Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Resumo

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Resumo

AVC é a terceira causa mais comum de morte e uma das principais causas de incapacidade em adultos adquirida em países desenvolvidos. Opções terapêuticas muito limitados estão disponíveis para uma pequena proporção de pacientes com AVC na fase aguda. A pesquisa atual está intensamente em busca de novas estratégias terapêuticas e está cada vez mais focados na fase sub-aguda e crônica após o AVC porque mais pacientes possam ser elegíveis para intervenções terapêuticas em uma janela de tempo prolongado. Estes mecanismos incluem atraso caminhos fisiopatológicos importantes, tais como a inflamação pós-acidente vascular cerebral, a angiogênese, a plasticidade neuronal e regeneração. Para analisar esses mecanismos e avaliar posteriormente alvos de novas drogas, os modelos AVC experimentais com relevância clínica, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade são procurados. Além disso, os ratos são os mais pequenos mamíferos em que uma lesão acidente vascular cerebral focal pode ser induzida e para que um largo espectro de modelos transgénicos sãodisponível. Assim, descrevemos aqui o modelo de ratinho de transcraniana, coagulação permanente da artéria cerebral média por meio de electrocoagulação distais das artérias lenticulostriatal, o chamado "modelo de coagulação". O infarto resultando neste modelo está localizado principalmente no córtex; o volume de enfarte em relação em relação ao tamanho do cérebro corresponde à maioria dos acidentes vasculares cerebrais humanos. Além disso, o modelo de preencher os critérios de reprodutibilidade e baixa mortalidade acima mencionados. Neste vídeo podemos demonstrar os métodos cirúrgicos de indução AVC no "modelo de coagulação" e denunciar as ferramentas de análise histológica e funcional.

Introdução

AVC é a terceira causa mais comum de morte e um dos principais motivos de incapacidade em adultos adquirido em países desenvolvidos ^1. Cerca de 80% desta doença neurológica aguda é causada por isquemia cerebral resultante de uma obstrução do fluxo sanguíneo cerebral, enquanto cerca de 15% é causada por uma hemorragia intracerebral ^2. Apesar de a investigação em curso, a administração intravenosa de ativador do plasminogênio tecidual é o único tratamento farmacológico aprovado para AVC isquêmico até agora e só está disponível para uma minoria de pacientes com AVC devido à janela de 4,5 horas após o AVC aparecimento ^3,4 tempo curto aprovado. Como não existem modelos in vitro, que podem modelar corretamente as complexas interações entre o cérebro, vasos e mecanismos fisiopatológicos sistêmicos durante o curso, os modelos animais são essenciais para a pesquisa do curso pré-clínico.

Portanto, vários modelos de derrame isquêmico foram desenvolvidos em uma variáveledade de espécies. Um dos modelos de AVC mais vulgarmente utilizado é o "Modelo de filamento", em que um fio de sutura é transitoriamente introduzido na artéria carótida interna e encaminhada até a ponta oclui a origem da artéria cerebral média (MCA), resultando numa paragem do fluxo sanguíneo e posterior infarto cerebral de também regiões corticais e subcorticais no caso de oclusão prolongada ^5,6. Em modelos photothrombotic de acidente vascular cerebral isquêmico, oclusão fotoquímica do navio cortical irradiado é alcançada após a injeção de um fotossensibilizador, resultando em pequenas lesões ^7, circunscritos localmente. A oclusão permanente da MCA distais das artérias lenticulostriatal pode ser conseguida por uma ligação da artéria, a sua compressão transitória ou por ^8,9 coagulação permanente. O enfarte resultante neste modelo afecta predominantemente o neocórtex ¹⁰ porque a oclusão da MCA neste modelo é distai ao lênticaulostriatal artérias, que fornecem os gânglios basais.

Uma vez que a maior parte das lesões de AVC humanos estão localizados no território da artéria cerebral média, todos os modelos comuns tempos assemelham oclusões da MCA ou de um dos seus ramos ^11. A MCA é uma das principais artérias que proporciona o fornecimento de sangue para o cérebro; que surge a partir da artéria carótida interna, rotas ao longo do sulco lateral, onde, em seguida, filiais e projetos para os gânglios da base e as superfícies laterais do frontal, parietal e lobos temporais, incluindo o motor primário e córtex sensorial. A direita ea esquerda MCA estão conectados às artérias cerebrais anterior e posterior artérias, que se conectam com as artérias cerebrais posteriores comunicação, criando o círculo de Willis (Figura 1).

Como relatado anteriormente por Carmichael et al. ^11, infartos modelados pela distal Cerebral Média Artery Oclusão (MCAO) modelo em camundongos abranger cerca de 10-15% do hemisfério, imitando assim a maioria das lesões tempos humanos, que estão localizados no território cortical MCA ^11,12. Em 1981, Tamura et al. Descrito um modelo de coagulação transcraniana permanente, MCAO em ratos ^8. No entanto, o modelo descrito por Tamura envolveu uma oclusão proximal da MCA, a fim de contornar a bifurcação mais distal da artéria. Assim, o "modelo Tamura" original induz não só as lesões corticais, mas também do corpo estriado, semelhantes às lesões obtidos por "modelo de filamento" ^6. Aqui, descrevemos o modelo permanente OACM distal por eletrocoagulação transcraniana em camundongos. Além disso, relatamos histológica relacionada e métodos funcionais para analisar o resultado AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em nossos laboratórios.

Protocolo

Declaração de Ética

As experiências relatadas neste vídeo foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais de laboratório e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemãs (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). 10 semanas de idade, os ratos machos C57Bl/6J são usadas neste estudo. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso à ração peletizada e água ad libitum. Analgesia e sedação protocolos são descritos como aprovado pela comissão governamental local, mas pode ser diferente de protocolos utilizados em outros laboratórios.

1. Preparação do material e instrumentos

1. Ligue o cobertor com aquecimento de modo a manter a área de operação quente e manter a temperatura do corpo do rato durante anestesia (37 ° C).
2. Tesoura Prepare autoclavado, forceps e algodões, dexpanthenol pomada e material de sutura. Prepara-se uma seringa com solução salina (sem agulha) para manter a área de operação hidratado. Prepare o gás de anestesia (70% de N ₂ O + 30% _de O2 + isoflurano).
3. Injectar analgésicos por via intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg e buprenorfina a 0,1 mg / kg.
4. Posicione o mouse na câmara de indução com uma taxa de fluxo de isoflurano de 4% para anestesiar-lo até que o movimento espontâneo de corpo e vibrissas pára.
5. Transfira o mouse na posição lateral com o nariz na máscara de anestesia e manter a concentração de isoflurano em 4% para cerca de um minuto, em seguida, reduzir e em approx.1.5% para manter a anestesia adequada.
6. Aplicar dexpantenol pomada em ambos os olhos.

2. Modelo MCAO distal

1. Faça uma incisão na pele um centímetro entre o ouvido eo olho usando pequenas tesouras de operação após o preparo asséptico do site usin cirúrgicog desinfetante da pele.
2. Separa-se a pele e localizar o músculo temporal.
3. Selecione no gerador de alta freqüência a função de coagulação, o modo bipolar, selecione 12 W e se conectar a pinça eletrocoagulação com o cabo.
4. Adicionar uma gota de solução salina e usar a pinça para retirar o músculo temporal do crânio em sua parte apical e dorsal, assim, fazendo um retalho do músculo sem remover totalmente o músculo.
5. Identificar a MCA abaixo do crânio transparente, na parte rostral da área temporal dorsal para o seio retro-orbital (Figura 2A). Se a bifurcação MCA não é visível (devido a uma variação normal anatómica) identificar o recipiente mais rostral.
6. Adicione um pouco de soro fisiológico no crânio e desbastar o osso com a broca logo acima do ramo MCA até que ele tem uma textura fina e translúcida (Figura 2B).
7. Retire cuidadosamente o osso acima da artéria com uma pinça muito finas.
8. Selecione o modo bipolar in o gerador de alta frequência com a 7 W. Coagula da artéria com o electrocoagulação pinça proximal e distal em relação à bifurcação (Figura 2C). Quando a bifurcação não é visível, devido a uma variante anatómica, coagular o ramo MCA correctamente identificados (ver acima), em dois locais de aprox. Distância de 1 mm. Não é necessário para captar a artéria com as pinças para coagulação, tocando a artéria cuidadosamente com pinças em ambos os lados a partir de cima é suficiente e induz menos danos mecânicos.
9. Espere 30 segundos e tocar suavemente a artéria com uma pinça embotadas para verificar se há fluxo de sangue devido a recanalização espontânea. No caso de recanalização repetir a electrocoagulação uma vez.
10. Mudar a localização do músculo temporal para a sua posição, que cobre o orifício de trepanação.
11. Suturar a ferida e colocar o animal em uma caixa de enfermagem a 32 ° C para se recuperar da anestesia e devolvê-lo para a jaula. Em geral, leva 5-10 minutos para o animal a recuperar da AnesthAIAS.
12. Injectar analgesia pós-operatória (ip) após 24 horas e depois diariamente até o quinto dia de pós-operatório: Carprofeno 4 mg / kg.

3. Sham Operação

Execute todos os procedimentos de forma idêntica para a operação descrita acima - incluindo o afinamento do crânio e sua remoção - exceto para não coagular a artéria exposta.

4. Cilindro de teste ¹³

1. Colocar o animal num cilindro de acrílico transparente de vidro (diâmetro: 8 cm, altura: 25 cm) em frente de dois espelhos e vídeo para 5 min. Ajustar a câmara central em frente dos dois espelhos e o cilindro para obter um vídeo (Figura 3A) óptima.
2. Para a avaliação do uso de membro anterior independente, pontuação (1) contato da parede do cilindro com um membro anterior durante traseiro completo e (2) de pouso com apenas um membro anterior no assoalho após traseiro completo. Contagem pelo menos 20 contatos para um membro anterior usando câmera lenta ou quadro-a-frame função do Cliente Vídeo Lan (VLC) software freeware ( http://www.videolan.org/vlc ).
3. Para a análise da linha de base antes da cirurgia: realizar o teste duas vezes por mouse, com uma pausa de 1 hora entre os ensaios. Membro Anterior uso é expresso como uma proporção de, uso direita / esquerda e verso membro anterior independente.
4. Após a coagulação MCA: realizar o teste novamente duas vezes por mouse, com uma pausa de 1 hora entre os ensaios, tal como indicado acima.

5. Perfusão

1. Anestesiar os animais (por exemplo, através de cetamina e xilazina 120/16 mg / kg de peso corporal, respectivamente).
2. Corrigir o animal em decúbito dorsal e abrir a cavidade abdominal com um corte mediano. Remover rasgos e esterno. Faça uma pequena incisão no átrio direito. Inserir uma cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e lentamente perfuse com 20 ml de solução salina.
3. Decapitar o animal, abrir a calota craniana e retire delicadamente o cérebro a partir da base do crânio.
4. Congelar os cérebros em -40 ° C isopentano frio durante 10 min. Depois remover os cérebros do isopentano e armazenar até análise a -80 ° C.

6. Infarct volumetria

1. Cryosectioning: Cortar os cérebros em série num criostato a 20 mm de espessura a cada 400 um em lâminas e armazenar as lâminas a -20 ° C.
2. Violeta de cresilo (CV) coloração:
   1. Preparar a solução de coloração: Misture 0,5 g de acetato de CV em 500 ml de H ₂ O. Agita-se e calor (60 ° C) até que os cristais são dissolvidos. Deixe a solução esfriar e guarde em um frasco escuro. Aquecer de novo para 60 ° C e de filtro antes de cada utilização.
   2. Secam-se as lâminas à TA durante 30 min. Em seguida, colocá-los em etanol a 95% durante 15 min e em seguida em etanol a 70% durante 1 minuto e depois em etanol a 50% durante 1 min.
   3. Colocar as lâminas em água destilada por 2 min, atualizar água destilada e colocá-los para 1 min. Depois coloque as lâminas em solução de coloração (60 ° C) fou 10 min e lava-se duas vezes em água destilada durante 1 min.
   4. Colocar as lâminas em etanol a 95% por 2 min. Em seguida, colocá-los em etanol a 100% durante 5 min, actualizar o etanol a 100% e para colocá-las em 2 min. Depois cobrir as lâminas com meio de montagem.
   5. Análise:
      Digitalizar slides e analisar o volume de infarto indireta pelo método Swanson ¹⁴ para corrigir edema:
      (Área isquêmica) = (área Cortex do lado contralateral) - (região do córtex não-isquêmica do lado ipsilateral) (Figura 4A).

Resultados

Devido ao tempo e moderada anestesia danos cerebrais curto, cerca de 10 min após a transferência para as suas gaiolas de todos os animais eram acordados, movendo-se livremente na gaiola e interagindo com a mesma ninhada. A mortalidade durante a cirurgia MCAO foi inferior a 5%, principalmente como resultado de hemorragia subaracnóidea acidental ou incorreta anestesia. A mortalidade durante o tempo de observação de 7 dias após a indução de derrame ocorre apenas muito raramente em cerca de 1-2% dos animais. Na série de operação de 10 animais para este relatório todos os animais sobreviveram à operação eo período de observação de 7 dias, nenhum deles teve de ser excluído devido a critérios de exclusão.

Déficits comportamentais após a MCA coagulação foram avaliados pelo teste do cilindro uso ¹³ analisar forepaw assimetria. Neste teste, o índice de utilização das patas dianteiras esquerda e direita independente é medida em pontos de tempo indicados após a indução e acidente vascular cerebral em comparação com os valores de base obtidos 24hr antes de MCAO (Figura 3B). Os animais apresentaram uma mudança significativa no uso do membro assimetria para a exploração parede combinados no teste do cilindro de 24 horas (1,72 ± 0,326, p <0,05) e 3 dias (1,36 ± 0,17, p <0,05) após a MCAO. Embora a relação melhorou durante o período de observação de 1 semana, a assimetria do motor era ainda significativo de 7 dias após MCAO (1,35 ± 0,29, p <0,05) em relação aos valores basais.

Realizamos infarto volumetria usando cresil violeta manchado seções cerebrais coronais de série 7 dias após a indução do AVC (Figura 4B). A média de volume de infarto foi de 15,4 mm ^3, representando, assim, 12% de um hemisfério cerebral (Figura 4C). A variabilidade deste modelo AVC é excepcionalmente baixo, com um desvio padrão de aproximadamente 10%. A área abrange a lesão somatossensorial e do córtex motor com afeto apenas menor de estruturas subcorticais. Além disso, a localização do infartoárea é altamente previsível com apenas variabilidade mínima como mostrado no diagrama esquemático de distribuição (Figura 4D).

Figura 1. Representação esquemática do Círculo de Willis. The Circle arterial de Willis é formado pelas artérias cerebral média (MCA) e as artérias cerebrais anteriores (ACA) que se ramificam a partir da artéria carótida interna (ACI), bem como pelo posterior artérias cerebral (APC) e a posterior artérias comunicantes (PComA). O MCA é executado no sulco lateral onde se ramifica para o córtex cerebral. O ramo MCA dominante fornecer a maior parte do córtex motor e parte do córtex somatossensorial é permanentemente ocluído pela modelo demonstrou (artéria comunicante Acoma = Anterior; BA = artéria basilar; Suca = cerebel Superiorartéria lar).

Figura 2. Vista transcraniana após remoção do músculo temporal e vista esquemática de oclusão MCA. (A) Depois de retirar o músculo temporal artérias corticais pode ser visto através do crânio do rato parcialmente translúcida (em camundongos 8-12 semanas de idade). O ramo dominante MCA pode ser identificado na parte rostral da visão temporal, bem como outras artérias corticais ramificação do MCA e do PCA na parte caudal. (B) Representação esquemática no ramo MCA dominante em sua variação predominante com uma bifurcação no córtex temporal lateral, após a perfuração de um orifício e a remoção do crânio. (C) Os quadrados pretos representam os sítios de coagulação MCA nas proximais e distais lados da bifurcação.

Figura 3. Análise de défices comportamentais. (A) teste do cilindro set-up: o mouse é colocado em um cilindro vertical e espelhos são colocados atrás a fim de registrar todos os movimentos usando uma câmera de vídeo (B) uso Membro Anterior assimetria foi analisada utilizando o teste do cilindro.. Rácios de esquerda / direita de uso independente membro anterior foram calculados 24 horas antes MCAO e nos momentos indicados após a indução derrame. N = 10, * p <0,05 entre o ponto de tempo indicado e basal valor (controlo).

Figura 4. Volumétrica análise infarto e resultado do infarto após distal MCAO. (A) Imagem representativa de uma violeta cresil sutiã coronal manchadona seção 7 dias após MCAO. A linha amarela é o que indica a seleção do córtex contralateral (direito) ea linha vermelha é a seleção do córtex não infartado (manchado) do cérebro ipsilateral. A área pálida no hemisfério esquerdo descreve a área do tecido infartado. (B) a análise do volume de infarto 10 cérebros (cada ponto representa um cérebro individual) 24 horas, 3 dias e 7 dias após a coagulação distal MCA. A linha vermelha representa a média horizontal, barras de erro indicam o desvio padrão. (C) representativas violeta cresil secções cerebrais coronais coradas cada 400 um a 7 dias após a MCA. Coagulação (D) distribuição esquemática do tecido cerebral enfartado 7 dias após a MCAO. Cada slide mostra a informação acumulada de distribuição infarto (codificados por cores, conforme indicado) na seção dada em relação ao bregma (imagem modificada a partir de:. Liesz A et al, Brain, 2011; com permissão de Oxford University Press). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O presente protocolo descreve o modelo experimental de acidente vascular cerebral distal, OACM permanente por eletrocoagulação transcraniana - o chamado "modelo de coagulação". Este modelo, entretanto, tornar-se um dos modelos animais mais utilizados em pesquisa do curso experimental ^12. Em comparação com outros modelos de isquemia cerebral focal, o modelo de coagulação, tal como apresentado neste vídeo tem a vantagem de um tempo muito curto, a operação de aproximadamente 10 min, quando realizado por um cientista treinado. Assim, os tempos breves de anestesia pode ser conseguida neste modelo, o que é uma característica favorável de um modelo de acidente vascular cerebral experimental porque o impacto dos anestésicos em neuroprotecção e derrame resultado é bem conhecido ^15. Além disso, como anteriormente descrito por Carmichael et ai. ^11, que demonstram que o volume do enfarte resultante e localização após distal coagulação permanente do MCA corresponde às lesões cerebrais isquémicas, na maioria dos humanosderrames em proporção ao tamanho do cérebro. Acidente vascular cerebral humano é principalmente de tamanho pequeno com lesões de, aproximadamente, 5-15% de hemisfério, com base em estudos populacionais anteriores e os ensaios clínicos de imagem ^16-18, em contraste com lesões extensas com acidente vascular cerebral edema cerebral compressão que ocorrem em menos de 10% de cursos clínica ^19. Deste modo, as lesões de AVC do território da ACM de cerca de 12% do hemisfério alcançado pelo modelo apresentado pode ser considerado como um volume de curso relevantes em translação. No entanto, tem que ser tomado em consideração que diferentes estirpes de ratos ou protocolos utilizados para anestesia pode afectar o volume da lesão que resulta ^20.

A mortalidade durante o período de observação após a indução AVC neste modelo é praticamente ausente. A mortalidade total de menos de 5% é constituída principalmente de mortes durante a operação por causa de complicações anestesiológicas ou sacrifício porque chegando de critérios de exclusão. A fim de justificar a baixa variability deste modelo e sua excelente reprodutibilidade, sugerimos os seguintes critérios de exclusão: 1) Qualquer hemorragia subaracnóide durante a operação. 2) Tempo de operação mais de 15 min. 3) A recanalização da MCA depois de duas tentativas para eletrocoagulação com apenas OACM transitória. Além disso, os animais devem ser examinados diariamente após MCAO (comportamento fisiológico básico, a aparência da pele eo peso corporal) para controlar a dor, desconforto ou comportamento doentio.

Várias medidas podem ser implementadas para a análise do resultado do curso como medida speckle laser, ressonância magnética, testes comportamentais ou análise histológica. Neste protocolo, fornecer métodos exemplares para análise do comportamento e análise de volume de infarto. Vários teste para análise de comportamento após a isquemia cerebral focal têm sido desenvolvidos e utilizados em pesquisa do curso experimental. Testes adequados para a disfunção sensório-motor usado anteriormente pelo nosso grupo neste modelo AVC ^21,22 nósre o teste Rotarod ^23, teste de etiqueta adesiva ^24, Canto teste ²⁵ eo teste do cilindro ^13, o que é demonstrado neste vídeo. O teste do cilindro consistentemente descreve assimetria do motor na fase aguda após distal MCAO permanente e também detecta recuperar consecutivo da função motora.

Apesar das vantagens óbvias, algumas limitações deste modelo de acidente vascular cerebral tem que ser tida em conta. Em primeiro lugar, é necessária uma trepanação do crânio, a fim de coagular a artéria, produzindo, assim, um acesso potencial de peri-operacionais infecções do cérebro, embora as infecções bacterianas da ferida cirúrgica, músculo temporal ou o próprio cérebro nunca ter sido detectado por nós mesmos ou documentados por outros usando esse modelo. Além disso, os danos mecânicos para o córtex e de coagulação, durante a preparação não pode ser excluída, mas pode ser limitada pela perfuração cuidadosa e remoção do crânio, humidificação constante do local de cirurgia e ne mínimo eletrocoagulação sário (ver critérios de exclusão). Embora o campo da MCA, conforme ilustrado na Figura 2 encontra-se na maioria dos ratinhos C57BL / 6, nós descrevemos o protocolo como proceder em variações normais do rumo do navio para minimizar a variabilidade modelo. Além disso, sugerimos o uso de múltiplas (3 no caso de bifurcação; 2 sem bifurcação dos MCA) sites de oclusão para minimizar o risco de recanalização parcial da MCA, que em nossa experiência é um fator importante para a variabilidade deste modelo.

Em termos de testes comportamentais, apenas os déficits comportamentais menores podem ser detectados nos testes comportamentais acima mencionados e regeneração funcional pode ser observado na primeira semana após o acidente vascular cerebral. Assim, os sistemas de teste mais avançados, com maior sensibilidade e parâmetros de teste qualitativo como o teste atingindo qualificados ²⁷ pode ser mais adequado para detectar o resultado funcional a longo prazo neste modelo.

EOR "> Finalmente, devido à coagulação permanente do MCA não reperfusão pode ser obtido, que é uma característica observada numa percentagem substancial de pacientes com AVC, devido a lise de coágulos espontâneos ou terapia ^28. No entanto, um modelo de acidente vascular cerebral tromboembólico anteriormente descrito ²⁶ fornece a opção por um modelo de curso gratuito com a reperfusão de isquemia cerebral cortical. Tomados em conjunto, a alta reprodutibilidade, a possível observação a longo prazo devido à mortalidade mínimo eo volume de infarto em relação comparável e localização em relação ao acidente vascular cerebral humano distinguir o "modelo de coagulação" como um modelo valioso para a pesquisa básica e translacional derrame.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera Canon Eos 500D	Canon		Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 video function
Mirror	Kristallform	2677089	30 x 30 cm
Transparent acrylic glass cylinder	H&S Kunststofftechnik		Diameter: 8 cm,  height: 25 cm
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Fine Scissors	FST	15000-00
Mayo Scissors	FST	1410-15
Forceps	FST	11616-15
Cottons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Saline solution	Braun	131321
Bepanthen pommade	Bayer
Isoflurane	Abbot	B506
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Electrosurgical device	ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät
Drill	Proxxon	D-34343
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Xylacine	Albrecht
5ml Syringe	Braun
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Isopentane	Fluka	59070
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Acetic acid	Sigma Life Science	695092
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
C57Bl/6J mice	Charles River	000664