Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Riepilogo

I metodi descritti in questo documento mostrano come convertire una stampante a getto d'inchiostro di commercio in un bioprinter con polimerizzazione UV simultanea. La stampante è in grado di costruire la struttura del tessuto 3D con cellule e biomateriali. Lo studio ha dimostrato qui costruito un neocartilage 3D.

Abstract

Bioprinting, che si basa sulla stampa a getto d'inchiostro termico, è una delle tecnologie abilitanti più interessanti nel campo dell'ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Con cellule di controllo digitale, ponteggi e fattori di crescita possono essere depositati esattamente alla desiderata bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) riprese rapidamente. Pertanto, questa tecnologia è un approccio ideale per fabbricare tessuti mimano loro strutture anatomiche native. Al fine di progettare la cartilagine con l'organizzazione nativo zonale, composizione della matrice extracellulare (ECM), e le proprietà meccaniche, abbiamo sviluppato una piattaforma bioprinting utilizzando una stampante a getto d'inchiostro commerciale con fotopolimerizzazione contemporanea capace per 3D cartilagine ingegneria dei tessuti. Condrociti umani sospesi in poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) sono stati stampati per la costruzione neocartilage 3D via assemblaggio layer-by-layer. Le cellule stampati sono stati fissati sui loro posizioni originali depositati, sostenuto dal ampliata daFINANZIAMENTO impalcatura in fotopolimerizzazione simultanea. Le proprietà meccaniche del tessuto stampato erano simili alla cartilagine nativa. Rispetto alla fabbricazione tessuto convenzionale, che richiede l'esposizione UV più, la vitalità delle cellule stampati con fotopolimerizzazione simultanea era significativamente maggiore. Neocartilage Stampato dimostrato eccellente glicosaminoglicani (GAG) e la produzione di collagene di tipo II, che era coerente con l'espressione genica. Pertanto, questa piattaforma è ideale per la distribuzione delle cellule accurate e arrangiamento per l'ingegneria tissutale anatomica.

Introduzione

Bioprinting basata sulla stampa a getto d'inchiostro termico è una delle tecnologie abilitanti più promettenti nel campo dell'ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Con controllo digitale e high throughput testine fattori cellule, scaffold, e crescita possono essere depositati esattamente alla desiderata bidimensionale (2D) e (3D) posizioni tridimensionali rapidamente. Molte applicazioni di successo sono stati realizzati con questa tecnologia in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa ^1-9. In questo lavoro, una piattaforma bioprinting è stato istituito con una Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 stampante a getto d'inchiostro termico modificato e un sistema di fotopolimerizzazione simultanea. Idrogel sintetici formulati da poli (glicole etilenico) (PEG), hanno dimostrato la capacità di mantenere la vitalità dei condrociti e promuovere la produzione ECM condrogenico ^10,11. Inoltre, photocrosslinkable PEG è altamente solubile in acqua a bassa viscosità, che lo rende ideale per polyme simultanearizzazione durante bioprinting 3D. In questo lavoro, condrociti umani sospesi in poli (etilene) diacrilato glicole (PEGDA; MW 3.400) sono stati stampati proprio per costruire neocartilage layer-by-layer con 1.400 dpi risoluzione 3D. È stata osservata una distribuzione omogenea di cellule depositate in un ponteggio 3D, che ha generato tessuto cartilagineo con eccellenti proprietà meccaniche e produzione ECM migliorata. Per contro, nella fabbricazione manuale cellule accumulate sul fondo del gel invece delle loro posizioni inizialmente depositati causa del rallentamento della polimerizzazione ponteggio, che ha portato alla formazione di cartilagine disomogenea dopo coltura ^2,3.

Protocollo

1. Bioprinting Platform Establishment

La modifica stampante è basata su una stampante a getto d'inchiostro termico HP Deskjet 500 e HP 51626a cartuccia di inchiostro nero.

1. Rimuovere il coperchio di plastica superiore della stampante e con attenzione rimuovere il pannello di controllo dal coperchio.
2. Staccare i 3 cavi di collegamento tra la parte superiore della stampante e base. Rimuovere la parte superiore della stampante dalla base.
3. Sulla parte superiore della stampante, rimuovere la piccola plastica e gomma accessori (sistema di pulizia delle testine di stampa) a destra sotto la cartuccia di inchiostro.
4. Rimuovere la base del vassoio carta con le molle.
5. Rimuovere la piastra metallica che copre la barra di alimentazione della carta plastica.
6. Tagliare la barra di alimentazione della carta plastica alla posizione della ruota di alimentazione centrale con una sega a mano o altro utensile da taglio.
7. Rimuovere le 2 ruote alimentazione della carta esposti dopo il passaggio precedente. La plastica ruota è molto duro e un sistema elettronicosega sarà utile.
8. Pulire la polvere e detriti utilizzando salviette di aria e di etanolo in scatola.
9. Fissare la parte superiore della stampante alla base.
10. UV sterilizzare la stampante modificata per almeno 2 ore in una cappa a flusso laminare prima dell'uso.
11. Tagliare il tappo di una cartuccia d'inchiostro HP 51626a con una sega a mano o altro utensile da taglio.
12. Svuotare l'inchiostro e rimuovere il filtro che copre il serbatoio ben inferiore della cartilagine.
13. Sciacquare la cartuccia accuratamente con acqua corrente.
14. Ultrasonicate la cartuccia in deionizzata (DI) per 10 minuti per rimuovere l'inchiostro residuo.
15. Esaminare la cartuccia per assicurarsi che tutto l'inchiostro è stato rimosso. Risciacquare o spruzzare la cartuccia accuratamente con etanolo al 70% per la sterilizzazione, seguita da acqua deionizzata sterile.
16. Impostare una lampada a raggi ultravioletti lunghezza d'onda sulla piattaforma di stampa per fornire capacità di fotopolimerizzazione simultanea.
17. Misurare l'intensità UV alla piattaforma di stampa con una luce UVmeter. Regolare la distanza tra la lampada UV e la piattaforma stampante così l'intensità verso il soggetto di stampa è tra 4-8 mW / cm ² (circa 25 cm dalla lampada alla piattaforma stampante).

2. Bioink Preparazione

1. Espansione Monolayer condrociti
   1. Piatto 5 milioni di condrociti umani in ogni T175 tessuto pallone di coltura per l'espansione di cellule in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) supplementato con siero di vitello del 10% e 1x penicillina-streptomicina-glutammina (PSG). Cellule di coltura a 37 ° C con aria umidificata contenente il 5% di CO _2. Cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni fino a quando il pallone è 85% di confluenza. Utilizzare le cellule dello stesso brano.
2. Sciogliere PEGDA in PBS ad una concentrazione finale del 10% w / v Aggiungere fotoiniziatore I-2959 ad una concentrazione finale di 0,05% w / v Filtrare sterilizzare la soluzione.
3. Sospendere coltivate condrociti umani nella soluzione PEGDA preparata a 5 x 10 ⁶ cellule /ml.

3. Cartilagine Tessuto di stampa

1. Accendere la stampante e il computer portatile.
2. Creare un modello di stampa di un solido cerchio con 4 mm di diametro utilizzando Microsoft Word o Adobe Photoshop.
   1. Regolare la posizione del modello e assicurarsi che stamperà esattamente nello stampo di plastica.
   2. Calcolare il numero di stampe necessari per raggiungere lo spessore desiderato del ponteggio. Per 4 mm di altezza, 220 stampe sono necessari per creare l'impalcatura desiderato.
3. Caricare il bioink nella cartuccia di inchiostro. Coprire la cartuccia con un foglio di alluminio per proteggerlo dall'esposizione diretta ai raggi UV durante la stampa.
4. Inviare il comando di stampa alla stampante. Estrarre il sensore della carta quando la stampante inizia a stampare. L'intero processo di stampa dovrebbe richiedere meno di 4 minuti per un ponteggio di 4 mm di diametro e 4 mm.
5. Trasferimento stampato neocartilage ad una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 1,5 ml di mezzo di coltura di ogni pozzetto.

4. Cella di valutazione Viabilità in 3D impalcatura

1. Incubare la neocartilage stampata in soluzione LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità lavorare a temperatura ambiente per 15 minuti nel buio.
2. Tagliare l'idrogel cellulare carico a metà e prendere le immagini fluorescenti della zona di taglio.
3. Conte dal vivo (verde) e (rosso) le cellule morte da un osservatore cieco a cinque immagini scattate in modo casuale. Calcolo della vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vive per il numero totale di cellule vive e morte.

Risultati

La stampante a getto d'inchiostro termico modificato era capace di cellule e scaffold deposizione ad alta velocità e la vitalità delle cellule eccellente. Unendo con fotopolimerizzazione simultanea e biomateriali fotosensibili, questa tecnologia è in grado di fissare le cellule e altre sostanze stampati nelle posizioni inizialmente depositati. Secondo le proprietà della stampante a getto d'inchiostro termica modificato, la risoluzione di stampa 2D era 300 dpi con un unico volume goccia d'inchiostro di 13...

Discussione

Questo sistema bioprinting 3D con capacità di fotopolimerizzazione simultaneo offre una risoluzione di stampa significativamente maggiore rispetto il miglior metodo precedentemente riportato nella stampa situ dei difetti osteocondrali con siringa estruso un idrogel alginato cellulare ^16. Maggiore risoluzione di stampa è particolarmente critico per l'ingegneria tissutale della cartilagine per ripristinare il anatomico cartilagine organizzazione zonale. Fotopolimerizzazione simultanea du...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HP Deskjet 500 thermal inkjet printer	Hewlett-Packard	C2106a	Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor.
HP black ink cartridge	Hewlett-Packard	51626a
Ultraviolet lamp	UVP	B-100AP
UV light meter	General Tools	UV513AB
Zeiss LSM 510 laser scanning microscope	Carl Zeiss	LSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Mediatech	10-013
Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)	Invitrogen	10378-016
Accutase cell dissociation reagent	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-023
Live/Dead viability/cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224
Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)	Glycosan Biosystems	GS700
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	I-2959
Human articular chondrocytes	Lonza	CC-2550