Aorta ascendente constrição em ratos para a criação de sobrecarga de pressão Cardíaca Hipertrofia Modelo

Resumo

Nós descrevemos um procedimento passo a passo para a criação de sobrecarga de pressão e hipertrofia ventricular esquerda em ratos Wistar pela constrição da aorta ascendente com clipe metálico pequeno. Este modelo é amplamente utilizado para o estudo de alterações de remodelação durante a hipertrofia cardíaca e para identificar e avaliar estratégias para a regressão de tais mudanças.

Resumo

Crescente constrição aórtica é o modelo cirúrgico mais comum e bem sucedida para a criação de sobrecarga de pressão induzida hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Aqui, descrevemos um procedimento cirúrgico detalhado para a criação de sobrecarga de pressão e hipertrofia cardíaca em ratos por constrição da aorta ascendente com clipe metálico pequeno. Após a anestesia, a traquéia está entubado, inserindo uma cânula através de uma incisão no meio do caminho entre dois anéis cartilaginosos da traquéia. Em seguida, uma incisão na pele é feita ao nível do segundo espaço intercostal na parede torácica esquerda e as camadas musculares estão habilitados para localizar a porção ascendente da aorta. A aorta ascendente é restrito a 50-60% do seu diâmetro original através da aplicação de um pequeno clip de titânio porte. Após a constrição da aorta, os segundo e terceiro costelas são aproximadas com prolene. A cânula da traqueia é removido uma vez que a respiração espontânea foi restabelecida. O animal é deixado recuperar oN a almofada de aquecimento por redução gradual da anestesia. A intensidade da sobrecarga de pressão criada pela constrição da aorta ascendente é determinado com base no gradiente de pressão usando transtorácica bidimensional com Doppler-ecocardiografia. Em geral, este protocolo é útil para estudar os eventos de remodelação e propriedades contráteis do coração durante o início gradual e progressão da hipertrofia cardíaca compensada para coração fase fracasso.

Introdução

Modelos animais pequenos são as ferramentas mais preferidos para o estudo de alterações crónicas no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca e sua progressão para insuficiência cardíaca. Modelos de insuficiência cardíaca por métodos cirúrgicos foram originalmente desenvolvidos em ratos como esses animais são mais adequados para procedimentos cirúrgicos de peito aberto, ecocardiograma e avaliação dos parâmetros hemodinâmicos. Eles também fornecem amostras post mortem adequadas para o tecido, celular e estudos de nível molecular ^1. Constrição da aorta ascendente é um dos modelos cirúrgicos mais comuns e bem sucedidos para a criação de insuficiência cardíaca sobrecarga de pressão ^{2, 3.} Este modelo é bem adequado para estudar os eventos de remodelação celular celulares e sub e propriedades contráteis do coração durante a transição de hipertrofia para insuficiência cardíaca ^4.

Uma das principais vantagens deste modelo é o aparecimento gradual de sobrecarga de pressão sobre o coração ^{5, <}/ Sup> ^6. Este modelo é clinicamente relevante por causa de sua progressão lenta, mas constante de hipertrofia cardíaca compensada para a fase descompensada e, finalmente, para a fase de insuficiência cardíaca. A duração para a progressão da hipertrofia cardíaca para a insuficiência cardíaca e as alterações fisiológicas associadas são influenciados, principalmente, pelo grau de estenose produzido ^7. Constrição da aorta ascendente pode ser realizada de duas maneiras, usando suturas ou pela aplicação de clipes metálicos ^{8, 9.} A principal vantagem da utilização de um grampo metálico para a constrição da aorta é que os procedimentos cirúrgicos são menos complicados. Neste método, é preciso localizar a aorta ascendente supra valvular e insira o clipe ao redor da aorta para obter o nível desejado de constrição. Um afastador peito não é necessário este procedimento. A EAo por sutura requer manipulações mais cirúrgicos para colocar a agulha calibre ao lado da aorta ascendente e sutura em torno dele paraproduzir o nível desejado de constrição da aorta. A última técnica é mais demorada em comparação com a utilização de grampos metálicos para a constrição da aorta. O método descrito neste vídeo demonstra o procedimento cirúrgico para a constrição da aorta ascendente em ratos que permite a criação de pressão modelo de hipertrofia ventricular esquerda sobrecarregado.

Protocolo

Experimentos em animais foram realizados após a obtenção da aprovação do Comitê de Ética animal Institucional. Ratos Wistar foram alojados sob um escuro de 12 horas para ciclo de luz, temperatura ambiente constante (24 ± 2 ° C) com comida e água ad libitum (conforme as orientações CPCSEA).

1) Cuidados pré-operatório e anestesia

1. Mantenha rato (cerca de 200 g de peso corporal) sob antibiótico guarda-chuva de 24 horas antes da cirurgia, através da administração de amoxicilina por via oral (dose: 500 mg / L de água).
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (como tesouras, pinças, clipe aplicador, agulhas de sutura, e porta-agulha) em autoclave a 121 ° C por 15 min.
3. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do animal em cerca de 37 ° C para evitar uma rápida queda da frequência cardíaca.
4. Tome cuidado para evitar a desidratação do animal antes e durante a cirurgia.
5. Anestesiar o rato numa câmara de indução com 3% de isoflurano misturado com0,5-1,0 L / min 100% de oxigênio; manter a anestesia com 1,5% de isoflurano.
6. Verifique o reflexo pedal para confirmar anestesia bem sucedida.

2) Preparação do sítio cirúrgico

1. Manter o rato no topo de uma almofada de aquecimento de temperatura controlada, na posição supina.
2. Posicione uma faixa de borracha sobre os dentes da frente do rato para manter o animal na posição, mantendo a anestesia com um cone de nariz.
3. Retire a pele do decote e deixou região peito do rato (de preferência usando um barbeador elétrico).
4. Desinfectar local cirúrgico com uma solução de povidona-iodo e, em seguida, com álcool etílico a 70%.
5. Use um campo estéril para expor somente o sítio cirúrgico durante o procedimento cirúrgico.
   Nota: Como uma opção adicional para o cuidado com os animais, 0,25% bupivicaine ID (2,5 mg / kg) podem ser incorporados antes da incisão em cada local da incisão para anestesia local / analgesia.

3) Intubação Traqueal em Rat

1. Fazer uma pequena incisão na pele paralela à traqueia usando uma lâmina de bisturi estéril e separar cuidadosamente o tecido subjacente de modo a expor a traqueia.
2. Aplicar um empate de 4-0 fio de seda por baixo da traquéia e levantar delicadamente o laço para cima.
3. Fazer uma maneira incisão meio entre dois anéis de cartilagem e inserir a cânula traqueal na traqueia do rato.
4. Ligue a cânula traqueal a um ventilador de roedores para manter uma taxa respiratória de 50 ciclos / min, volume corrente de 1,70 ml e hora inspiração de 0,60 seg (para rato com 200 g de peso corporal).

4) A constrição da aorta ascendente

1. Depois de detectar a posição das nervuras com os dedos, fazer uma incisão da pele de cerca de 2 cm em relação à parede torácica esquerda entre as segunda e terceira costelas.
2. Separa-se a camada de musculatura intercostal por camada e fazer uma incisão de cerca de 1,5 cm de comprimento entre as segunda e terceira costelas. (Cuidado deve ser tomadan para evitar qualquer prejuízo para os pulmões ao fazer incisão entre as costelas)
3. Recolha as costelas e localizar a parte ascendente da aorta.
4. Coloque um pequeno grampo de titânio de tamanho em torno da aorta ascendente, com a ajuda de um aplicador, em que a constrição da aorta para 50-60% do diâmetro original.
5. Após a constrição da aorta, aproximar as segundas e terceiras nervuras com 3,0 prolene num padrão de sutura interrompida. Ao mesmo tempo, interromper o ventilador para cerca de 2-4 segundos, a fim de re-inflar os pulmões.
6. Appose as camadas musculares com prolene 3.0 e pele com 4,0 suturas de seda em um padrão de sutura interrompida. Suturas absorvíveis sintéticos não pode ser usado em vez de seda para sutura da pele.
7. Remova a cânula traqueal do rato respiração espontânea é uma vez restabelecida.
8. Feche a abertura traqueal com 3,0 prolene e da camada da pele com fio de seda 4.0.
9. Permitir que o animal se recuperar em tele aquecimento pad por redução gradual da anestesia e ventilador respiração assistida.
10. Nos animais do grupo controle pareados por idade, realizar traqueostomia e toracotomia sem constrição da aorta ascendente.

5) Cuidados pós-operatórios

1. Desinfetar área cirúrgica com solução de iodo-povidona.
2. Como analgesia pós-operatória, injectar tramadol intraperitonealmente (10 mg / kg de peso corporal / dia) durante 1 semana.
3. Injetar estéril salina normal intra-peritoneal, se os sinais de desidratação aparecer após a cirurgia (cerca de 1 ml).
4. Administrar por via oral de amoxicilina, misturado com a água de beber, durante sete dias (dosagem: 500 mg / L de água).
5. Remova qualquer fio de seda restantes da pele pós 10 dias de cirurgia sob anestesia inalatória.

6) A confirmação da constrição de sucesso da aorta ascendente

1. Realize uma trans-torácica bidimensional com Doppler-ecocardiografia para determinar a intensidade da sobrecarga de pressão produzida pela constrição da aorta ascendente.
2. Anestesiar os ratos uma semana após a cirurgia, como descrito anteriormente (passo 1.5)
3. Coloque o transdutor de ultra-som na posição esternal supra para gravar o gradiente de pressão através da parte estreitada da aorta ascendente.
   Nota: Os ratos com um gradiente de pressão de cerca de 60 mm de Hg no local de constrição aórtica irá desenvolver hipertrofia cardíaca grave por cerca de 8-10 semanas após a cirurgia.

Resultados

Nas nossas experiências que são capazes de atingir taxas de sobrevivência de mais de 80%. A eficácia da constrição aórtica foi confirmada pela realização de ecocardiograma Doppler. Os ratos (n = 6) com um gradiente de pressão de cerca de 60 mm de Hg no local da constrição da aorta foram observados durante 8 semanas e sacrificaram-se para análise do desenvolvimento de hipertrofia cardíaca (Figura 1). Após 8 semanas de avaliação ecocardiográfica pós-operatória revelou um aumento signif...

Discussão

Existem vários modelos cirúrgicos para a indução de sobrecarga de pressão, bem como a hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Em pequenos animais, Lorell e seus colegas desenvolveram o modelo que descrevemos aqui e eles relataram a ocorrência de hipertrofia cardíaca compensada oito semanas de bandas pós aórtica ^5. Alterações cardíacas gradualmente progredir para um estado descompensada e resultar em insuficiência cardíaca. A principal vantagem deste modelo é o aparecimento gradual de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wistar rats			Maintained at ARF, RGCB
Inhalation anaesthesia systems	VetEquip	AB19276
Rodent ventilator	CWE Inc	SAR- 830/AP
Rat tracheal cannula	CWE Inc	13-21032
Ultrasound system	Philips	HD7
Ultrasound transducer	Philips	S 12
Titanium clip (small)	Horizon	1204
Clip applicator	Weck	137081
Electric shaver	Vinverth	VBT0817
BP blade (size:11)	Surgeon	REF10111	Preparation of surgical site
Tramadol	Orchid health care	OCH043
Amoxycillin Hydrochloride	Ranbaxy
Isoflurane	Piramal health care	A23M10A
Syringes	BD	2015-09
4-0 braided silk	Diamond
3-0 prolene	Johnson&Johnson	NW018
Surgical tape	Romsons	SH 6301
Povidone iodine	Win Medicare
Temp. controlled heating pad	Flamingo	HC1003