Isolar células-tronco intestinais de Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Intestino médio por FACS para estudar o comportamento das células-tronco durante o envelhecimento

Resumo

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Resumo

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Introdução

Uma conseqüência inevitável do envelhecimento é a capacidade decrescente de tecidos e órgãos para permanecer funcional. Células-tronco adultas são essenciais para a manutenção da homeostase do tecido e funcionalidade de órgãos, no entanto como organismos idade, as células-tronco também experimentam um declínio em seu comportamento biológico. Isto é particularmente prejudicial para os tecidos que têm uma elevada taxa de rotação, tal como o epitélio intestinal. Características das células-tronco com idade incluem dano genômico, os mecanismos de reparo com deficiência, a regulação do ciclo celular prejudicada e vias de sinalização desregulada, os quais afetam o comportamento de células-tronco normal (revisado em ^03/01). Ao manipular as vias de sinalização específicas ou derrubando genes específicos, nós ganhamos uma visão sobre seus papéis na regulação e manutenção de um comportamento normal de células-tronco. Como a maioria desses experimentos são abordagens molécula candidata, temos muito pouco conhecimento sobre as alterações moleculares endógenos que ocorrem nas células-tronco duranteenvelhecimento. Uma maneira de abordar esta questão é comparar o transcriptoma de jovens contra as células-tronco de idade para identificar moléculas cujo perfil de expressão muda significativamente durante o envelhecimento. Infelizmente, desafios biológicos e técnicos têm dificultado o nosso progresso em relação a esta abordagem até agora.

Drosophila melanogaster é um organismo modelo altamente adequado para estudar o envelhecimento uma vez que tem um tempo de vida curto (cerca de 60-70 dias) e exibe envelhecimento fenótipos (revisto em ^4). Além disso, o processo de envelhecimento em Drosophila pode ser acelerada pela temperatura. Ao manter as moscas a 29 ° C, um fenótipo envelhecido no tecido intestinal já pode ser observada após 15 dias ^5. Além disso, Drosophila é tratável através de um grande número de manipulações genéticas. Em particular, o intestino médio de Drosophila tem emergido como um excelente sistema modelo para estudar a influência de diferentes vias de sinalização e desafios ambientais sobrea biologia de células-tronco intestinais (ISC) durante o envelhecimento (revisto em ^6-10). O epitélio intestinal Drosophila tem uma alta taxa de rotatividade e se renova a cada duas semanas no sexo feminino e uma vez por mês no sexo masculino ^11. ISC residente no intestino médio de Drosophila tenham a capacidade de se dividir e produzir uma ISC de auto-renovação de células progenitoras e um pós-mitótico chamado o enteroblast (EB) ^12,13. A EB diferencia em qualquer um dos enterócitos de absorção ou uma célula secretora enteroend�rina. Para esta data, a combinação marcador só que de forma inequívoca rotula um ISC é a expressão do fator de transcrição escargot (ESG) e o ligando Notch Delta (DL) ^14. No entanto, isso só é válido para um jovem e saudável intestino. Durante o envelhecimento, o epitélio do intestino médio é caracterizado por um aumento da proliferação ISC ^15-17. Além disso, a sinalização Notch aberrante interrompe a decisão destino das células-filhas ISCe induz misdifferentiation da EBS ^15. Isso resulta em um acúmulo de células que estão ativas para a sinalização Notch e co-express ESG e Dl, tornando assim a expressão Dl insuficiente para identificar bona fide células-tronco em um midgut idade. A dificuldade em identificar os verdadeiros ISC tem impedido a capacidade de examinar as alterações endógenas na ISC envelhecimento até agora.

Temos abordado esta questão, aproveitando a ESG -Gal4, UAS-GFP linha da mosca transgênica em que o nível de expressão de GFP em ISC e EBS é inerentemente diferente e permanece diferente ao longo envelhecimento. Uma abordagem semelhante foi descrita para o isolamento de neuroblastos larvais e neurónios ^18,19. Intestino médio de jovens e velhos esg -Gal4, moscas UAS-GFP foram dissecados e dissociado em células individuais. As células foram, então, classificados por células positivas para GFP utilizando células activadas por fluorescência (FACS). Curiosamente, o classificados GFP-positiva cvaras distribuídas em dois picos distintos com base em intensidade de fluorescência da GFP (GFP ^alta e GFP ^baixo). Além disso, a distribuição de células positivas para GFP em dois picos também correlacionados com o tamanho das células: as células que exibiram baixa intensidade de GFP foram pequenos e menos granular enquanto que as células com uma elevada intensidade de GFP foram maiores e mais granular. Esta observação sugere que as ISC menores poderiam ser distinguidos dos EBs maiores, usando FACS com base na intensidade GFP e escolhendo dispersão adequada para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) configurações. Curiosamente, os dois picos permaneceu distintamente separados durante o envelhecimento. Além disso, a razão entre os dois picos alterada de uma forma que reflecte a imagem de marca do intestino médio do envelhecimento acima mencionados: a saber, que o número de grandes, misdifferentiated EBs aumenta ao longo do tempo. A partir dessas constatações, concluímos que, classificando para as células GFP positivas usando as configurações dos parâmetros FACS adequadas podemos enriquecer a ISC e EBs em qualquer ponto do tempo durante o envelhecimento.

Em resumo, apresentamos uma estratégia FACS que permite aos pesquisadores para enriquecer por duas populações de células diferentes, ISC e EBS, de intestino médio de Drosophila de qualquer idade e isolar essas células para posterior análise, tais como seqüenciamento próxima geração. Este método permite poderosa para o estudo dos mecanismos moleculares endógenos que são inerentes ao envelhecimento em uma população enriquecida de células estaminais ou progenitoras. Os dados obtidos a partir destes estudos, sem dúvida, facilitar a identificação de moléculas que são conservadas em envelhecimento significativo entre as espécies.

Protocolo

NOTA: Se este protocolo é utilizado pela primeira vez para isolar ISC por FAC triagem, os seguintes controles são obrigatórios, a fim de definir os parâmetros inicialmente FACS corretamente: As células dissociadas de tipo selvagem (por exemplo w ¹¹¹⁸⁾ intestino médio de Drosophila sem Sytox. As células dissociadas de tipo selvagem (por exemplo w ¹¹¹⁸⁾ intestino médio Drosophila com Sytox (ver Passo 3.6). As células dissociadas de intestino médio do esg -Gal4, linha de fly UAS-GFP sem Sytox.

1. Preparação de Soluções e Loiça para Gut Dissection

1. Prepare 4-6 frascos contendo cada uma 40 feminino voa do esg -Gal4, linha de fly UAS-GFP.
2. A partir de uma solução estoque 10x PBS preparar 500 ml de 1x PBS (1,8 mM de NaH ₂ PO _4? H ₂ O, 8,4 mM de Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ O ·, 175 mM de NaCl, pH ajustado a 7,4).
3. Prepare um 3.5Solução% de agarose em 1x PBS (3,5 g de agarose de grau de electroforese em 100 ml de PBS 1x). Para preparar as placas de dissecação vertendo esta solução em placas de Petri (diâmetro de 8,5 centímetros) para cobrir o fundo. A camada de agarose evita danificar as pontas das pinças durante o procedimento de dissecção. Após o gel ter solidificado armazenar as placas de dissecção a 4 ° C.
4. Preparar 300 ml de 1x PBS + BSA a 1% fresco antes de dissecação e colocar a garrafa em gelo ou a 4 ° C.
5. Ligue centrífuga e deixe esfriar a 4 ° C.
6. Inflamar as pontas de 2 pipetas de Pasteur de vidro para suavizar as bordas.
7. Limpo dois pares de pinças e uma lâmina de barbear com etanol a 70%.
8. Coloque 4-6 1,5 ml microtubos de recolha de intestino médio dissecados em gelo.

2. Preparação do Trato Gastrointestinal e Dissecção do intestino médio

1. Anestesiar moscas de um frasco (40 moscas) com CO ₂ em uma cama fly standard, decapitar todosvoa usando uma lâmina de barbear e transferi-los para o prato dissecção. Pour solução fria / 1% de BSA em PBS 1x o prato de dissecação para cobrir o gel de agarose. As moscas irá flutuar.
2. Agarre o abdômen da mosca com um par de fórceps, mantendo o tórax com o outro par de fórceps. Separe o tórax do abdômen. O intestino será visível eo estômago / produção, poderiam provavelmente ser ainda ligado ao tórax.
3. Agarre o intestino e puxe-o para fora do tórax. Para desdobrar o intestino, pegue a safra e puxar o intestino ligeiramente anteriormente longe do abdômen.
4. Agarrar a extremidade posterior do abdómen com um par de pinças e a borda da cutícula aberta anteriormente com o outro par de fórceps. Tenha cuidado para não destruir o tecido do intestino saliente. Puxar a extremidade posterior afastado para quebrar a cutícula e continuar posteriormente puxando muito suavemente até todo o intestino ter sido puxado para fora da cavidade abdominal. A cultura pode ter que ser removido de antemão, se for muito grande para caberatravés da cavidade do corpo.
5. Retire o foregut, túbulos de Malpighi, hindgut e ovários deixando o intestino médio nua.
6. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, a transferência do lote de intestino médio dissecados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo solução de BSA frio 1x PBS / 1% e manter o tubo em gelo. As amostras devem ser processadas no prazo de 2 horas.
7. Após a dissecação de um lote inteiro é completa, lavar o prato dissecção com água bidestilada para lavar esquerda sobre detritos. Comece dissecando o próximo lote de intestino médio (Repita os passos 2,1-2,7). Dissecar tantos lotes quanto possível dentro de 2 horas, em seguida, vá para a Etapa 3.1.

3. A digestão do tecido Gut a colheita de células para FAC Sorting

1. Remover a solução de BSA a 1 x PBS / 1% dos intestinos médio e adicionar 500 ul de 0,5% de solução de Tripsina-EDTA a cada amostra.
2. Bem Vortex durante 20 segundos e incuba-se as amostras por agitação suave / rodando a 20 rpm à temperatura ambiente durante 25-30 min.
3. Vortex novamente após cerca de 30 min e deixar o dissipador de tecido do intestino médio intacta para a parte inferior do tubo. Retire cuidadosamente as células que estão em suspensão com uma pipeta Pasteur de vidro flambado e filtrá-los através de um nylon de 35 mm de malha em um fresco 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
4. Rodar as células para baixo a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. É de notar, quando se inicia o resumo, um agregado de células pode não ser visível no começo, mas vai tornar-se visível como o tecido digest progride.
   1. Transferir cuidadosamente a solução de tripsina de volta para o tubo de amostra original que contém o tecido do intestino médio que permanece intacta. Evitar a transferência de muitas células a partir do sedimento.
   2. Gentilmente re-suspender o sedimento celular em 400 ul de 1x PBS frio / BSA a 1%. Manter os tubos de microcentrífuga contendo as células dissociadas sobre gelo e cobrir os tubos com folha de alumínio para proteger as células da luz.
   3. No vortex a solução de tripsina contendo o tecido do intestino médio intacta remanescente e colocar novamente as amostraspara o balancim durante mais 30 min à temperatura ambiente.
5. Repita os passos 3.3 a 3.4.3 até que todo o tecido do intestino médio foi digerido. Combina-se as células dissociadas a partir de todos os tubos de microcentrífuga para um tubo de microcentrífuga. Isto pode exigir um passo de centrifugação em 3.4, já que o volume de todas as suspensões de células combinadas podem exceder 1,5 ml. Manter a suspensão de células sobre gelo e proteger as células da luz.
6. Rodar as células dissociadas para baixo a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente remover tanto quanto possível o sobrenadante deixando cerca de 50-100 ul de solução de BSA a 1 x PBS / 1% no tubo de microcentrífuga. Suavemente ressuspender as células dissociadas em 800 ul de 1x PBS / BSA a 1% contendo Sytox (1: 20.000).
7. Transferir a suspensão de célula para a 5 ml tubo Falcon de fundo redondo, filtrando as células através de uma tampa de pressão filtro de células (malha de nylon de 35 m). Sempre manter as amostras de células em gelo e protegida da luz. As células estão agora prontos paraser classificado.
8. Pipetar 600 ul de solução RNAlater em cada tubo de microcentrífuga em que as células serão classificados para subsequente isolamento de ARN. Para outras aplicações a jusante as células podem ser coletadas em uma solução diferente, por exemplo, em PBS estéril.

4. FAC Sorting a isolar células-tronco intestinais

1. Ligar o instrumento de citometria de fluxo de, pelo menos, uma hora antes da triagem. Certifique-se de que o sistema fluídico está livre de bolhas de ar.
2. Escolha o tamanho do bico 70 mm para injetar as células na corrente de fluido do invólucro.
3. Ajustar a amplitude da corrente de fluido do núcleo de modo a que o valor de intervalo corresponde ao valor de referência (6-7, quando se utiliza o injector de 70 mm). Deixe o fluxo de fluido núcleo estabilizar antes de começar a classificar.
4. Siga esta ordem ao inicialmente definir os parâmetros para a classificação:
   1. Coloque as células dissociadas obtidas de tripas de tipo selvagem. Em primeiro lugar, ajustar as voltagens FSC e SSCpara traçar as células no centro do diagrama de dispersão. Em segundo lugar, ajustar a tensão FITC (GFP), de modo que todas as células estão representados abaixo de 10 ² no eixo-x logarítmica. A definição do parâmetro FITC define o limite para autofluorescência.
   2. Carregar as células dissociadas obtidas a partir de vísceras de tipo selvagem com Sytox adicionado. Ajuste o valor Blue Pacific tensão e portão para identificar e células de estar separadas de células, Sytox positivos mortas no Blue Pacific vs. FSC-A gráfico de dispersão.
   3. Carregar as células dissociadas obtidas a partir do esg -Gal4, linha mosca UAS-GFP sem Sytox e ajustar a tensão de FITC para assegurar que todas as células positivas para GFP são traçados no gráfico de dispersão.
5. Coloque as células dissociadas obtidos a partir da ESG -Gal4, linha de fly UAS-GFP com Sytox acrescentou. Ajuste o valor Blue Pacific tensão e portão para identificar e células de estar separada do morto, células Sytox-positivos (portão P1).
   1. Defina o SSC-A e FSC-A porta para identificar o GFPcélulas positivas (com base no histograma) como determinado pelo tamanho e granularidade (porta P2).
   2. Defina o portão FSC-H e FSC-W para identificar e excluir dobletos células GFP positivas com base em seu tamanho (P3 Gate).
   3. Defina o SSC-H eo portão SSC-W para identificar e excluir dobletos células GFP positivas com base em sua granularidade (P4 Gate).
   4. Use portão P4 para descrever as células GFP positivas em um histograma que mostra o número de células (contar) vs. intensidade GFP. Dois picos distintos de células GFP positivas será visível. Criar um portão para cada pico (portões P5 e P6). Portão P5 contém a população de células que é enriquecido para ISC e podem ser classificados separadamente a partir das células em portão P6.
   5. Back-gate em um gráfico de contorno para verificar que as duas populações de células distintas GFP positivas conter células vivas (compare com portão P1) e células do tamanho correto (compare com portão P2).
6. Ordenar as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contém 600 & #181; l de solução RNAlater. A classificação é feita com um caudal baixo (max. 2.0, 70 bico de um, 1.000 eventos / seg, 70 psi) e empregando uma de duas vias pureza espécie.
7. Após a triagem é completa, vortex imediatamente as células classificadas brevemente e manter os microtubos em gelo até prosseguir com isolamento de RNA ou outras aplicações a jusante.

Resultados

Para obter entre 50,000-100,000 células do FAC triagem, entre 160 e 200 intestino médio precisa ser dissecado. Obviamente, este é o passo mais demorado de todo o processo. Os desenhos animados mostrado na Figura 1A ilustra as principais etapas de dissecção intestino, que são descritos em detalhe no protocolo fornecido aqui. Este procedimento pode ser modificado individualmente. Um dissecados, todo tracto gastrointestinal é mostrado na Figura 1B.

Quando todo o tecido do intestino médio foi digerido, continuar imediatamente com FAC triagem. Seguindo a estratégia de gating descrito no protocolo permite a identificação bem sucedida e de triagem de uma população de células enriquecidas em ISC e para CEs a partir de jovens (Figura 2) e do intestino médio de idade (Figura 3). O portão P1 está definido para incluir apenas as células vivas e saudáveis ​​para deixar de fora as células mortas. Células que a trama acima de 10 ³ no logarítmica y-axé quando se usa o canal Blue Pacific são definidas como células mortas. Os pontos que a trama inferior a 40 sobre o eixo x (FSC-A) são principalmente os detritos e, por conseguinte, também são excluídos (Figura 2A). No gráfico de dispersão do SSC-A vs. FSC-A, as células são distribuídos com base em seu tamanho e granulosidade. Para uma melhor resolução, as células são colocadas no diagrama de dispersão, como mostrado na Figura 2B, ajustando a voltagem do tubo fotomultiplicador (PMT). Nos diagramas de dispersão FSC-H vs. FSC e SSC-W-H-W vs SSC células individuais são separados a partir de agregados e dupletos com base no tamanho (Figura 2C) e com base na granularidade (Figura 2D). Quando descrevendo as células incluídas no portão P4 em um histograma, a separação distinta de GFP-negativo, GFP ^baixo (P5 gate) e células GFP ^elevadas (portão P6) é visível (Figura 2E). As células que apresentam menor intensidade GFP são pequenos e menos granular e representam ISC. As células que exibem maior GFP intensity são maiores e mais granular e representam EBS. Transcriptase Reversa (RT) -PCR para Dl no ADNc sintetizado a partir de ARN de células de cada população GFP-positiva (portões P5, P6), revelaram que o sinal Dl é na verdade mais forte, mais pequenas nas células GFP ^baixas do que na maior, GFP ^alta células (Figura 2H). As células foram então backgated e representada em gráficos de contorno para confirmar que as células GFP ^baixo (P5 portão) e GFP ^alta (P6 portão) diferem em tamanho e granularidade (Figura 2F), e ainda estão vivos (Figura 2G). De nota, os dois picos de células GFP positivas (GFP ^baixa e ^alta GFP) só pode ser bem distinto se o (GFP) canal FITC foi calibrado usando adequadamente os controlos descritos no protocolo.

A mesma estratégia foi usada quando gating triagem ISC derivados de vísceras de idade (Figura 3). Os gráficos de dispersão (Figure 3A-D), o histograma (Figura 3E) e os gráficos de contorno (Figura 3F, G) são análogos aos mostrados na Figura 2. Tal como mencionado acima, não existe nenhum marcador fidedigno para identificar ISCs no intestino médio de idade e, por conseguinte nenhum dado de RT-PCR é aqui apresentada. No entanto, a observação intrigante aqui é que os dois picos contendo GFP ^baixo (P5 portão) ou células GFP ^elevados portão (P6) permanecem claramente separadas durante o envelhecimento. Além disso, o número de células na ^{altura (portão} P6) pico GFP aumenta significativamente durante o seu envelhecimento, o qual emula claramente a acumulação de EBs conhecido misdifferentiated com a idade. A alteração da razão das duas populações de células também pode ser visto nos diagramas de dispersão (comparar Figura 3A-D, com a Figura 2A-D) e em os gráficos de contorno (comparar com a figura 3F, G com a Figura 2F, G). A partir dessas constatações Concluímos que, por triagem para GFPcélulas -positivas usando FACS podemos enriquecer a ISC e EBs em jovens e velhos intestino médio.

Para validar a pureza do ISC isolado e EB, uma análise post espécie foi realizado (Figura 4). As parcelas histograma da pós-classificadas ISC e EB (Figura 4B, C) ​​retratam purezas entre 95% e 98%.

Se a hierarquia de definir os parâmetros FACS como descrito acima é rigorosamente seguidas, as duas populações de células diferentes (GFP ^baixo, pequeno e GFP ^alta, maior) já podem ser distinguidos em um gráfico de dispersão GFP vs. FSC-A (Figura 5A). Estas duas populações de células não podem ser distinguidos se essa hierarquia é desconsiderada (Figura 5B-D).

Figura 1: (A) Um esquema das principais etapas de Dissecting intestino mosca. Em primeiro lugar, a cabeça é removido (remoção das asas é opcional) seguido de uma separação do tórax e do abdómen para expor o intestino. O intestino é subsequentemente libertado a partir da cavidade do corpo nos seguintes passos. As setas pretas mostram a progressão da dissecção, enquanto que as setas vermelhas escuras denotam a direção de extração. As linhas vermelhas na última imagem indicar os limites anterior e posterior do intestino médio. A imagem do microscópio de luz do intestino adulto fly (B). As principais regiões e características anatômicas são rotulados. As linhas vermelhas marcam os limites do intestino médio.

Figura 2:. FAC triagem estratégia para identificar e isolar ISC e EBs de jovens (7 dias) intestino médio Para melhor visualização, as células que representam ISC são destacadas em vermelho e células representando EBS são destaqueem azul no diagrama de dispersão (AD) e nos gráficos de contorno (F, G). (A) O portão P1 é definido para excluir as células mortas, Sytox-positivos plotados acima de 10 ³ no eixo-y logarítmica. O limiar do FSC-A é de 40 a também excluir as células mortas e detritos. (B) As células foram fechado para FSC-A e SSC-A para selecionar as células de acordo com o tamanho e granulosidade (portão P2). O histograma (E) foi utilizado em paralelo para identificar as células GFP positivas no FSC vs SSC-A-Um gráfico de dispersão (B). (C, D) Os diagramas de dispersão FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. SSC-W servem para remover agregados e dobletos e selecionar para singlets (P3 portão em C e portão P4 em D). (E) O histograma mostra o número de células e sua intensidade GFP. Dois picos, GFP ^baixo (P5 portão) e GFP ^alta (P6 portão) podem ser distinguidas. (F, G) As células foram novamente fechado em um gráfico de contorno para verificar que as duas células GFP-positiva distinta populatiões são do tamanho correcto (F) e contêm células vivas (G). (H) da Transcriptase Reversa (RT) -PCR para Dl no ADNc sintetizado a partir de ARN isolado a partir das células presentes no primeiro pico (P5) e portão na segundo pico (portão P6), respectivamente. Mais Dl expressão pode ser detectada em células presentes no portão P5 P6 vs portão. Tubulin serviu como um controlo de carga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: FAC triagem estratégia para identificar e isolar ISC e EB do intestino médio de idade (60 dias) Para melhor visualização, as células que representam ISC são destacadas em vermelho e células representando EBs são destacadas em azul nos gráficos de dispersão (AD) e no. gráficos de contorno (F, G). (A) O portão P1 é definido para excluir as células mortas, Sytox-positivos plotados acima de 10 ³ no eixo-y logarítmica. O limiar do FSC-A é de 40 a também excluir as células mortas e detritos. Digno de nota, o aumento dependente da idade em células GFP positivas maiores já é óbvia neste enredo. (B) As células foram fechado para FSC-A e SSC-A para selecionar as células de acordo com o tamanho e granulosidade (portão P2). O histograma (E) foi utilizado em paralelo para identificar as células GFP positivas no FSC vs SSC-A-Um gráfico de dispersão (B). (C, D) Os diagramas de dispersão FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. SSC-W servem para remover agregados e dobletos e selecionar para singlets (P3 portão em C e portão P4 em D). (E) O histograma mostra o número de células e sua intensidade GFP. Dois picos, GFP ^baixo (P5 portão) e GFP ^alta (P6 portão) podem ser distinguidas. De nota, a ^elevada população GFP celular contendo células maiores aumentou in número durante o envelhecimento. (F, G) As células foram back-fechado em um gráfico de contorno para verificar que as duas populações de células distintas GFP positivas são do tamanho correto (F) e conter células vivas (G). Por favor, clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4:. A análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza do ISC isolado e EBs células (A) GFP-positivas dos jovens (7 dias) e idade (60 dias) intestino médio foram FAC classificadas e as parcelas do histograma mostrar sua distribuição em dois picos com base na intensidade GFP. (B) A análise pós espécie demonstra a pureza das ISC isoladas de jovens e velhos intestino médio, que é> 97%. (C) A análise post tipo de ordenado EBs de jovens e velhos intestino médio mostra uma pureza de> 95%. As pequenas impurezas podem resultar de supressão de fluorescência ou células GFP expressando danificadas mecanicamente causados ​​pela re-classificar as células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Exemplos de gráficos de dispersão que mostram dados FACS sub-ótimos, o que é visto quando os parâmetros FACS não foram definidas corretamente (A) perfil Representante FACS de todas as células quando os parâmetros FACS foram definidas corretamente com base nos controles descritos no protocolo.. A população de células que contém ISC está circulado em vermelho e a população de células que contém EBS é circulado em azul. As células circulados em verde são as células mortas que têm um autofluorescência mais forte em comparação comcélulas vivas, que são representados graficamente abaixo de 10 ³ no eixo-y logarítmica. (B) O gráfico de dispersão representa um resultado típico obtido quando o instrumento FACS não foi calibrado. Não células GFP positivas são detectados. (C) Se o FSC não está definido corretamente, as diferentes populações de células GFP positivas não são detectados. (D) Se o (GFP) canal FITC não é ajustado corretamente, a maioria dos GFP As células positivas para ser classificados não estão representados no gráfico de dispersão, mas sim ao longo da borda superior da trama. Além disso, no enredo mostrado aqui, o limite para autofluorescência não foi ajustado, portanto, células que parcela acima de 10 ² no eixo y-logarítmicas são realmente autofluorescent e poderia ser confundido como células GFP positivas.

Discussão

O protocolo apresentado descreve um método para isolar ISC de jovens e adultos de intestino médio de Drosophila, que podem posteriormente ser utilizados para as análises moleculares como a próxima geração de sequenciamento. FAC triagem da população de células GFP-positivo do esg -Gal4, linha de fly UAS-GFP já foi atingido por vários grupos ^21,22. No entanto, até agora a presença dos dois picos distintos de células GFP positivas foi ou esquecido ou desvalorizado. Mostra-se que esta separação não só representa duas populações diferentes de tipos de células (ISC e EBS), mas também que os dois picos de células positivas para GFP permanecer nitidamente separada durante o envelhecimento. Esta observação é altamente relevante e valiosa para os pesquisadores interessados ​​em estudar as células-tronco ou progenitoras durante o envelhecimento. Isolamento de ISC do intestino médio de idade tem sido dificultada pelo facto de que não há uma combinação marcador molecular para identificar um ISC do intestino médio em idade. O único marcador que unambiguously identifica ISC num midgut velho é fosfo-histone3 (PH3), uma vez que ISC são as células em divisão apenas no intestino médio ^12,13. No entanto, PH3 é um marcador inadequados para isolar ISC já que o número de divisão de células-tronco em qualquer ponto do tempo é muito baixo, a fim de obter uma quantidade razoável de ISC para análises posteriores. A ESG linha da mosca -Gal4, UAS-GFP é a linha de fly mais comum usado pelos pesquisadores que estudam ISC função, manutenção e diferenciação. O nosso conhecimento atual sobre a regulação molecular da ISC homeostase é baseada em estudos em que moléculas específicas e vias de sinalização foram manipulados (revisto em ^7). Por isso, ainda não temos conhecimento sobre as alterações moleculares endógenos que ocorrem durante o envelhecimento. O método aqui descrito fecha essa lacuna e baseia-se no facto de ISCs podem ser isoladas com base na sua dimensão, granularidade e GFP intensidade do intestino médio do adulto em qualquer ponto de tempo durante o envelhecimento.

Enquantoestabelecer e otimizar este método temos encontrado os seguintes passos para ser crítico para um resultado confiável. Cerca de 200 coragem precisa ser dissecado, a fim de obter uma boa quantidade de ISC para FAC classificação. A velocidade de dissecção é crucial e depende da prática do indivíduo. Uma pessoa treinada pode dissecar 40 coragem dentro de 20-30 min. Desde GFP também se expressa nos túbulos de Malpighi na ESG -Gal4, linha de fly UAS-GFP, é essencial para remover completamente os túbulos de Malpighi do intestino médio. Os intestinos médio dissecados deve ser mantido num ambiente frio, para evitar a degradação do tecido e reduzir a actividade de RNAse no tecido. Portanto, os intestinos médio dissecados deve ser transferida a partir do prato de dissecação em tubos de microcentrífuga contendo solução fria / 1% BSA PBS 1x após um máximo de 20-30 min e mantido em gelo. No entanto, os intestinos médio dissecados não devem ser deixadas em gelo durante mais de 2 horas antes de se iniciar a dissociação de tecidos com tripsina. O mais efficiabordagem ent é dissecar tantos lotes de moscas possível dentro destes 2 horas, em seguida, começar a tripsina digerir para esses lotes. Caso sejam necessárias mais intestino médio, podem ser dissecados nos tempos de incubação da digestão de tripsina.

Apesar de tripsina é uma enzima muito potente e pode ter efeitos prejudiciais sobre as células, ainda obtido vida suficiente, as células saudáveis ​​para posterior triagem FAC. O passo chave do nosso procedimento que permite o isolamento de células intactas é que as células dissociadas são removidos da solução de tripsina a cada 30 min. Se os intestinos médio dissecados são incubadas durante 2 horas num ½ tripsina contendo solução à temperatura ambiente, observou-se um aumento de 20-30%, em células Sytox-positivas mortas. Deve-se salientar que a solução de tripsina usamos contém EDTA. A presença de EDTA provavelmente facilita a desintegração de tecidos por quelação de cálcio e magnésio iões necessários para a função adequada de moléculas da matriz extracelular.

As etapas mais cruciais com sucesso à sorte ISC de jovens e velhos coragem são as configurações iniciais adequadas dos FACS e parâmetros de propagação usando os controles descritos e seguir uma hierarquia de classificação específica. Realizamos a FAC triagem em um ARIA II Fluxo Cytometer (software FACSDiva). É importante que o instrumento é ligado, pelo menos, uma hora antes da triagem para aquecer os lasers. É de notar, quando FAC triagem das ISC é realizada pela primeira vez, os parâmetros para a classificação e para a necessidade de compensação a ser definido usando os controles acima mencionados: (1) células dissociadas de tipo selvagem (por exemplo w ¹¹¹⁸⁾ intestino médio de Drosophila sem adição de Sytox - a definição desse parâmetro (Passo 4.4.1) impede triagem células com base em sua autofluorescência; (2) células dissociadas de tipo selvagem (por exemplo w ¹¹¹⁸⁾ intestino médio de Drosophila com Sytox acrescentou - a definição desse parâmetro(Passo 4.4.2) permite separar mortos a partir de células vivas (células mortas têm um alto autofluorescência e pode contaminar as células GFP positivas ordenados); (3) a partir de células dissociadas intestino médio do esg -Gal4, linha de fly UAS-GFP sem Sytox - a definição desse parâmetro (Passo 4.4.3) garante que todas as células GFP positivas são plotados no gráfico de dispersão. Se esses parâmetros não estão definidos corretamente, a população de células classificada provavelmente irá conter células mortas e detritos (Figura 5B, C), muitas células GFP positivas serão perdidas (Figura 5D) e os dois picos distintos de células GFP positivas como visto no histograma (Figura 2E e figura 3E) não irá ser detectado. Uma vez que os FACS e parâmetros de propagação foram criados, o instrumento está calibrado e pronto para ordenar células do esg -GAL4, linha de fly UAS-GFP. Uma vez que estes parâmetros podem ser salvos, todos os futuros triagem sessões para ISC e EB do esg -GAL4, UAS-Linha da mosca GFP pode começar a partir do Passo 4.5. Embora a escolha do modo de "pureza" e executar um de dois sentidos pureza tipo diminui o número de células classificadas, que permite uma triagem mais elevada restringência (Passo 4.6 e a Figura 4B, C). De nota, a vantagem de utilizar Sytox em vez de iodeto de propídio para marcar as células mortas é que há apenas um transbordamento baixo para o canal FITC (GFP), o que torna mais fácil para compensar o transbordamento.

O nosso método de enriquecer para ISC e EB, respectivamente, baseia-se na classificação de células de acordo com diferentes níveis de expressão da GFP. Pode ser que, durante o envelhecimento misdifferentiated EBS também expressam GFP a um nível mais baixo e pode ser confundido com ISC. No entanto, uma vez que as células separadas também diferem em tamanho e granularidade, acreditamos que a nossa estratégia de classificação é o mais adequado para esta data para enriquecimento em ISC e EBS. Além disso, sabe-se que as células do intestino médio em um envelhecimento de retenção identidade ISC tem um pequeno núcleo ¹⁵. Para obter mais clareza sobre a identidade das células separadas, pode-se classificar as células de uma linhagem transgênica mosca que carrega esg -GAL4, UAS-GFP e uma repórter transgene sinalização Notch. Desde Notch tem sido mostrado para ser activo apenas nos EB ^12,13, ISC isolado a partir de uma nova intestino médio seria negativa para o repórter Notch, ao passo que os CEs seria positiva para o repórter Notch. No entanto, durante o envelhecimento de sinalização Notch torna aberrante no tecido do intestino médio. Por conseguinte, tem de ser testado se esta montagem experimental é de facto mais fiável para distinguir entre ISC e EB isolado a partir de um intestino de idade.

Nós já usou essa abordagem para análise de transcriptoma comparativo de ISC de jovens e velhos intestino médio e identificou uma série de fatores que são diferencialmente regulados durante o envelhecimento (unpub. Observ.). Além disso, este método permite a análise de diferenças na expressão genética entre ISC e o EB. Esse tipo de investigaçãos irá fornecer informações sobre as alterações moleculares iniciais que ocorrem como uma célula entra no processo de diferenciação. Além disso, o isolamento da EBS durante análises de envelhecimento e subsequentes irá lançar luz sobre as alterações moleculares de misdifferentiation induzida por idade. Além disso, este método pode ser combinado com outras técnicas de genética em Drosophila utilizadas para estudar a função de genes. Em resumo, este método oferece uma abordagem imparcial para investigar características moleculares e alterações de ISC CEs e durante o envelhecimento. Esta é uma valiosa ferramenta que irá facilitar a exploração de mecanismos de envelhecimento em células estaminais e progenitoras adultas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting