Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Riepilogo

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

Potenziale di superficie è una caratteristica fisica comunemente trascurato che gioca un ruolo dominante nella adesione di microrganismi sul supporto, superfici. Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM), che misura la differenza di potenziale contatto tra le superfici a scala nanometrica. La combinazione di KPFM con AFM consente la generazione simultanea di potenziale di superficie e le mappe topografiche di campioni biologici come le cellule batteriche. Qui, ci avvaliamo di KPFM per esaminare gli effetti del potenziale di superficie su adesione microbica di superfici medicalmente rilevanti quali acciaio e oro. Potenziali mappe superficiali hanno rivelato differenze nel potenziale di superficie per membrane microbiche su diversi supporti materiali. Un grafico step-altezza è stato generato per mostrare la differenza di potenziale di superficie in una zona di confine tra la superficie del substrato e microrganismi. Variazioni cellulare potenziale di superficie di membrana sono stati collegati con il cambiamentos nel metabolismo e la motilità cellulare. Pertanto, KPFM rappresenta un potente strumento che può essere utilizzato per esaminare le variazioni di potenziale di superficie della membrana microbica su aderenza a varie superfici del substrato. In questo studio, dimostriamo la procedura per caratterizzare il potenziale superficie delle singole celle Staphylococcus aureus meticillino-resistenti USA100 su acciaio e oro con KPFM.

Introduzione

I biofilm prodotto sulle superfici attrezzature e nelle ferite cutanee rappresentano un problema per l'industria medica come biofilm sono recalcitranti alla rimozione e può portare a un aumento dei tassi di trasmissione di malattie e la resistenza antimicrobica. Attachment è il primo passo nella formazione di biofilm e è la fase più critica a causa della sua reversibilità ^1-3. Caratteristiche della superficie del substrato svolgono un ruolo cruciale sull'attaccamento microbica. Fattori quali la durezza superficiale, porosità, rugosità, e idrofobicità hanno dimostrato di effettuare attaccamento microbica; Tuttavia, poche ricerche esaminare il ruolo potenziale di superficie del substrato (SP) sulla adesione microbica è stato fatto ^4,5. Superfici cariche negativamente prevenire l'attacco di spore di Bacillus thuringiensis per mica, silicio, oro e ^6. Le variazioni del potenziale di membrana cellulare sono indicativi delle variazioni di attaccamento cellulare e motilità ^5,7. È stato osservato che hom elettricamentesuperfici ogeneous promuovere più facilmente microbica adesione ^5. Caratterizzazione del potenziale superficiale di batteri su nanoscala può fornire un nuovo modo di comprendere la cinetica adesione dei batteri alle varie superfici, e quindi possono facilitare lo sviluppo di strategie anti-incrostanti. A differenza di altri metodi utilizzati per la caratterizzazione della cinetica elettro di batteri, come dispersione elettroforetico luce, potenziale zeta, e determinazione del punto isoelettrico, Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) consente per l'esame di singole cellule invece di intere culture ^8-11. Questo è vantaggioso quando si vuole confrontare cellula-cellula o biofilm caratteristiche elettriche con elevata accuratezza e precisione.

KPFM è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM). AFM è stato sviluppato come risultato diretto del microscopio a effetto tunnel (STM) ^12. Le prime immagini pubblicate utilizzando STM sono stati fatti da Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer nel 1982 ¹² . La loro invenzione è stata in grado di risolvere le strutture atomiche da raster scansione di una punta conduttiva affilata su una superficie conduttiva in aria. Le implicazioni di ottenere immagini ad alta risoluzione biologi che rapidamente tentato di usare STM per immagini campioni essiccati di DNA, proteine ​​e virus ¹² eccitato. STM può essere fatto anche in liquidi con punte di controllo specializzati ^13. Questo è stato dimostrato da Lindsay et al., Che usava STM e AFM di immagini molecole di DNA in 10 mM HClO ₄ e in acqua, su elettrodi di oro ^13. KPFM è stata dimostrata nel determinare i potenziali superficiali di DNA e proteine ​​analisi ²⁵ e biomolecole interazione con ligandi ^26.

KPFM opera misurando la differenza di potenziale di contatto (CPD) tra una punta cantilever AFM conduttivo e un campione idealmente conduttivo (Figura 1, i) ^14,15. I campioni non devono necessariamente essere conduttivo (cioè, sampl biologicaes). Imaging può essere eseguita su mica, vetro, e superfici di silicio (non conduttivi), purché la superficie non conduttiva è sottile e non vi è un materiale conduttivo sottostante ^6,7. Il CPD è equivalente al potenziale di tensione superficiale e può essere descritto come la differenza nelle funzioni di lavoro tra la punta _(tip φ) e il campione _(campione φ), diviso per la carica dell'elettrone negativo (- e). Quando una punta AFM conduttivo viene portato vicino ad una superficie del campione (separati da distanza d), viene generata una forza elettrostatica _(es F) a causa della differenza di energia di Fermi (Figura 1, ii, a) ^15. A questo punto, le energie vuoto della punta e del campione (E _v) sono in equilibrio e allineato. Su portando la punta più vicino alla superficie del campione, la superficie della punta e del campione entrano in contatto elettrico e agiscono come condensatori a piastre parallele (Figura 1, ii, b ) ^14,15. Al punto, le energie di Fermi della superficie punta e del campione diventano allineate, raggiungendo un equilibrio di stato stazionario (Figura 1, ii, b). Sarà addebitato la superficie punta e campione e un _CPD V formerà a causa di una differenza di funzioni E s _'contro e di lavoro. Una atti F _es sull'area di contatto elettrico a causa della V formata _CPD. Questa forza viene successivamente annullato attraverso l'applicazione di un _DC V esterna alla punta che ha la stessa grandezza della V _CPD formata (figura 1, ii, c). Questa tensione continua applicata elimina carica superficiale nella zona di contatto elettrico, e la quantità di V _cc necessaria per eliminare gli _es F di V _CPD è pari alla differenza tra le funzioni di lavoro tra l'sadi superficie mple e mancia ^15. Va notato che la funzione di lavoro della punta è noto ed è fornito dai produttori. In tutti i metodi KPFM, una tensione AC (V _AC, circa 100 - 500 mV) viene applicato anche alla punta per generare forze elettriche oscillanti tra la punta e il campione ^14. Ciò fornisce una migliore risoluzione per la misurazione dei cambiamenti della V _CPD e / o F _ES. A questo proposito, cambiamenti nella frequenza o ampiezza di oscillazione elettrica possono essere corretti V _DC, e la superficie mappe potenziali possono essere generati. I dati provenienti da specifiche aree di queste mappe possono essere ulteriormente analizzati per fornire informazioni elettrici su specifiche caratteristiche topografiche.

KPFM può essere utilizzato in tre modi: (1) modalità ascensore, modalità (2) modulazione di ampiezza (AM), e (3) modulazione di frequenza (FM) modalità ^14,16. Modalità Ascensore era il inc inizialearnation di KPFM. Modalità di sollevamento si basa su un metodo a due passaggi in cui una punta oscillata viene trascinato attraverso la superficie per ottenere un'immagine topografica. Per il secondo passaggio della punta viene sollevata una distanza prefissata al di sopra del campione periodo (10 - 100 nm) e scansione indietro attraverso la stessa area. Grazie a questo metodo a due passaggi, modalità di sollevamento, rispetto al AM- e FM-KPFM, richiede più tempo per l'acquisizione dell'immagine. Aumentare la punta lontano dalla superficie assicura che solo a lungo raggio F _es viene misurato. Inoltre, cross talk tra i potenziali misure di topografia e di superficie è disaccoppiato a scapito di una maggiore risoluzione laterale e sensibilità.

AM-KPFM migliora la risoluzione laterale e la sensibilità utilizzando dual-frequenze per misurare simultaneamente la topografia del campione e il potenziale di superficie (scansione one-pass) ^14. In modalità AM, il cantilever è oscillato meccanicamente, generalmente 5% di sotto della sua prima frequenza di risonanza (f _0), e oscillare elettricamente (tttraverso un V _AC) alla sua seconda frequenza di risonanza (f _1). Le variazioni di ampiezza di f ₀ portano alla generazione di dati topografici, mentre le variazioni di ampiezza di f _1, dovute a variazioni _es F e V _CPD, danno potenziali dati di misura di superficie. f ₀ e f ₁ del cantilever sono separati da frequenze significative ed energie che segnale di cross-talk ¹⁴ è minimizzato. La centralina di testa (HEB) della AFM separa i due segnali per dare sia topografica e la superficie dei dati potenziali contemporaneamente in una sola scansione. FM-KPFM migliora la risoluzione anche oltre AM-KPFM su superfici biologiche ^14. FM-KPFM funziona in modo diverso rispetto AM-KPFM in che misura l'andamento gradienti forza elettrostatica piuttosto che forza elettrostatica _(es F) ^15. Come modalità AM, FM utilizza dual-frequenze e un single-pass meccanismo di scansione per ottenere topografica e di superficie dati potenziali simultaneamente ^14. In modalità FM, il cantilever viene fatto oscillare meccanicamente ed elettricamente f ₀ oscillare ad una bassa frequenza modificata (f _mod, tipicamente: 1 - 5 kHz). Su interazioni elettrostatiche, f ₀ e f _mod mix per produrre bande laterali f ₀ ± f _mod. Queste bande laterali sono molto sensibili alle variazioni di forza elettrostatica, e possono essere separati da f ₀ a HEB del AFM. Dal FM-KPFM misura l'andamento gradienti forza elettrostatica, la punte forma apice e la sua manutenzione / integrità giocano un ruolo critico nella superficie complessiva potenziale risoluzione ^{14, 15.} Surface potenziale risoluzione usando AM e FM sono nel range di 1 nm laterale ^{14 -16.} Va notato che l'imaging KPFM può essere realizzata in liquidi non polari, e, più recentemente, è stato dimostrato essere fatto in (<10 mm) liquidi polari bassa ionico (inKPFM modalità ad anello aperto che non richiedono una valutazione polarizzazione, ovviando l'applicazione di una polarizzazione CC) come acqua MilliQ; tuttavia, l'imaging KPFM deve ancora essere fatto su cellule vive in soluzioni polari ^17-20. Sfide aggiuntivi associati SP imaging liquido è che le soluzioni comunemente utilizzati per le celle mantenimento (cioè, tampone fosfato salino) hanno alte concentrazioni di ioni mobili, che porterebbero a reazioni faradica, dinamiche carica di polarizzazione indotta, e la diffusione di ioni / ridistribuzione ^20. Quindi, per questo esperimento, le misurazioni sono state prese da cellule MRSA essiccati e morti su superfici funzionalizzate inox poli-L-lisina acciaio e oro in condizioni ambientali. Imaging può essere effettuata in condizioni di aria o di vuoto su campioni biologici che sono stati precedentemente essiccati o immobilizzati sulle superfici ^20. La presenza di umidità hanno anche dimostrato di influenzare l'imaging KPFM di superfici ^6.

In questo studio, abbiamo impiegato FM-KPFMe AFM di esaminare il ruolo della SP per il sequestro di meticillino-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) per superfici in acciaio inox e oro funzionalizzate poli-L-lisina. MRSA ha recentemente ottenuto lo status di multi-farmaco resistente (MDR) "superbug" per la sua resistenza naturale selezionato a molti antibiotici β-lattamici e cefalosporine ^21. Infezioni da MRSA sono ora più impegnativo, difficile, e formidabile per trattare, portando all'utilizzo di antimicrobici severe come la vancomicina o oxazolidinoni che hanno livelli elevati di tossicità nell'uomo, e pertanto non può essere utilizzato come trattamenti a lungo termine ^22. L'acciaio inossidabile è stato scelto per la sua rilevanza medica e di uso comune come materiale in aghi ipodermici, padelle, maniglie delle porte, lavandini, ecc L'oro è stato utilizzato come un metallo comparativa. FM-KPFM è stato utilizzato per esaminare se la membrana microbica SP cambia su attaccamento ai substrati.

Protocollo

1. Preparazione di cristalleria e culture

1. Prima di procedere con questo esperimento, preparare agar sangue 5% di pecora (SBA) piastre per coltivazione MRSA. Incubare le piastre SBA per 24 ore a 37 ° C. Dopo questo periodo, singoli, colonie ben isolate dovrebbero essere presenti per essere utilizzato per le successive vaccinazioni in mezzi liquidi. Conservare striato piastre SBA con singole colonie a 4 ° C per 1 - 2 mesi.
   NOTA: piastre di agar sangue di pecora sono disponibili in confezioni precostituiti contenenti da 20 - 25 piastre base al produttore, e tipicamente costituiti da una base di soia agar Tryptic con l'aggiunta di 5% w / v di sangue di pecora.
2. Fare 500 ml di brodo di soia trittico (TSB) supplementato con 1% di glucosio e 0,1% NaCl. Dopo questo, raccogliere e pulire 2 provette di vetro. Se coperchi autoclavabili non sono disponibili per provette, usare fogli di alluminio come un cappuccio. Autoclave TSB e provette insieme a una scatola di punte per pipette 1 ml.
3. Sotto un armadio biosicurezza o vicino ad una Bunsen bruciatore pipetta 5 ml di precedentemente sterilizzati in autoclave TSB in provette in autoclave. Attenzione a garantire che il tempo è stato dato a lasciare il TSB e provette raffreddare a temperatura ambiente. Da un 5% piastra SBA precedenza striato, inoculare una singola colonia in 6 ml di brodo TSB. Una conterrà MRSA, e la seconda provetta sarà utilizzato come controllo negativo per garantire la sterilità.
4. Prendere provette inoculate prova TSB e metterli in un incubatore reciproca per 24 ore a 37 ° C ea 200 rpm. Dopo questo tempo la crescita microbica dovrebbe essere evidente nella provetta MRSA mentre nessuna crescita dovrebbe essersi verificato nella provetta di controllo.
5. Prendere 1 ml di cultura 24 ore e trasferirli in 6 ml di TSB fresco. Incubare a 37 ° C per 6 ore a 200 rpm.
6. Pipettare 1 ml di 6 ore sub-cultura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare per 3 min a 850 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di H ₂ O. deionizzata Centrifuga, ripetere, e ri-sospensione.

2. Pulizia e inoculazione di acciaio e oro substrati

1. Prendere acciaio e dischi campione oro AFM (20 mm e 10 mm di diametro rispettivamente) e pulire ogni lato con 5 ml di H ₂ O. deionizzata Tenere dischi campione nella mano dominante con una pinza e utilizzare la mano sottodominante pipettare 5 ml su ciascun lato del disco campione. Dopo aver lavato entrambi i lati, dischi campione posto in un becher contenente 20 ml di H ₂ O deionizzata seguita da sonicazione per 1 min.
2. Dopo l'uso sonicazione pinze per rimuovere i dischi campione dal bicchiere. Posizionare i dischi in modo che si affacciano ad un angolo di 60 ° contro il bordo di una piastra di Petri aperta su un tovagliolo di carta. Utilizzare il coperchio della piastra Petri per coprire i dischi di essiccazione. Lasciate asciugare completamente i dischi prima di procedere. Il tempo di asciugatura può variare tra 4 - 8 ore.
3. Una volta asciutto, usare il forcipe per inserire i dischi di campioni in una piastra di Petri.
   1. Facoltativamente, funzionalizzare le superfici dei dischi campione con qualsiasi materiale (ad esempio, collagene, acido ialuronico, argento nano-particelle, ecc).
   2. Per questo esperimento, utilizzare poli-L-lisina per rivestire la superficie del substrato. Per poli-L-lisina funzionalizzazione, pipette 200-400 ml di 0,1% di poli-L-lisina (in H ₂ O) su dischi di esempio, e lasciate incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una piastra di Petri.
   3. Dopo 1 ora, utilizzare pinze per tenere il disco del campione, e lavare con 1 ml di H ₂ O. deionizzata Lasciate asciugare su carta assorbente come descritto al punto 2.2.
4. Prendere 2x cellule ri-sospeso lavati e piastra 200-400 ml su dischi di campioni all'interno di un armadio biosicurezza. Se dischi campione sono rivestiti con poli-L-lisina, incubare per 0,5 ore a temperatura ambiente.
5. Dopo incubazione di cellule su dischi campione, lavare dischi campione delicatamente con 1 ml di H ₂ O. deionizzata Lasciate asciugare i dischi durante la notte prima di imaging.

3. KPFM Imaging

NOTA: Per questo esperimento,utilizzare una serie Agilent 5500 ILM-AFM.

1. Per iniziare AFM, accendere il gruppo computer con HEB e MAC III controllore della AFM. Software di imaging aperto AFM (ad esempio, di Agilent PicoView). Assicurarsi di selezionare inizialmente ACAFM o qualsiasi denominazione corretta è sulla AFM per l'imaging in modalità intermittente contatto.
2. Utilizzando pinze AFM nella mano dominante, e tenendo premuto il supporto a clip a molla aperto con la mano sottodominante, inserire un cantilever KPFM in testa al pezzo. Prestare attenzione durante la manipolazione e il trasferimento del capo-pezzo AFM al AFM come questa unità (almeno sul 5500 ILM-AFM) contiene l'unità di cristallo piezoelettrico fragile che controlla X, Y, Z e direzionalità scansione.
   NOTA: I cantilever KPFM utilizzati in questo caso sono stati Mikromasch DPE conduttivo (basso rumore) cantilever con frequenze medie di risonanza di 80 kHz e primaverili costanti di 2,7 N / m. Cantilever con queste frequenze di risonanza e costanti primaverili sono stati scelti per la loro facilità d'uso.Cantilevers con costante elastica più grandi e più elevate frequenze di risonanza possono essere utilizzati anche per l'imaging.
3. Sistemare con cura testa pezzo al AFM e collegare i fili appropriati (in questo caso due fili bisogno di essere collegato in: luce laser e motore di sollevamento stadio).
4. Allineare il laser sulla punta del cantilever. Alcune unità contengono una funzionalità della telecamera, che agevola l'allineamento. Se la funzionalità della fotocamera non è presente su AFM, allineare sulla punta cantilever come descritto di seguito:
   1. Ruotare il front-to-back in senso orario per spostare il laser sovrastano il chip a sbalzo. Quando il laser raggiunge il chip verrà bloccato e non sarà più visibile. Solo ruotare la manopola un paio di volte.
   2. Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario fino a quando il punto laser riappare. Il laser è ora sul bordo del chip.
   3. Ruotare la manopola sinistra a destra per posizionare il laser sul cantilever. Come il laser passa sopra il cantilever sarà scomparire e riapparire in rapida successione. Il punto laser deve essere visibile nella copertura di vetro smerigliato in cui l'unità fotodiodo sarà poi sedersi.
   4. Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario per spostare il punto lungo la mensola verso la punta fino a quando il punto sul vetro smerigliato scompare.
   5. Ruotare la manopola front-to-back solo leggermente in senso orario per posizionare il laser in modo che esso si trova appena sulla punta cantilever. Lo spot laser riapparirà sul vetro smerigliato.
      NOTA: Questo è il metodo di posizionamento laser per cantilever trampolino. Per a forma triangolare, il processo di allineamento è leggermente diversa.
5. Una volta che il laser è allineato, tenere il motore fase di sollevamento in posizione "aperto" per 10 sec per garantire spazio sufficiente tra la mensola e del campione durante il fissaggio del campione alla AFM.
6. Posizionare campione sul palco del campione KPFM. A terra il campione utilizzando un filo di rame. Collegare i cavi appropriati dalla AFM alla fase di campionamento. Collegare le stage alla AFM. Nella maggior parte dei casi la fase viene tenuto in posizione mediante magneti.
7. Nel software AFM, sintonizzare il cantilever e poi iniziare approccio della punta cantilever al campione. Assicurarsi che tempo di assestamento è fissato a non più di 10 msec, e che velocità di avvicinamento non superi 2,0 micron / sec per evitare danni punta.
8. Una volta che la punta è sbalzo sulla superficie del campione, selezionare una dimensione della finestra di imaging e area di esposizione ideale. Ottimizzare i guadagni I e P con il set point a sbalzo in modo che l'immagine topografica è ottimizzato.
   1. Una volta che l'imaging topografico è ottimizzato, accendere il modulo KPFM (FM o AM, qui, utilizzare la modalità FM). Va notato che l'imaging KPFM è molto impegnativo esterna della finestra di imaging x 5 micron 5 micron. Inoltre, per l'imaging ottimale KPFM, utilizzare una risoluzione di 512 x 512 con basse velocità di scansione (,02-,05 linee / sec).
9. Per le impostazioni FM-KPFM (non ACAFM impostazioni), impostare la percentuale di auto tra il 5 - 10%. Impostare il fr cantileverequency tra: 1 - 5 kHz con una larghezza di banda di 2 kHz. Set I e P guadagni per le impostazioni FM-KPFM al 0,3%.
   1. Variare la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni tra le superfici dei campioni. Per ottimizzare SP immagini, regolare ulteriormente la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni per ottenere immagini ottimali. La gamma raccomandata di guadagni I e P sono 0,22-0,35%.
10. Elaborare e analizzare le immagini raccolte KPFM utilizzando il software di elaborazione post-immagine per raccogliere i dati SP.

Risultati

La capacità di misurare SP utilizzando KPFM si basa sul principio che sia la superficie del campione e punta cantilever conduttivo sono in una certa misura. Acciaio e oro agito come superfici conduttive cui MRSA sono stati attaccati. KPFM immagini sono state prese di 15 celle MRSA su entrambe le superfici con 512 x 512 risoluzioni, e con aree di scansione da 5 x 5 micron a 10 x 10 micron. La scansione è stata effettuata con velocità di linea vanno da 0,02 linee / sec a 0,05 linee / sec. Pertanto, con 512 punti di dat...

Discussione

KPFM è stato impiegato come una tecnica innovativa per ottenere dati elettrici di superficie. È stato comunemente usato come metodo per l'esame distribuzione di carica in chimica ed è solo recentemente iniziato da applicare per lo studio di sistemi biologici della micro e nano-scale. Dai dati raccolti abbiamo scoperto che i microbi non sembrano collegare facilmente per pulire le superfici in acciaio inox e oro, anche dopo 3 ore di incubazione statica. Superfici funzionalizzate Poly-L-lisina mostrato attacco rapid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.