Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Resumo

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Resumo

Potencial de superfície é uma característica física geralmente negligenciado que desempenha um papel dominante na adesão de microorganismos para substrato superfícies. Microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) é um módulo de microscopia de força atômica (AFM), que mede a diferença de potencial entre as superfícies de contato na escala nano. A combinação de KPFM com a AFM permite a produção simultânea de potencial de superfície e mapas topográficos de amostras biológicas, tais como células bacterianas. Aqui, nós empregamos KPFM para examinar os efeitos do potencial de superfície sobre a adesão microbiana em superfícies medicamente relevantes, tais como aço inoxidável e ouro. Mapas de potencial de superfície revelou diferenças de potencial de superfície para membranas microbianas em diferentes substratos de materiais. Um gráfico passo-a altura foi gerado para mostrar a diferença de potencial na superfície uma área de fronteira entre a superfície do substrato e microrganismos. Alterações no potencial de membrana da superfície celular têm sido relacionados com a mudanças no metabolismo celular e a motilidade. Portanto, KPFM representa uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para examinar as alterações da superfície microbiana potencial de membrana sobre a adesão a várias superfícies do substrato. Neste estudo, nós demonstramos o procedimento para caracterizar o potencial de superfície de células de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina USA100 individuais em aço inoxidável e ouro usando KPFM.

Introdução

Os biofilmes produzidos nas superfícies dos equipamentos e em feridas cutâneas apresentam um problema para a indústria médica como biofilmes são recalcitrantes à remoção e pode levar a um aumento das taxas de transmissão da doença e resistência aos antimicrobianos. Anexo é o primeiro passo na formação de biofilme e é a etapa mais crítica, devido à sua reversibilidade ^1-3. Características de superfície do substrato desempenham um papel crucial na adesão microbiana. Factores tais como a dureza da superfície, a porosidade, rugosidade, hidrofobicidade e têm sido mostrados para efectuar a adesão microbiana; No entanto, pouca investigação examinar o potencial papel da superfície do substrato (SP) na adesão microbiana tem sido feito ^4,5. Superfícies carregadas negativamente impedir a penhora de esporos de Bacillus thuringiensis a mica, silício e ouro ^6. Alterações no potencial da membrana celular são indicativos de alterações na adesão celular e a motilidade ^5,7. Tem sido observado que hom electricamentesuperfícies ogeneous mais facilmente promover a adesão microbiana ^5. Caracterizar o potencial de superfície de bactérias à escala nanométrica pode proporcionar uma nova maneira de entender a cinética de adesão de bactérias a superfícies diferentes, e assim pode ajudar no desenvolvimento de estratégias anti-incrustação biológica. Ao contrário de outros métodos utilizados para caracterizar a cinética electro de bactérias, como eletroforética espalhamento de luz, o potencial zeta, e determinação do ponto isoelétrico, microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) permite a análise de células individuais em vez de culturas inteiras ^11/08. Isso é benéfico quando se quer comparar célula-célula ou biofilme características elétricas com alta precisão e exatidão.

KPFM é um módulo de microscopia de força atômica (AFM). AFM foi desenvolvido como um resultado direto do microscópio de tunelamento (STM) ^12. As imagens publicadas pela primeira vez usando STM foram feitas por Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer em 1982 ¹² . Sua invenção foi capaz de resolver estruturas atômicas por raster digitalizando uma ponta condutora afiada sobre uma superfície condutora de ar. As implicações de conseguir imagens de alta resolução biólogos que rapidamente tentaram usar STM a imagem amostras secas de DNA, proteínas e vírus ¹² animado. STM também pode ser feito de líquidos usando pontas de prova especializados ^13. Isto foi demonstrado por Lindsay et ai., Que utilizado STM e AFM para moléculas de ADN da imagem em 10 mM de HClO ₄ e na água, em eléctrodos de ouro ^13. KPFM foi demonstrada na determinação dos potenciais de superfície de análise de DNA e proteína ^{de 25} e biomoléculas interacção com ligandos ^26.

KPFM opera através da medição da diferença de potencial contacto (CPD), entre uma ponta cantilever condutor e uma amostra de AFM idealmente condutor (Figura 1, i) ^14,15. As amostras não têm necessariamente de ser condutora (ie, sampl biológicaes). A imagiologia pode ser realizado em mica, vidro e superfícies de silício (não condutores), desde que a superfície não condutiva é fina e tem um material condutor subjacente ^6,7. O DPC é equivalente ao potencial de tensão de superfície e pode ser descrita como a diferença nas funções de trabalho entre a ponta _(tip φ) e amostra _(amostra φ), dividida pela carga do electrão negativo (- e). Quando uma ponta de AFM condutor é levado para perto de uma superfície da amostra (separados por uma distância d), uma força electrostática (F _es) é gerado, devido à diferença nas energias de Fermi (Figura 1, ii, a) ^15. Neste ponto, as energias de vácuo da ponta e amostra (E _v) estão em equilíbrio e alinhados. Ao trazer a extremidade mais perto da superfície da amostra, a superfície da ponta e a amostra entrem em contacto eléctrico e agir como capacitores de placas paralelas (Figura 1, b, ii ) ^14,15. No ponto, as energias de Fermi superfície da ponta e da amostra se alinham, atingindo um equilíbrio de estado estacionário (Figura 1, ii, b). A ponta e amostra de superfície será cobrado e um _CPD V irá formar devido a uma diferença de funções E _v 's e de trabalho. A F _es age na área de contato elétrico devido ao _CPD V formado. Esta força é subsequentemente anulada através da aplicação de um V _DC externa da ponta que tem a mesma grandeza que o _DPC V formado (Figura 1, ii, c). Esta tensão de CC aplicada elimina carga de superfície na área de contacto eléctrico, e a quantidade de V _CC necessária para eliminar as _es de F V _CPD é igual à diferença nas funções de trabalho entre a sasuperfície mple e gorjeta ^{de 15.} Deve notar-se que a função de trabalho da ponta é conhecido e é fornecida pelos fabricantes. Em todos os métodos KPFM, uma tensão alternada _(CA V, cerca de 100 - 500 mV) é também aplicado na ponta, a fim de gerar forças eléctricas oscilantes entre a ponta ea amostra ^14. Isto proporciona uma melhor resolução ao medir mudanças na V _CPD e / ou F _es. Neste contexto, as alterações na frequência e amplitude de oscilação eléctrica pode ser corrigido por V _DC, e mapas de potencial de superfície pode ser gerado. Os dados de áreas específicas destes mapas pode ser ainda analisada a fornecer informações elétrica sobre características topográficas específicas.

KPFM pode ser operado em três modos: (1) Modo de levantamento, o modo (2), modulação de amplitude (AM), e modulação de frequência (FM) de modo ^14,16 (3). Modo de elevação foi o inc inicialarnation de KPFM. Elevador modo baseia-se num método de duas passagens em que um ponta com oscilação é arrastado através da superfície para se obter uma imagem topográfica. Para o segundo passe a ponta é levantada uma distância pré-definida acima da amostra (10-100 nm) e digitalizada para o outro lado da mesma área. Devido a este método de duas passagens, o modo de elevador, em comparação com AM- e FM-KPFM, leva mais tempo para aquisição de imagem. Aumentando a ponta para fora da superfície garante que apenas longo alcance F _es é medido. Além disso, conversas cruzadas entre topografia e medições de superfície potenciais é desacoplada à custa do aumento da resolução lateral e sensibilidade.

AM-KPFM melhora a resolução lateral e sensibilidade usando dual-frequências para medir simultaneamente topografia da amostra e potencial de superfície (varredura de uma passagem) ^14. No modo de AM, o braço de suporte é oscilado mecanicamente, geralmente 5% abaixo da sua primeira frequência de ressonância (f _0), e electricamente oscilado (through um _AC V) em sua segunda frequência de ressonância (f _1). Mudanças na amplitude de f _0, para a geração de dados topográficos, enquanto as mudanças na amplitude de f _1, devido a mudanças na F _es e V _CPD, fornecer dados de medição do potencial de superfície. f ₀ e f ₁ do cantilever são separados por freqüências e energias significativas que sinalizam cross-talk é minimizado ^14. A caixa eletrônica de cabeça (HEB) da AFM separa os dois sinais para dar tanto topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente em uma varredura. FM-KPFM melhora a resolução ainda mais longe do AM-KPFM em superfícies biológicas ^14. FM-KPFM funciona de forma diferente do que o AM-KPFM no que mede a evolução gradientes força eletrostática, em vez de força eletrostática (F _es) ^15. Como modo de AM, FM utiliza modo dual-frequências e um singlmecanismo de varredura de e-pass para obter topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente ^14. No modo FM, o cantilever é mecanicamente oscilaram em torno de f ₀ e eletricamente oscilou em uma freqüência modificado baixo (f _mod, tipicamente 1-5 kHz). Após interações eletrostáticas, f ₀ e f mix _mod para produzir faixas laterais de f ₀ ± f _mod. Estas bandas laterais são muito sensíveis às mudanças na força electrostática, e pode ser separado a partir de f ₀ HEB através da AFM. Desde FM-KPFM mede as alterações em gradientes de força electrostática, o dicas forma ápice e sua manutenção / integridade desempenhar um papel crítico na superfície global potencial resolução ^{14, 15.} Superfície potencial resolução com AM e modos de FM estão na gama de 1 nm, ¹⁴ lateralmente ^-16. Deve notar-se que KPFM imagiologia pode ser feito em líquidos não polares, e, mais recentemente, tem sido mostrado para ser feito em (<10 mM) líquidos polares de baixo iónico (emKPFM modos de malha aberta, que não requerem uma reacção de polarização, obviando a aplicação de uma polarização DC), tais como água MilliQ; no entanto, KPFM imaging ainda tem de ser feito em células vivas em soluções polares ^17-20. Desafios adicionais associados com SP imaging em líquido é que as soluções comumente usado para manutenção de células (ou seja, tampão fosfato salino) têm altas concentrações de íons móveis, o que levaria a reações faradaica, dinâmica de carga induzida por viés e difusão do íon / redistribuição ^20. Assim, para esta experiência, as medidas foram tomadas a partir de células secas por MRSA e mortos em superfícies em aço inoxidável funcionalizadas com poli-L-lisina de aço e ouro sob condições ambientes. A imagiologia pode ser realizado em condições de ar ou de vácuo, em amostras biológicas que foram previamente secos ou imobilizados em superfícies ^20. Condições de umidade também foram mostrados para afetar imagem KPFM de superfícies ^6.

Neste estudo, foram empregados FM-KPFMe AFM para examinar o papel de SP sobre a penhora de resistente à meticilina Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) para superfícies de aço inoxidável e ouro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA foi recentemente ganhou status como um multi-resistente (MDR) "superbactéria", devido à sua resistência selecionados naturalmente a muitos antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas ^21. Infecções MRSA são agora mais desafiadora, difícil e formidável de tratar, que conduz à utilização de agentes antimicrobianos mais duras, tais como a vancomicina ou oxazolidinonas que possuem níveis mais elevados de toxicidade em seres humanos e, portanto, não podem ser utilizados como tratamentos de longo prazo ^22. O aço inoxidável foi escolhida devido à sua relevância médica e uso comum como um material em agulhas hipodérmicas, comadres, maçanetas, pias, etc. O ouro foi usado como um metal comparativa. FM-KPFM foi utilizado para examinar se microbiana membrana SP muda mediante adesão aos substratos.

Protocolo

1. Preparação de material de vidro e Culturas

1. Antes de prosseguir com esta experiência, preparar agar sangue 5% de ovelha (SBA) placas para o cultivo de MRSA. Incubar as placas SBA durante 24 horas à temperatura de 37 ° C. Após este tempo,, colónias individuais bem isoladas deve estar presente para ser utilizado para as inoculações subsequentes em meios líquidos. Loja estrias SBA placas com colónias isoladas a 4 ° C durante 1 - 2 meses.
   NOTA: placas de agar de sangue de ovelha-se em embalagens contendo pré-fabricados entre 20-25 placas com base no fabricante, e consistem tipicamente numa base de agar de tripticase de soja com adição de 5% w / v de sangue de ovelha.
2. Adicione 500 ml de caldo de soja tríptica (TSB) suplementada com 1% de glucose e 0,1% de NaCl. Depois disso, recolher e limpar 2 tubos de ensaio de vidro. Se tampas autoclaváveis ​​não estão disponíveis para tubos de ensaio, use uma folha de alumínio como uma tampa. Autoclave TSB e tubos de ensaio, juntamente com uma caixa de 1 ml pontas de pipeta.
3. Debaixo de uma cabine de segurança biológica ou perto de uma Bunsen queimador, pipeta de 5 ml de previamente autoclavada TSB em tubos de ensaio autoclavado. Ter cuidado para garantir que o tempo suficiente tenha sido dada para permitir que o TSB e tubos de ensaio arrefecer até à temperatura ambiente. A partir de uma placa de 5% SBA anteriormente listado, inocular uma única colônia em 6 ml de caldo TSB. Uma vai conter MRSA, e o segundo tubo de ensaio será utilizado como um controlo negativo para assegurar a esterilidade.
4. Tome tubos de ensaio TSB inoculados e colocá-los numa incubadora recíproco durante 24 horas a 37 ° C e a 200 rpm. Após este tempo, o crescimento microbiano deve ser aparente no tubo de ensaio, enquanto não houve crescimento de MRSA deve ter ocorrido no tubo de ensaio de controlo.
5. Tome 1 ml de cultura de 24 horas e pipeta em 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm.
6. Pipetar 1 mL de 6 horas de sub-cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de H ₂ O. desionizada Centrífuga, repito, e suspender novamente.

2. Limpeza e Inoculação de aço inoxidável e ouro Substratos

1. Tome aço inoxidável e discos de amostra de AFM ouro (20 mm e 10 mm de diâmetro, respectivamente) e limpar cada um dos lados com 5 ml de H ₂ O. desionizada Segurar discos de amostra no lado dominante com uma pinça e usar a mão para subdominant pipeta de 5 ml de cada lado do disco de amostra. Depois de lavar ambos os lados, discos lugar amostra num copo contendo 20 ml de _H2O desionizada, seguido por sonicação durante 1 minuto.
2. Após utilização de sonicação fórceps para remover os discos da amostra a partir do copo. Coloque os discos de modo que eles se inclinar em um ângulo de 60 ° contra a borda de uma placa de Petri aberta em uma toalha de papel. Utilizar a tampa da placa de Petri para cobrir os discos de secagem. Deixe secar totalmente os discos antes de prosseguir. O tempo de secagem pode variar entre 4-8 horas.
3. Depois de seco, use uma pinça para colocar discos de amostra em uma placa de Petri.
   1. Opcionalmente, funcionalizar as superfícies dos discos com qualquer material de amostra (por exemplo, colagénio, ácido hialurônico, nano-partículas de prata, etc.).
   2. Para esta experiência, usar poli-L-lisina para revestir a superfície do substrato. Por poli-L-lisina funcionalização, pipeta 200-400 ul de 0,1% de poli-L-lisina (em _H2O) em discos de amostras, e deixou incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa placa de Petri.
   3. Após 1 h, utilizar uma pinça para segurar o disco de amostra, e lava-se com 1 ml de H ₂ O. desionizada Deixar secar em toalhas de papel, como descrito no passo 2.2.
4. Tome 2x células re-suspenso lavados e placa 200-400 mL em discos de amostra dentro de uma cabine de segurança biológica. Se os discos de amostras são revestidas com poli-L-lisina, incubar durante 0,5 horas à temperatura ambiente.
5. Após incubação das células em discos de amostra, lavar discos amostra suavemente com 1 ml de H ₂ O. desionizada Vamos discos secar durante a noite antes de imagem.

3. KPFM Imagem

NOTA: Para esta experiência,usar um Agilent série 5500 ILM-AFM.

1. Para iniciar AFM, ligue unidade de computador, juntamente com HEB e MAC III controlador da AFM. Abra o software de imagens AFM (por exemplo, da Agilent PicoView). Certifique-se de selecionar inicialmente ACAFM ou qualquer designação correta é no AFM para geração de imagens em modo intermitente-contact.
2. Utilizando uma pinça AFM na mão dominante, e segurando o titular clipe de mola aberta com a mão subdominant, coloque um cantilever KPFM para a cabeça-peça. Tenha cuidado ao manusear e transferindo a peça de cabeça AFM para o AFM que esta unidade (pelo menos no 5500 ILM-AFM) contém a unidade de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z e direcionalidades digitalização.
   NOTA: As consolas KPFM utilizados neste caso foram Mikromasch condutora DPE (baixo ruído) cantilevers com frequências de ressonância média de 80 kHz e primavera constantes de 2,7 N / m. Cantilevers com estas frequências de ressonância e constantes de mola foram escolhidos devido a sua facilidade de uso.Cantilevers com maiores constantes de mola mais elevadas frequências de ressonância e também pode ser usado para imagiologia.
3. Arrumar com cuidado cabeça peça na AFM e ligar os fios apropriados (neste caso dois fios precisa ser conectado em: Laser e estágio motor de elevação).
4. Alinhar o laser para a ponta do braço de suporte. Algumas unidades contêm uma funcionalidade que permite a câmara de alinhamento mais fácil. Se a funcionalidade da câmera não está presente no AFM, alinhar na ponta cantilever conforme descrito a seguir:
   1. Gire o botão no sentido horário front-to-back para mover o laser overtop o chip cantilever. Quando o laser atinge o chip será bloqueado e não será mais visível. Apenas gire o botão algumas vezes.
   2. Gire o botão front-to-back sentido anti-horário até o ponto de laser reaparece. O laser é agora na borda do chip.
   3. Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser no cantilever. Como o laser passa sobre o cantilever ele vai desaparecer e reaparecer in rápida sucessão. O ponto de laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade fotodiodo mais tarde irá se sentar.
   4. Rode o botão de front-to-back para a esquerda para mover o local para baixo o cantilever para a ponta até o local no vidro fosco desaparece.
   5. Vire o-to-back frente botão no sentido horário apenas ligeiramente, a fim de posicionar o laser de modo que ele só se senta na ponta cantilever. O ponto de laser irá reaparecer no vidro fosco.
      NOTA: Este é o método de posicionamento a laser para consolas trampolim. Para cantilevers triangulares, o processo de alinhamento é um pouco diferente.
5. Uma vez que o laser está alinhado, manter o motor na fase de elevação na posição "aberto" durante 10 segundos para assegurar espaço suficiente entre o braço de suporte e fixação da amostra quando a amostra para a AFM.
6. Colocar a amostra no palco amostra KPFM. Aterrar a amostra usando um fio de cobre. Ligue os fios apropriados da AFM para o estágio da amostra. Ligue os sTage ao AFM. Na maioria dos casos, a fase é mantida no lugar através de magnetos.
7. No software AFM, ajustar o braço de suporte e, em seguida, iniciar abordagem da ponta cantilever para a amostra. Certifique-se de que o tempo de estabilização é fixado em não mais do que 10 ms, e que a velocidade de aproximação não exceder 2,0 mm / s, a fim de evitar danos na ponta.
8. Uma vez que a ponta cantilever é na superfície da amostra, selecione um tamanho da janela de imagem e área de imagem ideal. Otimizar ganhos I e P, juntamente com o set point cantilever assim que a imagem topográfica é otimizado.
   1. Depois de imagem topográfica é otimizado, ligue módulo KPFM (tanto no modo AM FM ou, aqui, use o modo FM). Deve notar-se que KPFM imagem é muito desafiante fora da janela de imagem 5 mm x 5 mm. Além disso, para a imagem latente KPFM ideal, use uma resolução de 512 x 512 com velocidades lentas de digitalização (0,02-0,05 linhas / seg).
9. Para definições FM-KPFM (não ACAFM configurações), defina o percentual de carro entre 5-10%. Defina a fr cantileverequency entre 1 - 5 kHz, com uma largura de banda de 2 kHz. Definir I e ganhos P para as definições FM-KPFM a 0,3%.
   1. Varie a largura de banda do sinal e eu e os ganhos de P entre as superfícies de amostras. Para otimizar SP imagem, ajustar ainda mais a largura de banda do sinal e eu e os ganhos P obter imagens mais favoráveis. O intervalo recomendado de ganhos I e P são 0,22-0,35%.
10. Processar e analisar as imagens coletadas KPFM usando software de processamento de pós-imagem para coletar dados SP.

Resultados

A capacidade de medir utilizando SP KPFM baseia-se no princípio de que tanto a superfície da amostra e o braço de suporte da ponta condutora são, em certa medida. Aço inoxidável e ouro agiu superfícies como condutores para que MRSA foram anexados. KPFM imagens foram tiradas de 15 células por MRSA em ambas as superfícies com 512 x 512 de resolução, e com as áreas de análise que variam de 5 x 5 mm a 10 x 10 mm. Varredura foi realizada com velocidades de linha que variam de 0,02 linhas / seg de 0,05 linhas / s...

Discussão

KPFM foi empregado como uma nova técnica para a obtenção de dados elétricos de superfície. Ele tem sido comumente usada como um método para a análise de distribuição de carga em química e só recentemente começou a ser aplicado para o estudo de sistemas biológicos na micro e nano-escala. A partir dos dados coletados, descobrimos que os micróbios não pareceu facilmente anexar para limpar superfícies de aço inoxidável e ouro, mesmo após 3 horas de incubação estática. Superfícies funcionalizadas poli-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.