Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Resumo

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Resumo

Infarto agudo do miocárdio ou crônica (MI) são eventos cardiovasculares, resultando em altas taxas de morbidade e mortalidade. Estabelecer os mecanismos patológicos no trabalho durante MI e desenvolvimento de abordagens terapêuticas eficazes requer metodologia para simular reproducibly a incidência clínica e refletir as alterações fisiopatológicas associadas ao MI. Aqui, nós descrevemos um método cirúrgico para induzir MI em modelos de rato que pode ser utilizado para a curto prazo de isquemia-reperfusão (I / R), bem como lesões de ligação permanente. A principal vantagem deste método é o de facilitar a localização da artéria descendente anterior esquerda (LAD) para permitir a ligação exacta desta artéria para induzir isquemia no ventrículo esquerdo do coração do rato. Posicionamento preciso da ligadura sobre o LAD aumenta a reprodutibilidade do tamanho do infarto e, portanto, produz resultados mais confiáveis. Maior precisão na colocação da ligadura vai melhorar as abordagens cirúrgicas padrão para simular MI em camundongos, thus reduzir o número de animais experimentais necessárias para estudos estatisticamente relevantes e melhorar a nossa compreensão dos mecanismos que produzem a disfunção cardíaca após IAM. Este modelo do rato de MI também é útil para o teste pré-clínico de tratamentos que visam dano miocárdico seguinte MI.

Introdução

Os modelos animais de infarto do miocárdio (IM) são importantes na investigação da fisiopatologia complexo de doença isquêmica do coração ^1. Isquemia-reperfusão (I / R) lesão é um dos principais contribuintes do dano miocárdico gerado durante MI. A lesão de isquemia inicial produzida por oclusão da circulação coronária pode ser minimizada em pacientes MI pelo uso de angioplastia para restabelecer a perfusão de uma forma atempada. Embora esta intervenção reduziu muito o número de mortes devido a infarto agudo do miocárdio, a restauração do fluxo sanguíneo para a área a presença de isquemia em I / R lesão que leva à morte dos cardiomiócitos. Esta perda de massa do miocárdio contribui para a diminuição do débito cardíaco e da progressão para insuficiência cardíaca. Assim, o estudo dos mecanismos que resultam na morte de cardiomiócitos a partir de I / R lesão é uma importante linha de investigação na pesquisa cardiovascular. Ligadura coronária cirúrgica é uma técnica experimental útil para induzir modelos de MI em vários tipos de animais, including o rato, cão e porco. Publicações em laboratórios diferentes introduziram vários métodos no estabelecimento do modelo de coração de ratos I / R lesão ^2,3. A fim de ter uma visão sobre esses mecanismos, devemos ter acesso a modelos animais de confiança que podem reproduzir vários aspectos do MI patologia. O desenvolvimento de tais modelos é também essencial para testar abordagens terapêuticas para o tratamento de infarto do miocárdio e lesão associada I / R.

A maioria das técnicas cirúrgicas disponíveis atualmente para simular MI em animais experimentais envolvem dissecção cirúrgica na cavidade torácica para expor a artéria anterior esquerda (LAD) descendente, que depois é obstruído por uma ligadura por período definido no tempo para produzir o evento isquêmico. Em seguida que a ligadura pode ser removida para permitir a reper fusão da área isquémica e geração de I / R lesão. Uma grande limitação destas abordagens em que a posição da literatura sobre a LAD não é sempre reproduzido com precisão, o quepodem dar origem a variações na gravidade da MI induzida por esta abordagem. A maioria das técnicas disponíveis apenas descrito geralmente a localização aproximada da ADA na parede anterior do coração. Como a ramificação ea direcção da ADA pode variar em animais individuais no local, nem sempre é fixo e pode ser facilmente confundida ^4,5, conduzindo a potenciais complicações durante a cirurgia ^6. As consequências da colocação imprópria da ligadura pode ser executado a partir de variabilidade no tamanho do enfarte induzido no interior do ventrículo esquerdo para comprometer completamente a especificidade do modelo. Aqui apresentamos um método modificado para miocárdio I / R e ligadura permanente em ratos que permite uma maior precisão da colocação da ligadura sobre o LAD. Através da aplicação de métodos específicos para a incisão inicial e esvaziamento interno, bem como a utilização de manipulações para levantar as aurículas para permitir uma melhor apreciação da LAD e o local em que ele emerge da aorta. Estabelecendo aposição sobre a LAD e a sua origem proporciona a oportunidade para ligar o LAD de uma forma reprodutível. Este modelo de enfarte I / R e a ligação permanente, não só diminui a variação no tamanho do enfarte após a cirurgia, mas também pode diminuir a incidência de sangramento excessivo durante a operação.

Protocolo

Este protocolo animal foi aprovado e está em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) no The Ohio State University. Todas as políticas desenvolvidas pelo IACUC locais estão em conformidade com o Guia de Experimentação Animal desenvolvido pela Office of Laboratory Animal Welfare no National Institutes of Health.

1. Anestesia e entubação endotraqueal

1. Autoclave todos os instrumentos e material cirúrgico antes do uso. Usar luvas estéreis de uso único, cirúrgicos em todo o processo. Manter um ambiente estéril durante todo o procedimento. O uso de um campo estéril é sugerido, mas não mostrado no vídeo para permitir a melhor visualização dos pontos anatômicos sobre o mouse.
2. Colocar cada ratinho individualmente numa câmara de indução e proporcionar anestesia com 5% de isoflurano e oxigénio com uma taxa de fluxo de 0,4 L / min até que a perda do reflexo de endireitamento e, em seguida, manter the animais com 2% de isoflurano em 100% de oxigénio, com um fluxo de 0,4 L / min por meio de um tubo de cone de protecção ligada ao aparelho de anestesia até que o tubo traqueal está no lugar. A máquina de anestesia de isoflurano utilizada deve ser adequadamente ventilada e equipado com filtros de carvão, para minimizar a exposição do cirurgião aos fumos de isoflurano durante o procedimento. O cone de protecção é notado, mas não mostrado no vídeo para permitir a visualização das manipulações entubar o rato.
3. Raspar o peito do animal, com uma máquina de cortar cabelo animal num local diferente do que a plataforma de cirurgia para evitar a contaminação do local da cirurgia.
4. Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre a plataforma cirurgia para intubação subseqüente. A plataforma simples de espuma de poliestireno pequeno pode servir como uma plataforma operacional. Cobrir a plataforma com uma cortina de pré-esterilizado para proporcionar uma superfície estéril. Colocar uma almofada de aquecimento entre a plataforma e cortina para manter a temperatura corporal dos ratinhos, em Surgicaprocedimentos l.
5. Anexar um comprimento de fio de sutura de seda 2-0 de pelo menos 10 cm, para a plataforma com fita adesiva e, em seguida, o laço de sutura em torno dos incisivos superiores frontais. Posicionar o cone em estreita proximidade (2-3 cm) para a borda da plataforma sobre o nariz do rato. Puxe o tenso do mouse e prendê-lo para a plataforma pela cauda com um pedaço de fita.
6. Fixar as pernas para os lados do corpo, com fios de fita. É importante que os membros anteriores não são sobrecarregados como isso pode comprometer a respiração.
7. Prepare os locais cirúrgicos raspadas com Betadine e álcool antes de as incisões no pescoço e no peito são feitas.
8. Coloque a plataforma com a cabeça do rato apontando na direcção do operador. Corte um 0,5 centímetros mediana incisão na pele do colo do útero. Separa-se os lóbulos da glândula da tiróide em sua istmo para expor o músculo da traqueia sternohyoideus onde pode ser vista sob o músculo.
9. Retirar a agulha interior de um trocarte de calibre 18 para que ele possa ser utilizado como um intubtubo de ração. A ponta da agulha pode servir como um suporte e um 1 cm de tubo exterior pode servir como o tubo traqueal.
10. Segure a língua do rato com uma pinça curva em uma mão e mova-o ligeiramente para cima. Ver a traquéia através da incisão na pele do colo do útero. Use a outra mão para inserir gentilmente o tubo de intubação até que o tubo é visto dentro da traquéia.
11. Assim que o tubo está na traqueia, mover as pinças curvas em sentido contrário o tubo e remover rapidamente o interior da agulha. Se o tubo não pode ser inserido na traqueia, o tubo deve ser puxada para fora para evitar a produção de problemas respiratórios. É importante assinalar a ponta do tubo para cima quando se está próximo da garganta, a fim de evitar a inserção do tubo do esófago, em vez de a traqueia.

2. Ventilação e Fixação

1. Providenciar ventilação artificial com um respirador animais ventilação 2% de isoflurano em oxigênio com uma vazão de 0,4 L / min. Use um Y-sha modificadoconector pe para ligar o tubo de intubação com o ventilador. O correto posicionamento do tubo traqueal pode ser confirmado por julgar a expansão torácica simétrica.
2. Defina o volume corrente a 260 taxa mL / curso e ventilação é de 130 golpes por minuto, que podem ser ajustados para o peso do corpo de um rato especial, se necessário.
3. Retire a fita na cauda e vire suavemente o mouse para colocá-lo em posição de decúbito lateral direito para a cirurgia subseqüente. Use fita adesiva para prender a cauda e as pernas para a plataforma de novo.
4. Inserir a sonda rectal para monitorizar a temperatura do corpo e ajustar a almofada de aquecimento para manter a temperatura de cerca de 37 º C.
5. Fixe a sonda para a plataforma usando fita. Injetar bupivacaína por via subcutânea no local da incisão para entorpecer a área antes da incisão é feita.

3. Toracotomia

1. Faça uma incisão oblíqua que cerca de 1 cm de comprimento em um site 2 mm da esquerdaesternal na direcção de onde a perna dianteira esquerda encontra o corpo (cerca de 1-2 mm abaixo do local onde a perna e corpo aderir). A veia torácica superficial está perto deste site e da incisão deve ser feita de modo que a extremidade lateral da incisão vai até, mas não cortados em, a veia.
2. Cortar embora o músculo torácica para expor as nervuras por baixo. Durante esta etapa de evitar ferimentos acidentais do recipiente. Se o sangramento não ocorrer, usar aplicadores de algodão para evitar qualquer sangramento antes de prosseguir para a próxima etapa ^7.
3. Visualize as costelas e inflar pulmão através da parede torácica fina e semitransparente. Abrir a cavidade torácica utilizando uma tesoura cirúrgica de fazer uma incisão de 6-8 mm no terceiro espaço intercostal. Esta incisão deve ser um mínimo de 2 mm da borda esternal, onde a artéria torácica interna se encontra. Danos para a artéria irá produzir sangramento pesado que é difícil de controlar.
4. Insira os retratores peito caseiras pré-esterilizados into da incisão e puxe de volta para abrir a incisão de modo que é de cerca de 8-10 mm, tendo o cuidado de evitar o pulmão de largura. Os afastadores deve ser ligado à plataforma cirúrgica com pinos.
5. Neste ponto, o coração deve ser visível, no entanto, o pulmão ainda cobrir uma parte do coração. Pegue o pericárdio delicadamente com uma pinça curva, puxe-o à parte, e deslize o tecido atrás dos retratores. Durante essa manipulação do pulmão vai levantar para cima e longe do coração.

4. Posicionamento LAD

1. Localize o LAD na superfície do coração através de um microscópio de dissecção. A LAD é executado para baixo a meio da parede do coração a partir de perto da ponta do coração para baixo através do ventrículo esquerdo. O LAD aparece vermelho brilhante e será pulsando fortemente. A veia aqui às vezes é confundido com o LAD, no entanto iluminação adequada pode ajudar a distinguir os dois navios. Se a iluminação é muito clara, pode ser difícil para apreciar a cordiferenças entre os vasos.
2. Utilizado um fragmento de bola de algodão estéril com um diâmetro de cerca de 1-2 mm para se preparar o LAD para ligação. Coloque o algodão entre o átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, que vai levantar o átrio esquerdo e ajudar a expor o LAD e esclarecer a sua posição. Se o LAD não pode ser localizado, o fragmento pode ser deslizado em mais de modo que o átrio esquerdo é levantada ainda maior para revelar a aorta onde o LAD origina.

5. LAD Ligadura

1. O posicionamento ideal para a ligadura é de aproximadamente 2 mm mais baixa do que a ponta da aurícula esquerda. O tronco pulmonar pode ser utilizada como um marcador para identificar a aurícula esquerda. Em alternativa, a posição de ligação pode ser visualizado como um ponto de 1-2 mm de distância da ramificação da circunflexa esquerda. Use uma pinça curva para aplicar uma pressão suave em um local imediatamente abaixo do ponto de ligação pretendido. Isto tornará mais fácil de ver a artéria e também vai ajudar a manter o coração no lugare simplificar amarrar a ligadura. Não aplique pressão com a pinça de mais de 5 segundos de cada vez e evitar a compressão do coração, que podem alterar de bombeamento.
2. Use uma agulha cônico para passar um fio de seda 6-0 debaixo da LAD, observando com um microscópio de dissecação. Insira a agulha sob a artéria com precisão como a agulha vai entrar na câmara do ventrículo esquerdo se colocado muito profundamente ou danificar o LAD se a agulha é muito raso. Se o rapaz é ferido retire a agulha e sutura do LAD para controlar o sangramento, no entanto, se o sangramento não pode ser controlado, é preferível sacrificar o animal.
3. Faça um nó duplo solto com a sutura, deixando um laço de diâmetro 2-3 mm através do qual um 2-3 mm de comprimento pedaço de tubo PE-10 é colocada ^8.
4. Aperte o laço ao redor da artéria e tubulação em seguida, prenda o laço amarrando um slipknot complementares, tendo cuidado para não danificar a parede do ventrículo. Para ligadura permanente, amarre diretamente o LAD com umnó ^9. Confirme a oclusão da LAD, marcando para a aparência de uma cor mais pálida na parede anterior do VE que deve aparecer dentro de poucos segundos após a ligação.
5. Retire o afastador e fechar a ferida temporariamente por beliscar a pele, juntamente com uma braçadeira bulldog. O período de tempo que é mantida a isquemia depende do desenho experimental, mas é frequentemente 20, 30, 45 ou 60 min. O rato permanece sobre o ventilador para a duração da oclusão da artéria LAD.

6. Reperfusão

1. Após o período de isquemia remover o clipe de bulldog e inserir os afastadores de peito para expor a ligadura. Desatar o nó e remover o tubo PE-10. Confirme reperfusão, observando um retorno da cor-de-rosa-vermelho da parede anterior do VE após 15-20 segundos.
2. Deixar a sutura no lugar se 2% de cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) e coloração com azul será realizada após a reperfusão. Se a coloração não é necessário, a sutura pode be removido.
3. O tempo de reperfusão dependerá do desenho experimental, geralmente abrangendo desde 1 h a 24 h.

7. Chest Encerramento e Cuidados Pós-Operatórios

1. Feche a cavidade torácica por costura fechou a incisão no espaço intercostal 3 ^º com 4-0 fio de seda. É importante que os pulmões são claras da sutura e não ficam presas como o 3 ^º e ⁴ º nervuras são suturadas juntas. Enquanto amarrar os nós de sutura é útil para aplicar uma leve pressão no peito com o suporte da agulha para minimizar qualquer sala de ar que pode ser preso na cavidade torácica.
2. Feche todas as camadas de músculos, com sutura contínua, usando seda 4-0. Use suturas de nylon para fechar a pele com uma sutura contínua. Alternativamente, a pele pode ser fechada com sutura interrompida.
3. Quando a sutura é cessar completo o fluxo de isoflurano, enquanto oxigênio continua a fluir. Uma vez que o mouse se move seus bigodes ou cauda dele, should começar a fazer tentativas de respirar espontaneamente. Retire o mouse do ventilador com o tubo de intubação ainda manteve na traquéia.
4. Observar o animal com cuidado até que o mouse retoma um padrão de respiração normal e, em seguida, extubação o mouse. O tubo deve ser removida lentamente, para evitar aspiração de secreções da cavidade oral.
5. Confirme o mouse não está em nenhum desconforto respiratório por observá-lo por mais um 3-5 min antes de a voltar a uma gaiola. Se os sinais de desidratação são observados após a cirurgia, fornecer-se a 0,5 ml de solução salina estéril, por injecção intraperitoneal.
6. Para analgesia pós-operatória, administrar um analgésico opióide (buprenorfina, 0,1 mg / kg) por via subcutânea (SC) antes de o animal é ambulatorial e, em seguida, fornecer uma dose adicional a cada 4-6 horas para o próximo 24 horas. Verifique os sinais de animais de perigo no 12 horas após a cirurgia. Simulação de infarto do miocárdio com cirurgia sobrevivência requer avaliação da dor e do sofrimento, após a recuperação da surgery. A atual melhor prática aceita é proporcionar analgesia nas primeiras 24 horas após um procedimento invasivo com doses adicionais dadas como garantidas devido à perda de peso ou sinais de dor. Para a ligação permanente, o peso corporal deve ser monitorado diariamente para ajudar a avaliar a recuperação do animal.
7. Ibuprofeno (Motrin), um fármaco anti-inflamatório não esteróide (AINE) com anti-inflamatórios, analgésicos e antipirética, ou outros AINEs, pode ser fornecido na água de beber do animal, tal como uma solução de 0,2 mg / mL durante dois dias antes da cirurgia e até a 7 dias após a cirurgia em conjunto com a buprenorfina para gerenciar qualquer dor / sofrimento adicional.

8. Medição de Infarto do Miocárdio Tamanho

1. Anestesiar e entubar o mouse no final do tempo de reperfusão desejado. Corte a pele do tórax na linha média para o xifóide. Abra o abdómen e o diafragma abaixo da caixa torácica e de ambos os lados da linha hemiclaviculares.
2. Expor o coração e, em seguida, re-ligadura LAD no mesmo local. Canular aorta assim 10% Phthalo azul pode ser lentamente injetada diretamente na aorta para manchar o coração para a delimitação da zona isquêmica da zona de não-isquêmica ^10.
3. Rapidamente extirpar do coração e lave-o em KCl 30 (solução de cloreto de potássio) para cessar o bater do coração e permitir o corte mais consistente. Congele o coração durante pelo menos 4 horas a -20 ° C e cortou o coração em fatias de 1 mm, utilizando uma matriz de coração dispositivo ¹¹ de corte.
4. Incubar fatias do coração com 2% de TTC a 37 ° C durante 40 min. A área de infarto é demarcada como área branca ao tecido viável mancha vermelha.
5. Corrigir as fatias manchadas com formol a 10% durante a noite, o que ajudará a aumentar o contraste entre a área de infarto e do tecido normal. Fotografar as fatias e calcular a área em risco (AAR), a zona de não-isquêmica e da área de infarto utilizando o software ImageJ.

9. Medição dos Níveis de enzima cardíaca

Medir a troponina I (TIc) os níveis no soro dos ratinhos por obtenção de sangue da veia porta e, em seguida, isolar o soro por centrifugação. Os níveis séricos de TIc em seguida, são determinadas com um ensaio rápido quantitativa TIc ^12.

Resultados

Após 24 horas de reperfusão, a análise do tamanho do infarto e da área em risco (AAR), por phthalo corante azul e cloreto de trifenil tetrazólio (TTC), ligadura da LAD pode ser confirmada pela observação de branqueamento de tecido do miocárdio distal à sutura bem como disfunção da parede anterior. A reperfusão pode ser verificado pelo retorno da cor vermelha para o tecido do miocárdio e a demonstração de alguma recuperação do anterior movimento da parede.

As áreas de infart...

Discussão

Rato modelos de isquemia-reperfusão do miocárdio são um método eficaz para a pesquisa cardiovascular para simular doença cardíaca aguda ou crônica clínica ^13,14. Esforço significativo tem sido aplicada para desenvolver e refinar abordagens cirúrgicas que produzem eventos isquêmicos e danos de reperfusão nos corações de vários tipos de animais diferentes. Embora existam vantagens particulares para o uso de sistemas diferentes animais, o rato tem características que levaram a extensa interesse e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corp	PS-RT
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix	Zivic Miller	HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75)	Fine Science Tools	6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1163-01
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
Betadine Soultion	Purdue Pharma	25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA	Kamiya Biomedical Company	KT-58997
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Round Handled Needle Holders	Fine Science Tools	12075-12
Omano Trinocular Stereoscope	Microscope.com	OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm	Microscope.com	V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y	Kent Scientific Corp	RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals	VetEquip, Inc	901807
4-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N