Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormência Modelo de câncer de mama estrogênio-sensíveis na medula óssea: Uma Ferramenta para Estudos Moleculares Mecanismo e Hipótese Geração

Resumo

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Resumo

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introdução

Células de cancro da mama metastizar para a medula óssea antes de a doença é detectável ^1, assim que os tumores se desenvolvem pequenos vasos sanguíneos ^2,3. O processo metastático é rápida, mas ineficiente. Células entram os novos vasos sanguíneos rapidamente, a milhões por dia ^4, mas poucos sobrevivem a viagem para órgãos distantes ^5. No entanto, algumas micrometástases sobreviver no osso e pode ser encontrado como células individuais ou pequenos aglomerados de células nos aspirados de medula óssea de pacientes recentemente diagnosticados ^1. Estas células resistem à quimioterapia adjuvante, que é administrado pela própria finalidade de eliminá-los ^6. Esta resistência é dotado, substancialmente, por sobrevivência sinalização iniciada por interacções com o microambiente da medula óssea ^7,8. Micrometástases pode ser encontrado em cerca de um terço das mulheres com câncer de mama localizado e representam um indicador independente de sobrevida quando analisados ​​por análise univariada ^9. Alguns micrometástases são o crescimento iniciado, mas padrões de retorno depende do tipo de célula. Pacientes com câncer de mama triplo negativo tendem a recorrer entre 1 a 4 anos, sugerindo pobre controle sobre o estado de dormência. Outros tipos de células, incluindo ER / PR +, células podem permanecer dormentes por até 20 anos, com uma taxa constante e contínuo de recorrência ^10. Embora as diferenças em dormência assinaturas de expressão gênica entre ER- linhas de células de mama e tumores ER + e refletem diferentes potenciais de dormência ^11, interacções com estroma da medula óssea provavelmente representam um contributo significativo para a dormência.

O estudo de dormência in vivo é excepcionalmente difícil porque micrometástases são raros e estão em desvantagem por células hematopoiéticas em mais de 10 vezes de ^6. Assim, os modelos relevantes devem ser gerados que fornecem dados in vitro que pode sugerir mecanismos e gerar hipóteses testáveis ​​in vivo. Uma série de modelos de dormência, incluindo mathemodelos matical ^12,13, modelos in vitro, in vivo ^7,8,14,15 modelos de xenotransplante de ^16, combinações de in vitro e modelos de xenotransplante de ^17,18 e tumorais e metástases modelos espontâneos ^19, têm rendido alguns insights sobre a dormência célula cancerosa ²⁰ . Cada um desses modelos têm as suas próprias limitações e são em si principalmente útil para gerar hipóteses sobre a sinalização molecular e interações que regem a dormência a ser testada em modelos mais biologicamente relevantes.

Com o objetivo geral de definir os mecanismos moleculares de dormência, as interações com o microambiente que resulta na paragem do ciclo, rediferenciação e resistência e os mecanismos terapêuticos que resultam em recorrência em células ER +, desenvolvemos um modelo in vitro que fornece selecionado elementos relevantes da estromal microambiente ^7. Este modelo, embora relativamente escassa em seu componentes, é suficientemente robusto para permitir investigadores para derivar mecanismos moleculares específicos que afectam funções significativas de dormência. Estas experiências gerar hipóteses que podem ser directamente testados in vivo. O modelo baseia-se em alguns elementos-chave que demonstraram ser relevante em dormência. Eles incluem a utilização de células de cancro da mama dependentes de estrogénio, a cultura de células a uma densidade clonogénico onde a sua interacção é principalmente com o substrato e os componentes solúveis do meio, um substrato fibronectina e a presença do factor de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) no meio.

Foram caracterizados os mecanismos que governam o sistema in vitro, incluindo a indução de paragem do ciclo celular por FGF-2 ^21, mediada através de TGFp ^22, a sobrevivência a sinalização através de PI3-quinase ERK ^7,8 e ⁸ e diferenciação morfogénica para um fenótipo epitelial, que dependia RhoA inactivação, integrina45; 5β1 regulação positiva e ligadura de fibronectina do estroma para a sobrevivência ^7,15 (Figura 1). Os efeitos do ciclo celular in vitro de FGF-2 em células MCF-7 em concentrações começam pelo menos um log inferior a 10 ng / mL ^21,23. A lógica baseou-se no controlo temporal da expressão de FGF-2 que regula a morfogénese ductal da mama, de expansão cíclica e recessão em um certo número de sistemas de mamíferos ^24-27. Nós demonstramos que o FGF-2 induz a diferenciação, incluindo morfogénese ductal in cultura 3D ^28, e que a expressão de FGF-2 são geralmente perdido com a transformação maligna de tumores humanos ^29. A expressão de FGR1 permaneceu intacto em carcinomas da mama examinados ²⁹ e MCF-7 de células continuam a expressar todos os quatro receptores de FGF ^30. No contexto da dormência, o FGF-2 é exportada por e fortemente depositado em estroma de medula óssea ^31,32 onde funciona na preservação de células-tronco hematopoiéticas ^33. Nós demmonstrado que o FGF-2 induz um estado dormente em ER + do câncer de mama células cultivadas em substratos fibronectina, também abundantes na medula, onde induz a diferenciação morphogenic ^7. No modelo, as células de cancro da mama são crescimento inibido, inactivar Rho A através do RhoGap Graf, redifferentiate a um fenótipo epitelial e re-express integrinas α5β1 lost com a progressão maligna. Ligam-se fibronectina através integrina α5β1 e activar a sobrevivência de sinalização que torná-las resistentes à terapia citotóxica ^7,8,15 (Figura 1). A inibição de Rho GTPases classe tem sido demonstrado anteriormente para induzir um fenótipo dormente ^34.

Aqui vamos delinear os procedimentos específicos que permitam aos investigadores estabelecer o modelo e estudar os mecanismos moleculares e celulares específicas que regulam a dormência das células ER + do câncer de mama. Nas experiências aqui apresentadas para ilustrar o uso do modelo, Que orientada via PI3K (Figura 1B) com um inibidor Akt e um inibidor de PI3K e todos os membros da família Rho (Figura 1B) com um inibidor da pan-Rho e Rho cinase um (ROCK) inibidor.

Protocolo

1. Ensaio clonogénico

1. Preparar um único suspensões de células de linhas celulares do cancro da mama dependentes de estrogénio de células MCF-7 e T47D utilizando os passos descritos abaixo
   1. Aspirar o meio de cultura (DMEM / 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo / glutamina e Pen / Strep) a partir de 10 cm do tecido placa de cultura, que é não confluentes mais de 50% com células T-47D MCF-7 ou. Lavar com PBS. Incubar com tripsina a 0,25% / EDTA 2,21 mM dissolvido em DMEM de alto teor de glucose a 37 ° C durante 1-4 min.
   2. Confira as células em um mínimo de intervalos sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma distribuição única célula. Volte a suspender as células com uma pipeta 2 ml por pipetagem cima e para baixo várias vezes para interromper contato célula-célula para atingir, um status de única célula quase invariável.
   3. Continue a incubar células em tripsina a 37 ° C por até 4 min, se você observar aglomerados de células depois de apenas 2 min de incubação. Não use essas células para estudos clonogénicos se eles permanecem aderentes ao each outro após 4 min de tripsinização porque o erro será introduzido no rendimento número colônia.
      NOTA: Se as células são aglutinados, o número de colônias formadas irá reflectir o produto de menos células do que o número incubadas. Se as células são tratadas com tripsina excessivamente, o seu potencial clonogénico pode ser diminuída.
   4. Prepara-se uma suspensão de células única de 1500 células / ml de meio de cultura para placas de 24 cavidades, ou menos, de (+ 500 células / ml, dependendo do tipo de célula ou o número de passagem), através de diluições em série em um tubo principal que contém todo o volume necessário para a todas as variáveis ​​no experimento.
      NOTA: O objectivo é uma densidade final de células de 800 células / ^cm2 (gama de aproximadamente 500 a 1100 células / ^cm2). O objectivo é produzir aproximadamente 100 + 50 colónias, que permite a contagem relativamente fácil, impede aglomeração e permite colónias suficientes para resultar em diferenças estatisticamente significativas quando as colónias são aumentadas ou diminuídas por perturba experimentalções.
2. Incube as células a clonogénico de densidade usando etapas descritas abaixo
   1. Incubar as células em poços em quadruplicado em 24 placas revestidas com fibronectina a uma densidade de 1500 células clonogénicas / poço a partir de um tubo de suspensão de células individuais mestre de 1500 células / ml. Triturar o meio contendo células com uma pipeta 5 ml através da elaboração de 3 ml e 1 ml de meio de distribuição em cada um dos dois poços.
      NOTA: A fibronectina revestido placas devem ser compradas pré-revestido a partir de um fornecedor comercial. Placas de revestimento fora de uma qualidade controlada, processo resulta automatizados em uma superfície irregular inadequada para este ensaio.
   2. Misture a suspensão por pipetagem cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml, 3 ml elaborar de suspensão de células e preencher 2 poços com 1 ml cada. Encha apenas dois poços de uma só vez a partir de uma pipeta. Retorne o volume restante na pipeta à suspensão de células no tubo principal, voltar a suspender as células novamente pipetando cima e para baixo e elaborar outros 3 ml para encher outro 2 welsl com 1 ml cada.
      NOTA: mistura contínua do tubo principal é necessário porque as células irão sedimentar continuamente. Desenhando-se um volume suficiente para encher apenas dois poços é necessário adicionar o número de células semelhantes a cada poço, porque as células sedimentar na pipeta bem.
   3. Trabalhar rapidamente para distribuir as grandes volumes de células porque as células que permitem a sentar-se em suspensão à temperatura ambiente e concentração de CO ₂ vai modulam suas potenciais (observações não publicadas) clonogénicos.
   4. Otimizar a distribuição espacial das células durante o ato de pipetar-los em poços para ensaios de colónias. Fazê-lo pipetando lentamente a suspensão contendo a concentração final de células no meio do poço. Não sujeite a placa para promover o movimento antes que as células se depositam no fundo. Não rodar a placa circular porque mistura irá eficazmente centrifugar as células para o perímetro das densidades celulares elevadas e assim criando colónias confluentes incontáveis ​​a 6 dias.
      NOTA: Não misture a menos que necessário uma vez que este é menos desejável que nenhuma mistura em tudo depois de introduzir o volume com as células em suspensão. Se é necessário para misturar as células, fazê-lo em movimento a placa para trás e para a frente em direcções perpendiculares, enquanto que repousa sobre uma superfície plana.
   5. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO _2, sem mudança de meio, durante 6 dias. O pequeno número de células em um poço após 6 dias não vai ter impacto significativo na composição de nutrientes ou de citoquinas nem o pH do meio original.
   6. Design o decurso de tempo do ensaio do seguinte modo: Incubar as células em fibronectina substratos revestidos no dia 1. Substitua meio existente, com 1 ml de meio fresco ou meio fresco contendo 10 ng / ml no dia 0. As células mancha no dia 6 como abaixo de 2 FGF- em 1.4). Realizar quaisquer perturbações experimentais no dia 3, como abaixo de 1.3).
3. Configurar Perturbations experimentais de sinalização molecular ou Moléculas de Adesão
   1. No dia 3, adicionar 10056; l de uma solução contendo 10x da concentração final pretendida do agente perturbador para a forma de 1 ml nos poços. Não misture. Continue-se a incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ por 3 dias adicionais.
      NOTA: agentes Perturbando pode incluir uma variedade de agentes bloqueadores e inibidores de moléculas de adesão, receptores ou outras proteínas de superfície, os inibidores de vias de sinalização intracelulares, moléculas, factores, co-factores ou proteínas estruturais, que podem desempenhar um papel no apoio ao estado dormente.
   2. Colónias mancha no dia 6, como segue.
4. Colônias Mancha
   1. Células mancha após 6 dias em cultura com um recém-feitos 0,1% violeta de cristal em 2% de etanol / 10 mM borato de sódio solução (pH 9,0). Meios Aspirar e adicionar uma solução de violeta de cristal ml a cada poço durante 20 minutos.
   2. Lavar as placas por imersão com as aberturas de poços virados para baixo em um ângulo agudo em um balde de gelo repleto de execução contínua da torneiraágua na pia. Incline a placa em um ângulo horizontal, uma vez debaixo de água, bem abrindo para baixo, e em seguida, incline para trás a um ângulo agudo ao remover em um movimento que flui suave.
   3. Repetir a imersão 2 ou 3 vezes até que a água no fundo dos poços não é mais azul. Lavagens vigorosa pode remover as células ou as colónias que são menos aderente devido à intervenção experimental, adicionando significativamente ao erro na contagem e os dados.
   4. Chapas secas durante a noite, colocando-os de cabeça para baixo em toalhas na bancada adjacente às suas correspondentes tampas marcadas.
5. Contagem de colónias
   1. Contar o número de colónias em crescimento e latentes em cada poço após 6 dias de incubação, a coloração e secagem. Contagem das colónias optimamente a 40X em um microscópio de contraste de fase invertida. Contagem de colônias de> 30 células como crescer e colônias de 12 ou menos células, com o aspecto morfológico de tamanho muito grande em comparação com células em crescimento, grande Expacitoplasma NDED com grande citoplasma para núcleo rácios, mostrado na Figura 1 ^7,15.
      NOTA: Conjuntos de 13-29 células normalmente não são contados como eles não são muito frequentes em ensaios de dormência simples. Eles podem ser contadas se perturbações deslocar o potencial de crescimento da utilização de células em crescimento ou dormentes. Estes resultados terão então de ser correlacionado com significado biológico.

2. clonogénico Incubação de Estudos de imunofluorescência

1. Ajustar o número de células de aproximadamente 7,500-8,000 células / poço em placas de 6 cavidades, para corresponder à célula números de área de superfície / análogo a 24 experiências bem.
2. Coloque uma rodada, estéril, tampa de deslizamento revestido de fibronectina em cada base poço de placas de 6 poços para estudos de imagem antes da adição de células. Pipetar as células em volumes de 3 mL em cada poço 2 poços de uma vez em concentrações descritas, tal como descrito para as experiências clonogénicas acima em 1.2).
3. Incubar as célulasdurante 6 dias, como acima em 1.2.4 e 1.2.5. Adicionar factores perturbadores no dia 3 a 10X a concentração em volumes de 300 ul, tal como descrito nos procedimentos de ensaio de colónia em 1.3).
4. Células mancha no dia 6, com anticorpos para moléculas de adesão celular tais como as integrinas α4, α5, α6, β1, β3, por exemplo, moléculas de adesão focal complexos FAK, paxilina e vinculina, por exemplo, proteínas envolvidas na motilidade, tais como α-tubulina, por exemplo, membros da via de sinalização, tal como fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, por exemplo, ou qualquer outra proteína que é o alvo de investigação para o seu papel em dormência, utilizando técnicas padrão para directa ou indirecta imunofluorescência.
   1. Retirar as lâminas com uma pinça dia 6. Fix em acetona / metanol 1: 1 a -20 ° C durante 20 min e o ar seco. Um fixador alternativo, tal como paraformaldeído, pode ser utilizado, se necessário. Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100, 0,1% de citrato de sódio durante 2 min fou detecção de antigénios intracelulares. Lavar as células com PBS.
   2. Para a coloração indirecta immunofluorecence, bloco desliza durante 1 h à temperatura ambiente com BSA a 5% ou com 10% de soro pré-imune das espécies em que o anticorpo secundário foi gerado.
   3. Incubar durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários para a célula moléculas de adesão, moléculas complexas focais, a sinalização da via de membros ou qualquer outra proteína que é o alvo de investigação para o seu papel em dormência diluído para as diluições específicas recomendadas pelo fabricante em PBS 0,1% de Triton X -100.
   4. Lavar 3 vezes com PBS. Incubar lamelas com anticorpos conjugados com fluoróforo à temperatura ambiente durante 2 h. Como um exemplo, Alexa Fluor 488 de burro anti-IgG de ratinho de anticorpos podem ser utilizados para detectar anticorpos primários monoclonais de murino. Mount lamelas lado célula para baixo em lâminas de vidro, utilizando um agente antifade com DAPI. Selar os perímetros com unha polonês.
   5. Para imunofluorescência direta, realizar a BSAbloqueio como acima no ponto 2.4.2), incubar com o anticorpo primário conjugado com fluoróforo durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS. Incubar as lâminas com um agente antifade e Dapi e selo com unha polonês.
   6. Bandejas tampa deslizante com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C para geração de imagens ea fotografia a qualquer hora até várias semanas depois. Veja fotos e células utilizando quaisquer sistemas de imagens microscópicas de fluorescência equipado com uma câmera de 1000X ampliação.
   7. Para a coloração de actina fibrilar, bloco desliza em 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min e incubar em BODIPY FL-Phallacidin (verde) ou rodamina-faloidina (vermelho) à temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar um agente antifade e selar como acima.

3. clonogénico Incubação de Estudos Moleculares

1. Western Blots
   1. Incubar ER + do câncer de mama células MCF-7 ou T47D em densidades clonogénicos de 20.000 células / placa de 60 mm e 50.000 células / placa 100mm em fibronecplacas a 37 ° C em 5% de CO ₂ revestido de estanho.
   2. Incubar as células em densidades ligeiramente superiores de 75.000 células / 100 mm placa para estudos moleculares que exijam montantes mg para proteína de lisados. Use até dez placas por ponto experimental para coletar proteína suficiente para estudos moleculares utilizando Western blot ou para isolamento de RNA de transferência de Northern.
   3. O número de células de gel com base de carregamento é um complemento necessário para comparar a expressão da proteína em células de cultivo e dormentes vastamente diferentes tamanhos. Recolher as células por trypsinizing e contagem de uma alíquota num hemocitómetro em 0,2% de Azul de Tripano, para preparação de lisados ​​de Western blot em vez de raspar as células com uma única lâmina de borda.
   4. Células de centrífuga a 10.000 xg durante 2 minutos, retirar o suporte por aspiração, adicionar 200 ul de tampão de lise, sonicar as células em tampão de lise e determinar a concentração de proteína.
   5. Calcula-se a quantidade de proteína por célula, dividindo a produção de proteína ao número de célulasque gerou esse montante. Carregar o lisado para cada poço de géis de poliacrilamida separadas que representa tanto a) quantidades equivalentes de proteína e b) as quantidades de proteína que representam o número de células equivalentes. Pelo menos 25 mg de proteína deve ser carregado em cada poço.
      NOTA: Isto irá permitir comparações entre crescimento e dormentes células, que são significativamente diferentes em tamanho e conteúdo de proteína (Figura 1).
2. Citometria de Fluxo
   1. Recolher as células a partir de placas de 100 mm por tripsinização, como em 3.1 e analisar por células activadas por fluorescência (FACS padrão) usando protocolos de coloração por imunofluorescência primário ou secundário tanto para antigénios intracelulares ou extracelulares, como descrito em 2.4.
      NOTA: Desanexando células a partir das placas de cultura de tecidos por tripsinização não afecta a concentração de proteínas de membrana, conforme determinado por marcação com anticorpos.

Resultados

As experiências foram conduzidas de recapitular o ensaio. O curso do tempo da experiência é mostrado na Figura 2A. As células são incubadas a densidade clonogénico no dia -1, é adicionado FGF-2 em meio fresco no dia 0 e as células são cultivadas até ao dia 6, quando eles são coradas e as colónias são contadas. Quaisquer perturbações do sistema são administrados no dia 3 em volumes de 100 uL a 10X a concentração final desejada. A Figura 2B mostra a aparência típ...

Discussão

O nosso modelo é composta por vários elementos chave de dormência na medula óssea. É composto de estrogénio células sensíveis, que são do tipo susceptíveis de permanecer dormentes na medula por períodos prolongados ^10, que consiste de fibronectina, um elemento estrutural chave da medula, o FGF-2, um factor de crescimento abundantemente sintetizado pelo estroma da medula óssea e fortemente depositado na matriz extracelular da medula óssea ^31,32 e incubação de células clonogénicas, e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931