Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Resumo

Os métodos descritos neste trabalho mostram como converter uma impressora jato de tinta comercial em um bioprinter com polimerização UV simultânea. A impressora é capaz de construir a estrutura do tecido 3D com células e biomateriais. O estudo demonstrou aqui construiu uma neocartilage 3D.

Resumo

Bioprinting, que está baseada na impressão a jato de tinta térmica, é um dos mais atraentes tecnologias facilitadoras no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com as células de controlo digitais, os suportes, e os factores de crescimento podem ser depositada precisamente a desejada bidimensional (2D) e os locais (3D) tridimensional rapidamente. Portanto, essa tecnologia é uma abordagem ideal para fabricar tecidos que imitam suas estruturas anatômicas nativas. Para o engenheiro da cartilagem com organização nativa zonal, composição da matriz extracelular (MEC), e as propriedades mecânicas, desenvolvemos uma plataforma bioprinting usando uma impressora jato de tinta comercial com fotopolimerização simultânea capaz de engenharia de tecidos de cartilagem 3D. Condrócitos humanos suspensas em poli (etileno glicol) Diacrilato (PEGDA) foram impressos para a construção neocartilage 3D via montagem camada por camada. As células foram fixadas impressos nas suas posições originais depositados, suportado pelo surroFINANCIAMENTO andaime em fotopolimerização simultânea. As propriedades mecânicas do tecido impresso foi semelhante à cartilagem nativa. Em comparação com a fabricação do tecido convencional, a qual requer a exposição de UV mais, a viabilidade das células impressos com fotopolimerização simultânea foi significativamente maior. Neocartilage impresso demonstraram excelente glicosaminoglicanos (GAG) e a produção de colagénio de tipo II, o que era consistente com a expressão do gene. Portanto, esta plataforma é ideal para distribuição célula precisa e arranjo para a engenharia de tecidos anatômico.

Introdução

Bioprinting baseada na impressão a jato de tinta térmica é uma das mais promissoras tecnologias de base no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com controle digital e alto rendimento cabeças fatores células, andaimes e crescimento podem ser precisamente depositado ao desejado bidimensional (2D) e posições (3D) tridimensionais rapidamente. Muitas aplicações de sucesso foram alcançados utilizando esta tecnologia em engenharia de tecidos e medicina regenerativa ^1-9. Neste trabalho, uma plataforma bioprinting foi criada com a Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 impressora jato de tinta térmica modificado e um sistema de fotopolimerização simultânea. Hidrogéis sintéticas formuladas a partir de poli (etileno glicol) (PEG) revelaram a capacidade de manter a viabilidade dos condrócitos e promover a produção de ECM condrogénica ^10,11. Além disso, a foto-reticulável PEG é altamente solúvel em água, de baixa viscosidade, o que o torna ideal para polímeros usados ​​em simultâneozação durante bioprinting 3D. Neste trabalho, os condrócitos humanos suspensas em poli (etileno) diacrilato glicol (PEGDA; MW 3.400) foram precisamente impresso para construir neocartilage camada por camada, com 1.400 dpi de resolução em 3D. Observou-se distribuição homogênea de células depositadas em um andaime 3D, o que gerou tecido cartilaginoso, com excelentes propriedades mecânicas e produção ECM reforçada. Por contraste, na fabricação manual, as células acumuladas na parte inferior do gel, em vez das suas posições inicialmente depositadas, devido à lenta polimerização andaime, o que levou a formação de cartilagem não homogénea após cultura ^2,3.

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Protocolo

1. Bioprinting Plataforma Estabelecimento

A modificação de impressora foi baseada em uma impressora jato de tinta térmica HP Deskjet 500 e HP 51626A cartucho de tinta preta.

1. Remova a tampa plástica superior da impressora e cuidadosamente retire o painel de controle a partir da tampa.
2. Retire os 3 conexões de cabo entre a parte superior da impressora e base. Remova a parte superior da impressora a partir da base.
3. Na parte superior da impressora, remova o pequeno plástico e acessórios de borracha (sistema de limpeza da cabeça de impressão) no lado direito sob o cartucho de tinta.
4. Retire a base da bandeja de papel, com molas.
5. Remova a placa metálica que cobre a barra de alimentação de papel de plástico.
6. Corte a barra de alimentação de papel de plástico na posição da roda de alimentação meio usando uma serra de mão ou outra ferramenta de corte.
7. Retire os 2 rodas de alimentação de papel expostos depois da etapa anterior. O plástico roda é muito difícil e um eletrônicoserra será útil.
8. Limpe a poeira e detritos usando lenços de ar e etanol enlatados.
9. Prenda a parte superior da impressora para a base.
10. UV esterilizar a impressora modificada para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo laminar antes de usar.
11. Corte a tampa de um cartucho de tinta HP 51626A usando um serrote ou outra ferramenta de corte.
12. Esvaziar a tinta e remover o filtro que cobre o poço reservatório inferior da cartilagem.
13. Lavar o cartucho cuidadosamente, com água corrente.
14. Ultrasonicate o cartucho no desionizada (DI) de água durante 10 minutos para remover a tinta residual.
15. Examinar o cartucho para certificar-se que toda a tinta foi removida. Lavar ou pulverizar o cartucho cuidadosamente com etanol a 70% para a esterilização, seguido por água DI esterilizado.
16. Configurar uma lâmpada ultravioleta de longo comprimento de onda sobre a plataforma de impressão para fornecer capacidade de fotopolimerização simultânea.
17. Medir a intensidade UV a uma plataforma da impressão utilizando uma luz UVmetros. Ajustar a distância entre a lâmpada de UV e a plataforma de impressora, de modo a intensidade para o objecto de impressão é entre 4-8 mW / ^cm2 (cerca de 25 cm de distância da lâmpada para a plataforma de impressora).

2. Bioink Preparação

1. Expansão monocamada de condrócitos
   1. Placa 5.000.000 condrócitos humanos em cada balão de cultura de tecidos T175 por expansão das células em Dulbeccos Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro de vitela e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). As células de cultura a 37 ° C com ar humidificado contendo 5% de CO _2. Altere o meio de cultura a cada 3 dias até que o frasco é de 85% de confluência. Use células da mesma passagem.
2. Dissolver PEGDA em PBS para uma concentração final de 10% w / v Adicionar fotoiniciador I-2959 a uma concentração final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar a solução.
3. Suspender condrócitos humanos cultivados na solução PEGDA preparado a 5 x 10 ⁶ células /ml.

3. Cartilagem de tecido de impressão

1. Ligue a impressora e laptop.
2. Criar um padrão de impressão de um círculo sólido com 4 mm de diâmetro, utilizando o Microsoft Word ou Adobe Photoshop.
   1. Ajuste a posição do padrão e verifique se ele será impresso exatamente no molde plástico.
   2. Calcule o número de cópias necessárias para atingir a espessura desejada de andaime. Para 4 mm de altura, 220 impressões são necessários para criar o andaime desejado.
3. Carregue o bioink para o cartucho de tinta. Cubra o cartucho com papel alumínio para proteger da exposição UV direto durante a impressão.
4. Enviar comando de impressão para a impressora. Puxe o sensor de papel quando a impressora começa a imprimir. O processo de impressão de todo deve ter menos do que 4 minutos para um andaime com 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura.
5. Transferência impresso neocartilage para uma placa de 24 cavidades e adicionar 1,5 ml de meio de cultura a cada poço.

4. Viabilidade celular de Avaliação em Scaffold 3D

1. Incubar a neocartilage impresso no VIVO / solução de trabalho MORTOS viabilidade / citotoxicidade em temperatura ambiente por 15 min no escuro.
2. Corte o hidrogel célula-laden ao meio e tirar imagens fluorescentes de área de corte.
3. Contagem vivo (verde) e as células mortas (vermelho) por um observador cego em cinco imagens tiradas aleatoriamente. Calcular a viabilidade celular através da divisão do número de células vivas pelo número total de células vivas e mortas.

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Resultados

A impressora jato de tinta térmica modificado foi capaz para celular e deposição de andaime no alto rendimento e excelente viabilidade celular. Combinando com fotopolimerização simultânea e biomateriais fotossensíveis, esta tecnologia é capaz de corrigir as células e outras substâncias impressos para os locais inicialmente depositados. De acordo com as propriedades da impressora a jacto de tinta térmica modificada, a resolução de impressão 2D foi 300 dpi com um único volume de gota de tinta de 130 pl. Exi...

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Discussão

Este sistema bioprinting 3D com capacidade fotopolimerização simultânea fornece uma resolução de impressão significativamente maior do que o melhor método anteriormente relatado de impressão em in situ de defeitos osteocondrais, utilizando uma seringa extrudido um hidrogel de alginato celular ^16. Resolução de impressão mais elevada é particularmente crítica para a engenharia de tecidos de cartilagem para restaurar a cartilagem organização zonal anatómica. Fotopolimerização simultân...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HP Deskjet 500 thermal inkjet printer	Hewlett-Packard	C2106a	Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor.
HP black ink cartridge	Hewlett-Packard	51626a
Ultraviolet lamp	UVP	B-100AP
UV light meter	General Tools	UV513AB
Zeiss LSM 510 laser scanning microscope	Carl Zeiss	LSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Mediatech	10-013
Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)	Invitrogen	10378-016
Accutase cell dissociation reagent	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-023
Live/Dead viability/cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224
Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)	Glycosan Biosystems	GS700
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	I-2959
Human articular chondrocytes	Lonza	CC-2550