Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

Резюме

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Аннотация

NG2 экспрессирующие клетки (polydendrocytes, клетки-предшественники олигодендроцитов) являются четвертым главным населения глиальных клеток в центральной нервной системе. Во время эмбрионального и постнатального развития они активно размножаются и генерировать myelinating олигодендроцитов. Эти клетки обычно были изучены в первичных диссоциированных культур нейронов, совместных культурах, и в основной ткани. Использовании новейших трансгенных линий мышей нарезать системы культивирования могут быть использованы для исследования пролиферацию и дифференцировку олигодендроцитов клона клеток в обоих серого и белого вещества регионах переднего мозга и мозжечка. Срез культуры готовят из ранних послеродовых мышей и хранятся в культуре в течение до 1 месяца. Эти кусочки могут быть отображены несколько раз в течение периода культивирования исследовать клеточный поведение и взаимодействие. Этот метод позволяет визуализация разделения NG2 клеток и шаги, ведущие к олигодендроцитов дифференциации при одновременном обеспечении подробный анализ региона-зависитЛОР NG2 клеток и олигодендроцитов функциональная гетерогенность. Это мощный метод, который может быть использован, чтобы исследовать внутренние и внешние сигналы, влияющие на эти клетки в течение долгого времени в сотовой среде, которая близко напоминает, что найдено в естественных условиях.

Введение

Organoytpic срез культуры центральной нервной системы, оказались чрезвычайно полезны для изучения нейрон и глиальных клеточной биологии в semiintact системы ^{1 - 4.} Эти культуры сравнительно просто принять и сохранить множество преимуществ первичных культурах диссоциированных клеток, таких как манипуляции с внеклеточной среде и легким доступом для повторил долгосрочного изображений живых клеток и электрофизиологических записей ^{5 - 9.} Кроме того, срез культуры поддерживать 3-мерное тканей цитоархитектуры, региональных связей нейронной, и большинство крупных типы клеток присутствуют в системе. Эти свойства делают эти культуры уникальную и удобную систему для расследования одного поведение клеток и физиологию с сотовой и экологических взаимодействий.

NG2 клетки население глиальных клеток в центральной нервной системе млекопитающих, которые продолжают пролиферировать и генерируют мyelinating олигодендроцитов во время эмбрионального и постнатального развития ^10. Они были широко изучены в диссоциированных первичных клеточных культур, и недавняя разработка трансгенных линий мышей с клеточно-специфической экспрессии NG2 флуоресцентных белков способствовала в отображении естественных судьбы и электрофизиологических записей в острых срезов препаратов. Даже с этими исследованиями, мало известно о временной динамики пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации. Хотя диссоциированной клеточной культуры широко используется для относительного объекта в фармакологических и генетических манипуляций, он не подходит для допроса функциональные различия этих клеток в разных отделах головного мозга, особенно, когда желательно, чтобы поддерживать контекст сотовой микросреды. Срез культуры обеспечивают простой альтернативой то, что поддается фармакологических манипуляций и были использованы для расследования олигодендроцитов миелинизации ^11,12, клеткаулар ответ после лизолецитина (LPC) или антитела индуцированной демиелинизации ^13,14 и индукцию ремиелинизации через фармакологического лечения ^15.

Способ для расследования и выступать с концертами изображений и фиксированной ткани (или postfixation) анализ пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации в органотипических культур срез, взятых из обоих переднего мозга и мозжечка, описанное. Это мощный метод, который может быть использован для изучения клеток судьбу отдельных клеток NG2 после деления ¹⁶ и открыть для себя Region- и зависит от возраста различия в фактор роста распространения индуцированных NG2 клеток ^17. Этот сравнительно простой метод широко доступны для дальнейшего расследования ячейку внутренней и / или окружающей среды механизмы, регулирующие физиологию этих глиальных клеток и их реакцию на нейронной активности или повреждения миелина.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных в соответствии с инструкциями и были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Университете штата Коннектикут по.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов учредительных NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) и индуцибельных NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) трансгенные мыши подошел к Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) или gtRosa26: YFP репортер ²⁰ (JAX # 006148) линии соответственно были использованы с изображением NG2 клеток и их потомства. Для изображения зрелых олигодендроцитов, PLPDsRed трансгенных мышей ²¹ были использованы. Для последовательного выживания, ломтики могут быть выделены из мышей до 10 день постнатального как от переднего мозга и мозжечка.

1 ломтик Подготовка

1. В капюшоне культуры, разместить культуры ткани вставки в шести луночные планшеты и добавить 1 мл ломтик культуральной среды (рецепт в реагентов разделе). Положите пластины в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO _2, по крайней мере 2 час до контрольного вскрытия.
2. Стерилизовать все инструменты и ткани вертолет с 70% этанола.
3. Bubble рассечение буфера (рецепт в реагентов разделе) с 95% О _2, 5% СО ₂ на льду в течение не менее 15 мин до начала вскрытия.
4. Обезболить щенков мыши, поместив их на льду в течение 5-10 мин в соответствии с утвержденными протоколами животных. Определить подходящий глубины анестезии, подтвердив, что мыши не реагируют на хвосте и ног щипать.
5. Обезглавить животных, используя острые ножницы следующие протоколы животных. Быстро удалить череп над переднего мозга и мозжечка, сначала делает сагиттальный разрез с последующим боковым разрезом, с использованием стерильных инструментов. Вырезать черепных нервов из вентральной поверхности мозга и мозжечка, тщательно прокатки ткани в сторону.
6. Поместите ткань в стерильную 35 мм блюдо с ледяной кислородом буфер рассечение.
7. Используя лезвие, разорвать мозжечок и передний мозг. Затем сделайте в середине сагиттальной разрез беспересадочныйтьфу передний мозг и мозжечок, разделения полушарий.
8. Вырезать 300 мкм-толстые фронтальной и сагиттальной разделы переднего мозга и мозжечка с механической ткани вертолета. ПРИМЕЧАНИЕ: ручная ткани измельчитель позволяет быструю обработку от вскрытия до культуры инкубации без необходимости агарозном вложения. Vibratome также могут быть использованы, как описано выше ^9.
9. Трансфер разделенные ломтики в недавно пропускают буфер холодно рассечение на льду.
10. Используйте небольшую рассечения или весом шпатели для разделения отдельных разделов и передавать их на преинкубировали шесть также блюда с культурой вставками.
11. Удалите излишки буфера рассечение с поверхности культурального вставки с помощью одноразовой пипетки передачи или пипетки наконечник Р 200. Два-три переднего мозга или мозжечка трех кусочков могут быть размещены на одной культуры вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения одинаковых результатов с переднего мозга культур, он идеально подходит, чтобы взять ломтики охватывающих передней трети мозолистого тела(1А) для того, чтобы изучать как серые и белые области материи в том же срезе. Каждое животное, как правило, дает 6 ломтиков переднего мозга и 6 частей мозжечка.
12. Поместите луночных шесть в инкубаторе и заменить ломтик среды 1 мл ломтик среде 1 день после приготовления срезов и затем через день до среза фиксации.
13. В зависимости от эксперимента с помощью срезов через 5-7 дней в культуре. Используйте только ломтики, которые становятся прозрачными после первых нескольких дней и отбросить те, которые имеют неровные непрозрачные области. ПРИМЕЧАНИЕ: Непрозрачные участки внутри кусочков видны на глаз и появляются в виде скопления темных клеток под фазового контраста. После, как технология была освоена, мертвые непрозрачные ломтики встречаются редко, менее чем 1-5% от ломтиками.

2 цейтраферной Визуализация NG2 деления клеток и олигодендроцитов дифференциации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения функции длительной визуализации клеточной пролиферации NG2 и дифференциации мы используем NG2cre: ZEG мышей ¹⁶которые выражают EGFP в NG2 клеток и их потомства (Рисунок 1C-E). Репортер выражение в этой линии является достаточно прочным, чтобы получить живые изображения GFP + клеток в срезах сразу после срезов в течение периода времени, по меньшей мере, четырех недель. Наиболее четкие изображения получаются после начального периода прореживания среза, которая происходит в течение первых 3-5 дней в культуре.

1. В течение всего эксперимента, держать ломтики в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С и удалить только в течение коротких периодов времени (менее 15 мин на срезе), сохраняя крышку на луночного планшета шесть в то время формирования изображения.
2. Использование инвертированного флуоресцентного микроскопа, снабженного цифровой камеры, захват изображений в первой точке времени, используя цели 10X. ПРИМЕЧАНИЕ: Первые временные точки будет варьироваться в зависимости от эксперимента и может быть день, когда ломтики были подготовлены или в любое время точка после.
3. Захват изображения с нескольких регионах в момент времени один в обоих серого и белого вещества областях среза. Примечание йэлектронной область отображаемого на конкретных ориентиров в пределах среза и путем сопоставления положения изображения на схеме, которая может быть использована для последующих сеансов обработки изображений. Полезные ориентиры могут включать края ломтиков и / или ориентации трактов белого вещества. Изображение 7:56 местах на каждом срезе в каждый момент времени.
4. Захват остальных изображений с интервалом в 4-6 часа, если отдел экспертизы NG2 клеток и олигодендроцитов дифференциацию, в идеале более 5-7 дней.
5. Захват окончательный образ всех регионах и немедленно устранить ломтики. Добавить 1 мл фиксатора (4% PFA 0,1 М L-лизина 0,01 М натрий мета-периодатом) в нижней части культуры вставки, а затем добавить еще 1 мл на верхней части ломтиков. Будьте осторожны, не шприц фиксатором непосредственно на срезе, как это может отделиться от мембраны. Закрепите ткань в течение 30 мин и заполните иммуногистохимии с использованием развития маркеры стадии конкретных, как описано в разделе 4.
6. Ломтики Промыть 0,2 М натрия фосфатного буфера 3 х 10 мв. При необходимости хранить кусочки при 4 ° С в 0,2 М фосфатном буфере натрия в течение 1-3 дней перед иммунного окрашивания, но в идеале выполнить окрашивание в течение 24 часов. Продолжайте иммуногистохимии, как описано ниже в разделе 4, чтобы определить долю клеток, которые дифференцировались в олигодендроциты (Рисунок 2D-F).

3 Судьба картирование NG2 клеток потомства Использование Индуцибельная Репортер трансгенных мышей в срез культуры

Примечание: Чтобы отслеживать судьбу NG2 клеток от конкретной временной точке в культуре, индуцируемые NG2creER: YFP трансгенные мыши могут быть использованы.

1. Вызвать Cre рекомбинации и репортер выражение добавлением 100 нМ 4OHT растворяют в этаноле в культуральную среду. Примечание: Reporter позитивные клетки должен появиться в течение 1-2 дней при индукционной эффективности ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + клеток и в этот момент времени все будут клетки на стадии NG2 клеток (Фигура 2А-С)
2. Fix и мыть кусочекс при различных временных точках после различных манипуляций (описано в разделах 2.5 и 2.6).

4 Slice Иммуногистохимия

1. Нарежьте мембран с ломтиками прикрепленных из вставок с помощью скальпеля.
2. Трансфер ломтики в отдельные лунки 24 луночного планшета, содержащего фосфатным буферным раствором (PBS), используя набор пинцетом, стараясь не нарушить состав среза, когда поднимаете мембрану.
3. Передача ломтики в 24-луночный планшет с блокировкой раствора, содержащего 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,1% Triton-X100 в PBS в течение 1 часа.
4. Инкубируйте срезов в начальной O антител / N в 5% NGS в PBS при 4 ° С. Для идентификации клеток в стадии NG2 клеток, использовать антитела к NG2 и PDGFRα. Для выявления дифференцированных олигодендроциты, использовать антитела к САП палочки антигена (APC; клон CC1).
5. На втором ломтиками день стирки в PBS 3 x15 мин, затем инкубировать в средней Antiboумирает в 5% NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте ломтики в PBS 3 x15 мин и смонтировать на слайдах. Установите с кусочками вверх и мембраны, стоящих перед слайд так, что мембрана не будет между объективным и ткани.

Результаты

Примеры репрезентативных данных приведены ниже, которые были получены с помощью срез культуры как от переднего мозга и мозжечка P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP и PLPDsRed трансгенных линий мышей. NG2 клетки могут быть отображены в течение нескольких дней в переднего мозга и мозжечка ломтиками (Фигура ...

Обсуждение

Миелинизация в центральной нервной системе имеет важное значение для эффективного нейронов и аксонов связи выживание ^22. NG2 клетки непрерывно генерировать myelinating олигодендроцитов во взрослую жизнь, поддерживая постоянное население в большинстве областей мозга ^{16,23 - 25.} Неко?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope