должен иметь высокой прочностью на сжатие и модуля сдвига. Отсутствие функциональной механической прочности и физиологический ультраструктуры инженерии хрящей привело к распаду на нео-хрящ в естественных условиях и неспособность хряща замены стратегии в суставах. Хотя сжатия и сдвига были широко продемонстрированы для модуляции и улучшить механическую прочность биокомпозитов суставного хряща, комбинированный подход редко ^6,12-15. Wartella и Уэйн ¹⁶ разработан биореактора, которые применяются растяжение и сжатие производить замены мениска хрящ. Вальдман соавт. ¹⁵ разработаны устройства применить сжатия и сдвига в хондроциты культивировали в пористой подложке, полифосфат кальция. Бянь соавт. ¹⁷ продемонстрировано соответствие механических свойств хряща с родным в пробирке выращивания взрослых собачьих хондроцитов в гелях и применение двухосных мехветствующий квантовомеханический нагрузки (сжатие деформационных нагрузка на контакт и раздвижные нагрузки).

Двухосных механических биореактор загрузки был первоначально разработан Даниэль Чу в нашей лаборатории с общей целью, чтобы вызвать морфологических адаптаций в тканевой инженерии хряща строит приводит к повышению на сжатие и модуля сдвига, чем в настоящее время ^18. Мы считаем, что это исследование позволит значительно увеличить наши широком понимании того, как механотрансдукция можно модулировать спроектировать клинически значимых тканей.

протокол

1. Двухосные Дизайн биореактор загрузка

1. Биореактор использует два этапа производства Thor-лабораторий (Newton, MA) для высокоточного применения лазеров для применения одноосного или двухосного механических напряжений в инженерии тканей, с большой точностью из нагрузочной дозы (амплитуды и частоты), а также применение широкого разнообразия культуры тканей условиях от одного до 24-луночные планшеты (рис. 1).
2. Би-осевой нагрузки осуществляется в два этапа TravelMax (LNR50SE). Эти этапы установлены ортогонально в конфигурации XZ. Горизонтальная этап обеспечивает динамическое движение сдвига посредством качани вдоль оси Х. Ступени вертикального обеспечивает динамическое сжатие загрузкой колеблющегося вдоль Z-оси. Эти этапы имеют 50 мм диапазон перемещения и приводятся в движение независимо друг от шагового привода двигателя (DRV014), контролируемой замкнутой шаговым двигателем водитель (BSC102), который показывает микро-шаговый возможности, что позволяет шаг размерами менее50 нм.
3. Данное устройство крепится на жесткую 25 см х 30 см х 12,5 мм алюминиевой опорной плите, которая используется в качестве платформы для сборки деталей машин и для монтажа плит культуре ткани. Регулируемая кинематической остановки используется для блокировки тканевую культуру, на месте на опорной плите алюминия. Эти кинематической остановках есть прекрасные регулировочных винтов для обеспечения точного выравнивания, что, впрочем, не достижимые вручную. Модульная конструкция опорной плиты обеспечивают гибкое размещение этих кинематических остановки для размещения пластинами различных размеров и форм (чашки Петри по сравнению с мульти-луночных планшетах).
4. Специально обработанной полисульфоном загрузки валика соединен с двухосной платформе через движущийся с высокой чистотой обработки правую угловую скобку. Полисульфон материал был выбран из-за его биосовместимость, легкость обработки и простота стерилизации.
5. Перевозкой этапы контролируются Тор-Labs 'Advanced Technology позиционирования (APT) программного обеспечения. Драйвер шагового двигателя намиред в сочетании с программным обеспечением, что позволяет регулировать нагрузку параметры частоты и амплитуды и сдвиг и сжатие независимо и одновременно.
6. Позиционная обратная связь обеспечивается линейных оптических датчиков, которые прикреплены к каждой подвижной платформе и интегрированы с программным обеспечением. Кодер система имеет двунаправленный повторяемости 0,1 мкм и разрешением 20 нм, переводя к позиционной точностью менее 3 мкм по всей 50 мм хода. Эти датчики обеспечивают необходимую обратную связь по положению на электронику винчестера обеспечения подлинной нанопозиционирования возможности и непосредственно считывать значения абсолютной позиции.
7. Для обеспечения обратной связи по усилию необходимый для обнаружения контакта между валиком и образцы и оценивать загрузку реакций, точность миниатюрного датчика нагрузки (Honeywell Model 31) расположена между загрузкой валиком и подвижной платформе (рис. 2). Датчик обладает высокой точностью0,15% до 0,25% от полной шкалы. Дисплей (SC500) для тензодатчика может также обеспечить измерения нагрузки до 5 знаков после запятой. Кроме того, он имеет порт RS-232 для обеспечения сбора данных на компьютере.

2. Сотовые семенами Агароза Конструкции

1. Подготовка 4% агарозном: добавить 0,8 г агарозы до 20 мл DMEM (без добавок) в колбе на 50 мл, кипятить, а затем сохранить в 70 ° C духовку до использования.
2. Настройка громкости клеточной суспензии на двойное количество требуемой плотности посева клетки. Эту суспензию смешивали с равным объемом 4% вес / объем агарозном создать 2% агарозном геле в нужной плотности посева.
3. Поместите обе суспензии клеток и один 10 мл пипетки в инкубаторе.
4. Настройка системы заливки геля. Один 1,5 мм и один 0,75 мм промежуточной пластины должны быть объединены, чтобы создать 2,25 мм густой гель. Плиты прокладка размера могут быть использованы для создания различных гель толщины. Система заливки геля не является достаточно большой, чтобы держать эти пластины ToGetей, поэтому они должны быть надежно приклеенный к предотвращению утечки.
5. Следующим шагом будет быстро смешивать клеточной суспензии с предварительно приготовленной агарозы и пипетки в гель формы перед агароза затвердеет. Удалить жидкость агарозы из духовки и поместите стерильный термометр в нем. Агарозы должна остыть до 42-43 ° С перед смешиванием с клетками. Разминка клеточной суспензии до 37 ° C. После агарозном хиты 43 ° С, быстро пипетку вверх необходимую сумму и затем сразу же пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз перемешать. Затем сразу же пипетку всей смеси в гель формы.
6. Разрешить гель затвердевает в течение 10-15 мин, а затем осторожно наклоните его в горизонтальное положение.
7. Снимите верхнюю стеклянную пластину и удар дисков с биопсией удара. Диски можно забрать с небольшим стерильным шпателем. По нашему опыту, 9 мл геля была достаточно большой, чтобы сделать более ста 5 мм в диаметре дисков.

3. Культура Диски

1. Поместите один диск в каждую лунку 24-луночного не-культуры ткани обрабатывают пластины.
2. Добавить 2 мл сыворотки хондрогенная среднего дифференциации в каждую лунку.
3. Положите пластины в инкубатор (37 ° C, 5% СО _2).
4. Для изменения информации, заменить 1 мл на лунку каждые 2-3 дня.

4. Иммобилизация образцов для проведения мех загрузка

1. Подготовка 4% агарозы (не суспензии клеток не добавлено) и гель должен быть тоньше, чем образцы собой (для предотвращения помех во время загрузки). Рекомендуемая толщина 1,5-1,9 мм (для 2,25 мм образца).
2. Как только гель, удар диаметром 16 мм дисков для 24-луночных планшетах. В каждом диске, один удар отверстие диаметром 5 мм для образца для размещения дюйма При желании, удар еще на 5 мм отверстия на краю диска для пипетки для размещения во время изменения информации.
3. После агарозном скважин были сделаны, помещают в 24-луночный планшет, как показано на рисунке 3.
4. После агарозном Wлокти находятся в 24-луночный планшет, прессовой посадкой образцов в каждую лунку. Образец должен выступать из верхней части скважины агарозы.

5. Механическая нагрузка

1. Стерилизовать валиком (рис. 2).
2. Закрепите алюминиевой пластиной для загрузки ячейки. Безопасная загрузка валиком / Тензодатчики / алюминиевую пластину сборки на сцену.
3. Включите контроллер шагового двигателя (переключатель в спине).
4. Включите ПК и открытым "APT пользователя" программы (рис. 4).
   1. Левый экран Контроль горизонтального шагового двигателя. Правой части экрана Контроль вертикального шагового двигателя. В каждом экране, "Графический контроль" вкладка позволяет для ручного позиционирования и "Move Sequencer" вкладка позволяет автоматизировать. Все подразделения мм.
5. Перейдите в раздел "Графический управления" вкладку на обоих экранах и нажмите кнопку "Home / Zero". Оба шаговые двигатели имеют диапазон 50 мм. При нажатии кнопки "Главная / Zero" пошлет как шаговые двигатели в нулевое положение (верхний и правый большинство позиций).
6. Подгоэлектронной образцов в 24-луночный планшет для загрузки путем удаления некоторых сред из каждой лунки. Не более 1 мл среды, должны быть оставлены в каждой лунке, чтобы предотвратить переполнение во время загрузки. Будьте уверены, что достаточно средств массовой информации остается в хорошо держать Выборка охватывала.
   1. Обратите внимание, что инкубатор хранится в низкой влажности условия для предотвращения прибора из строя.
7. Место 24-луночный планшет в биореактор и тщательно выстраивать с валиком.
   1. Пластина прикреплена к биореакторе с помощью четырех регулируемых кинематической локаторы. Чтобы было легче выстроить валик, двух левых локаторы были заблаговременно размещены. Затяните два правом локаторы так, что пластина является безопасным. Убедитесь в том, чтобы выровнять пластину заподлицо с передней части биореактора базы.
   2. В "Графический управления" на вкладке, конкретные позиции шагового двигателя можно ввести вручную, нажав на положение коробки. Используйте эту возможность для медленно опустите валик и переместить его горизонтально, чтобы выстроиться в линию с пластиной.
   3. После экспонирования близка к вступления в контакт с образцами, начинают приносить валика вниз к очень медленным шагом (0,1 мм), пока не достигнете заданной стартовой позиции (см. часть 6).
   4. Как только исходное положение достигнуто, перейдите в раздел "Переместить Sequencer" на вкладке и загрузки нужного последовательность ходов, нажав кнопку "Load". Затем нажмите кнопку "Выполнить", чтобы начать. (Рис. 5) См. часть 7. Написание Дозирование протокола.
   5. При завершении загрузки вручную поднять валик. Если любые образцы приклеили к плите, осторожно положил их обратно в соответствующую лунку помощью стерильного шпателя.
   6. Удалите 24-луночный планшет из биореактора и заменить средства массовой информации.
   7. Осторожно снимите валик от нагрузки клетки, а затем выключите инструментов.

   6. Калибровка загрузка плиты

   Чтобы обеспечить надлежащую штаммов применяются для образцов, каждый валик должен быть тщательно откалиброваны перед началом эксперимента.

   1. Выполните шаги 5,1 до 5,8.
   2. Вручную выставлять горизонтальные шагового двигателя на 25 мм положение.
   3. Тщательно нижней плите, пока она едва не вступает в контакт с основанием в биореактор. Тензодатчика покажет повышенные нагрузки в этой точке. Обратите внимание на точное положение вертикального шагового двигателя (быть как можно более точно, так как все измерения деформации сжатия будет рассчитываться от этого значения).
   4. Отметьте положения. Это значение будет использоваться для дозирования написать протокол, основанный на размеры образца и желаемой штаммов.

   7. Написание протокола дозирования

   1. Биореактор позволяет наносить как на сжатие и деформацию сдвига, либо одновременно, либо по отдельности. Три основные параметры должны быть решено: Тара деформации сжатия, динамическая амплитуда напряжения, частоты и загрузки.
   2. Штамм тары применяется для того, чтобы предотвратить старта валика из образца.
   3. Пример динамической амплитуды напряжения и частоты загрузкичастоты выбираются.

   В этом исследовании мы определяем сжатии и деформации сдвига следующим образом:
   

   Пример двухосные протокола дозирования
   Толщина образца: 2,25 мм
   Тара деформации (сжатия): 10% от толщины образца (0,225 мм)
   Динамический амплитуда деформации (сжатия): 10% (+ / - 5% от толщины образца)
   Частота (сжатие): 1 Гц
   Динамический Амплитуда деформации (сдвиг): 25% от толщины образца (0,5625 мм): напряжение сдвига
   приложенное к образцу валиком, движущихся горизонтально.
   Частота (сдвиг): 0,5 Гц
   Типичные протокол дозирования составляет 3 часа загрузки в день.

   В этом примере динамический и поперечной нагрузки применяется одновременно, а не последовательно. Мы считаем, что эта модель лучше MIMICS сложных условиях нагрузка в человеческом колене.

   4. После дозировки был выбран протокол, последовательность сжатия ходу программа должна быть записана.
   5. Последовательность перемещения точно, что это звучит как, перечень должностей, что шаговый двигатель перейдет в заданное ускорение и максимальную скорость.
   6. Вычислить желаемый вертикальной позиции, основанные на протоколе дозирования и валика калибровки значение (из части 6).
   7. Пример вычисления для экспонирования 1 приведены ниже:

   	Отличие от калибровочного коэффициента	Вертикальное положение
   Плита калибровочного коэффициента (штрихи нижней части биореактора)	0 мм	29,7700 мм
   Плита вступает в контакт с образцом (2,25 мм образец)	4,4140 мм	25,3560 мм
   Улицадождь (5% толщина)	4,3015 мм	25,4705 мм
   Штамм (10% толщина)	4,1890 мм	25,5810 мм
   Штамм (15% толщина)	4,0765 мм	25,6955 мм

   8. Как только позиции вычисляются, эксперимент с ускорением и максимальные значения скорости, чтобы получить правильную частоту. Число циклов должны быть выбраны, соответственно (например, 10800 циклов в течение 3 ч при 1 Гц).
   9. Пример сжатия динамического последовательность ходов программы (10% тары сжатия, 10% динамичный амплитуды напряжения, 1 Гц) (рис. 5)
   10. Динамический сдвиг последовательности программ ход: Число циклов должно быть выбрано в соответствии с желаемой частотой и продолжительностью (например, 5400 циклов в течение 3 ч при 0,5 Гц).
   11. Пример динамического сдвига перемещения последовательности программ (10% тары сжатие, 0,5625 мм (25% толщины) динамический сдвиг амплитуды напряжения, 0,5Гц) (рис. 5).

Результаты

Устройство было испытано с использованием агарозного геля затравку 20 миллионов клеток / мл хондроцитов и культивировали в присутствии одноосной (сжатия) или двухосного (сжатия и сдвига) механической нагрузки. Первичный хондроцитам свиного были выделены из хрящевой ткани 2-4 месячного ?...

Обсуждение

Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерных конструкций изготовлены для трансплантации. Устройство может быть использовано в качестве биореакторов для выращивания в пробирке инженер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM, High glucose, pyruvate	Invitrogen	11995
Agarose Type II	Sigma	CAS 39346-81-1
Penicillin Streptomycin Glutamine 100X	Invitrogen	10378-016
ITS+ Premix	BD Biosciences	354352
Pen Strep Glutamine	Invitrogen	10378-016
Amphotericin B	Invitrogen	041-95780
Ascorbic Acid	Sigma	A-2218
Nonessential Amino Acid Solution 100x	Sigma	M-7145
L-proline	Sigma	P-5607
Dexamethasone	Sigma	D-2915
Recombinant Human Transforming Growth Factor β1	R&D Systems	240-B-010
EQUIPMENT
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Single Channel Display	Honeywell	SC500
50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator	Thorlabs	LNR50SE/M
Two Channel Stepper Motor Controller	Thorlabs	BSC102
50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)	Thorlabs	DRV014
Adjustable Kinematic Locator (4)	Thorlabs	KL02
Precision Right Angle Plate	Thorlabs	AP90/M
Vertical Mounting Bracket	Thorlabs	LNR50P2/M
Solid Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB3030/M
Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates	BioRad	#1653312 and #1653310
Disposable Biopsy Punch, 5 mm	Miltex, Inc.	33-35
16 mm hollow punch	Neiko Tools
Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom	BD Biosciences	351147
Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens	McMaster-Carr	86735k19	Custom-machined