Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Resumo

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Resumo

As células que expressam NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrócitos) são a quarta maior população de células da glia do sistema nervoso central. Durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal eles ativamente proliferar e gerar oligodendrócitos myelinating. Estas células têm sido vulgarmente estudada em culturas dissociadas de neurónios primárias, co-culturas, e em tecido fixado. Utilizando linhas de ratinhos transgénicos fatia recentemente disponíveis sistemas de cultura pode ser utilizado para investigar a proliferação e diferenciação de células da linhagem de oligodendrócitos em ambas as regiões de matéria cinzenta e branca do cérebro anterior e do cerebelo. Culturas de fatias são preparadas a partir de ratos pós-natais precoces e são mantidas em cultura durante 1 mês. Estas fatias podem ser fotografada várias vezes ao longo do período de cultura para investigar o comportamento celular e interações. Este método permite a visualização de divisão celular NG2 e os passos que levam à diferenciação de oligodendrócitos, enquanto permitindo uma análise detalhada da região, dependement células NG2 e oligodendrócitos heterogeneidade funcional. Esta é uma técnica poderosa que pode ser utilizada para investigar os sinais intrínsecas e extrínsecas que influenciam estas células ao longo do tempo em um ambiente celular que se assemelha ao que se encontra in vivo.

Introdução

Culturas fatia Organoytpic do sistema nervoso central têm provado ser extremamente útil para o estudo do neurônio e da biologia de células gliais em um sistema semiintact ^1-4. Estas culturas são relativamente simples de adoptar e reter muitos benefícios de culturas dissociadas de células primárias, tal como a manipulação do ambiente extracelular e de fácil acesso para a imagem de células vivas repetida a longo prazo e registos electrofisiolicos ^5-9. Além disso, as culturas de fatias manter citoarquitetura tecido 3-dimensional, conectividade neuronal regional, e a maioria dos tipos de células principais estão presentes no sistema. Estas propriedades fazem essas culturas um sistema único e conveniente para investigar o comportamento de uma única célula e fisiologia com interações celulares e ambientais.

NG2 células são uma população de células da glia do sistema nervoso central dos mamíferos que continuam a proliferar e gerar myelinating oligodendrócitos durante embrionário e pós-natal de desenvolvimento ^10. Eles têm sido extensivamente estudados em culturas de células primárias dissociadas, e o desenvolvimento recente de linhas de ratinhos transgénicos com expressão específica para células NG2 de proteínas fluorescentes em facilitou o mapeamento destino in vivo e registos electrofisiolicos em preparações de fatias agudas. Mesmo com esses estudos, pouco se sabe sobre a dinâmica da proliferação de células NG2 e diferenciação de oligodendrócitos. Embora a cultura de células dissociadas é amplamente utilizado para a relativa facilidade em manipulações farmacológicas e genéticas, que não é adequado para a interrogação diferenças funcionais destas células em diferentes regiões cerebrais particularmente quando é desejável manter o contexto do microambiente celular. Culturas de fatias proporcionar uma alternativa simples, que é passível de manipulações farmacológicas e têm sido utilizados para investigar a mielinização ^11,12 oligodendrócitos, célulaular resposta após lisolecitina (LPC) ou anticorpo desmielinização ^13,14, e indução de remielinização por meio do tratamento farmacológico ^15.

Um método para investigar e realizar imagem ao vivo e tecido fixo (ou postfixation) análise da proliferação celular e diferenciação NG2 oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias retiradas quer do cérebro anterior e do cerebelo é descrito. Este é um método poderoso que pode ser utilizado para estudar o destino da célula de células NG2 individuais após divisão ¹⁶ e para descobrir diferenças região-e dependente da idade, do factor de crescimento NG2 induzida a proliferação de células ^17. Esta técnica relativamente simples é amplamente acessível para investigar celular intrínseca e / ou ambiental mecanismos que regulam a fisiologia destas células gliais e sua resposta à atividade neuronal ou danos mielina.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais está seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Connecticut.

NOTA: Para estas experiências constitutivas NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) e induzível NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) camundongos transgênicos cruzou para Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP repórter ²⁰ (JAX # 006148) linhas, respectivamente, foram utilizados a imagem células NG2 e seus descendentes. Para imagem oligodendrócitos maduros, foram utilizados PLPDsRed camundongos transgênicos ^21. Para a sobrevivência consistente, as fatias pode ser isolado a partir de murganhos de até 10 dias pós-natal de ambos o cérebro anterior e do cerebelo.

1 fatia Preparação

1. Em uma capa de cultura, colocar inserções de cultura de tecidos em seis poços e adicionar 1 ml fatia meio de cultura (receita na seção de reagentes). Colocar as placas na incubadora de cultura de células a 37 ° C com 5% de CO _2, pelo menos, 2 horas antes da dissecação.
2. Esterilizar todas as ferramentas e cortador de tecidos com 70% de etanol.
3. Tampão bolha dissecção (receita na secção reagentes) com 95% _{de O2,} 5% de CO ₂ em gelo durante pelo menos 15 minutos antes do início da dissecção.
4. Anestesiar filhotes de rato, colocando-se em gelo durante 5-10 minutos de acordo com os protocolos aprovados animais. Determinar a profundidade adequada de anestesia, confirmando que os ratos não respondem a cauda e pés beliscar.
5. Decapitar os animais utilizando uma tesoura afiada seguintes protocolos animais. Remover rapidamente o crânio sobre o cérebro anterior e do cerebelo fazendo primeiro um corte sagital seguido de incisão lateral, usando ferramentas esterilizados. Cortar nervos cranianos a partir da superfície ventral do cérebro e cerebelo com cuidado rolando o tecido para o lado.
6. Colocar o tecido de uma estéril prato de 35 mM contendo tampão de dissecção oxigenado gelado.
7. Usando uma lâmina de barbear, cortar o cerebelo eo cérebro anterior. Em seguida, faça um corte médio-sagital throurg o cérebro anterior e do cerebelo, separando os hemisférios.
8. Corte 300 m de espessura secções coronal e sagital do cérebro anterior e cerebelo com um cortador de tecidos manual. NOTA: Um cortador de tecidos manual permite o processamento rápido de dissecção de incubação da cultura, sem a necessidade de incorporação de agarose. Um vibratome também pode ser utilizado como descrito anteriormente ^9.
9. Transferir fatias separadas em tampão de dissecção frio recém borbulhar em gelo.
10. Use pequena dissecação ou pesando espátulas para separar seções individuais e transferi-los para pré-incubados seis pratos bem com inserções de cultura.
11. Remover qualquer excesso de tampão de dissecção a partir da superfície da lâmina de cultura, utilizando uma pipeta de transferência descartável ou uma ponta de pipeta P 200. Dois a três prosencéfalo ou três fatias de cerebelo podem ser colocados em uma inserção de cultura.
    NOTA: Para obter resultados consistentes com as culturas do cérebro anterior, é ideal para tomar fatias que mede o anterior de um terço do corpo caloso(Figura 1A), a fim de estudar as duas regiões de substância cinzenta e branca na mesma fatia. Cada animal geralmente produz seis fatias do cérebro anterior e seis fatias do cerebelo.
12. Coloque as placas de seis poços na incubadora e substituir o meio fatia com 1 ml de meio de fatia 1 dia após a preparação fatia e, em seguida, a cada dois dias até que a fixação fatia.
13. Dependendo da experiência, utilizam fatias após 5-7 dias em cultura. Use somente as fatias que se tornam transparentes após os primeiros dias e descartar aqueles que possuem regiões opacas irregulares. NOTA: regiões opacas dentro fatias são visíveis a olho nu e aparecer como um aglomerado de células escuras sob contraste de fase. Após a técnica foi dominada, fatias opacos mortas ocorrem raramente, em menos de 1-5% de fatias.

2 Time-Lapse Imagem de NG2 divisão celular e diferenciação Oligodendrocyte

NOTA: Para executar time lapse imagem da proliferação das células NG2 e diferenciação usamos NG2cre: ZEG camundongos ¹⁶que expressam GFP em células NG2 e seus descendentes (Figura 1C-E). Expressão Reporter nesta linha é suficientemente robusto para obter imagens ao vivo de GFP + células em fatias imediatamente após o corte por um período de tempo de pelo menos quatro semanas. As imagens são obtidas mais claras após o período inicial de desbaste da fatia, o qual ocorre durante os primeiros 3-5 dias de cultura.

1. Durante toda a experiência, manter as fatias numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e remover apenas por breves períodos de tempo (inferior a 15 min por fatia), mantendo-se a tampa sobre a seis poços enquanto a imagem.
2. Usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera digital, capturar imagens no primeiro ponto de tempo usando uma objetiva de 10X. NOTA: Os pontos da primeira vez vai variar de acordo com experiência e pode ser o dia em que os cortes foram preparados ou qualquer ponto após o tempo.
3. Capturar imagens de várias regiões no ponto de um tempo em ambas as áreas de matéria cinzenta e branca da fatia. ª Notae região fotografada por marcos específicos dentro da fatia e mapeando a localização da imagem em um esquema que pode ser utilizado para sessões de imagem subseqüentes. Marcos úteis podem incluir bordas das fatias e / ou orientação de tratos de substância branca. Imagem 4-8 locais de cada fatia em cada ponto de tempo.
4. Capturar imagens subseqüentes com um intervalo de 4-6 horas se examinar a divisão celular NG2 e diferenciação de oligodendrócitos, idealmente mais de 5-7 dias.
5. Capturar uma imagem final de todas as regiões e corrigir as fatias imediatamente. Adicionar 1 ml de fixador (4% PFA com 0,1 M L-lisina de meta-periodato de sódio 0,01 M) para a parte inferior da inserção de cultura e, em seguida adicionar mais 1 ml por cima das fatias. Tome cuidado para não esguichar o fixador diretamente na fatia como ela pode desprender da membrana. Fixe o tecido por 30 min e prosseguir com imuno-histoquímica utilizando marcadores específicos do estágio de desenvolvimento como descrito na seção 4.
6. Fatias de lavagem com tampão de fosfato de sódio 0,2 M 3 x 10 m. Se necessário, as fatias armazenar a 4 ° C em tampão fosfato de sódio 0,2 M durante 1-3 dias antes da coloração imunológica mas idealmente realização da coloração dentro de 24 horas. Prossiga com imuno-histoquímica, como descrito abaixo na seção 4 para determinar a proporção de células que diferenciam em oligodendrócitos (Figura 2D-F).

3. Destino Mapeamento de NG2 Progênie celular usando Inducible Reporter ratos transgênicos em culturas fatia

NOTA: Para rastrear o destino das células NG2 de um momento em particular na cultura, NG2creER indutíveis: ratinhos transgénicos YFP pode ser utilizado.

1. Induzir a recombinação Cre e expressão repórter pela adição de 100 nM 4OHT dissolvido em etanol ao meio de cultura. NOTA: As células positivas repórter deve aparecer dentro de 1-2 dias de indução com uma eficiência de 20-25% de células ~ YFP NG2 + + / NG2 + e neste ponto todo o tempo será células na fase de célula NG2 (Figura 2A-C)
2. Fix e lavar a fatias em diferentes pontos de tempo após várias manipulações (descrita nas secções 2.5 e 2.6).

4 Slice Imunohistoquímica

1. Corte as membranas com as fatias ligados fora das inserções, utilizando um bisturi.
2. Transferir fatias para poços individuais de uma placa de 24 poços de solução salina contendo fosfato tamponada (PBS), utilizando um conjunto de pinças, tendo o cuidado de não perturbar a composição da fatia aquando do levantamento da membrana.
3. Transferir as fatias para uma placa de 24 poços com uma solução contendo 5% de soro de cabra normal (NGS) e 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 1 hr a bloquear.
4. Incubar as fatias em anticorpo primário S / N em 5% de NGS em PBS a 4 ° C. Para identificação de células na fase de célula NG2, utilizar anticorpos para NG2 e PDGFRα. Para identificar os oligodendrócitos diferenciadas, utilizar um anticorpo para o antigénio da polipose adenomatosa coli (APC; clone CC1).
5. No segundo dia de fatias de lavagem em PBS 3 x 15 min, em seguida, incuba-se Antibo secundáriomorre em 5% de NGS em PBS durante 1 h à TA. Lave as fatias em PBS 3 x15 min e montagem em lâminas. Montar com fatias para cima e membrana de frente para o slide para que a membrana não será entre o objetivo eo tecido.

Resultados

Exemplos de dados representativos são dadas abaixo que foram obtidos utilizando culturas fatia de ambos parte frontal do cérebro e cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linhas de camundongos transgênicos. Células NG2 pode ser trabalhada ao longo de dias em fatias do cérebro anterior e cerebelo (Figura 1B-D, Vídeo 1) e o fenótipo destas células pode ser determinado após fixação e coloração imunológica com anticorpos NG2 e CC1 (Figura 1E). Além de viver de im...

Discussão

Mielinização no sistema nervoso central é essencial para a comunicação neuronal e sobrevivência eficiente axonal ^22. Células NG2 gerar continuamente oligodendrócitos myelinating para a idade adulta, mantendo uma população residente na maioria das regiões do cérebro ^{16,23 - 25.} Alguns mecanismos genéticos e moleculares que regulam a diferenciação destas células foram descritas, mas ainda há muito a ser descoberto. Culturas fatia organot�icas são uma ferramenta conveniente para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope