Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormienza Modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: Uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi Generation

Riepilogo

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduzione

Le cellule tumorali del seno metastatizzano al midollo osseo prima che la malattia è rilevabile ^1, non appena i piccoli tumori si sviluppano vasi sanguigni ^2,3. Il processo metastatico è rapido ma inefficiente. Le cellule entrano i nuovi vasi sanguigni rapidamente a milioni al giorno ⁴ ma pochi sopravvivono il viaggio in organi distanti ^5. Tuttavia, alcuni sopravvivono micrometastasi nel midollo e può essere trovato come cellule singole o piccoli grumi di cellule in aspirati di midollo osseo da pazienti di nuova diagnosi ^1. Queste cellule resistono chemioterapia adiuvante, che viene somministrato per lo scopo di eliminarli ^6. Questa resistenza è dotato, sostanzialmente, dalla sopravvivenza segnalazione avviata da interazioni con il midollo microambiente osseo ^7,8. Micrometastasi possono essere trovati in circa un terzo delle donne con carcinoma mammario localizzato e rappresentano un indicatore indipendente di sopravvivenza quando analizzato da analisi univariata ^9. Alcuni micrometastases sono la crescita iniziata, ma i modelli di ricorrenza dipendono dal tipo di cellulare. I pazienti con carcinoma mammario triplo negativo tendono a ripresentarsi tra 1 a 4 anni, suggerendo scarso controllo sullo stato dormiente. Altri tipi di cellule, tra cui ER / PR + cellule, possono rimanere dormienti per un massimo di 20 anni, con un costante, continuo tasso di recidiva ^10. Mentre le differenze di dormienza firme espressione genica tra ER- linee di cellule del seno e tumori ER + e riflettono diversi potenziali dormienza ^11, le interazioni con il midollo osseo stroma probabilmente rappresentano un contributo significativo alla dormienza.

Lo studio di dormienza in vivo è estremamente difficile perché micrometastasi sono rari e vengono oltrepassati dalle cellule ematopoietiche di oltre 10 ⁶ -fold. Quindi, i modelli interessati devono essere generati che forniscono dati in vitro che possono suggerire meccanismi e generare ipotesi verificabili in vivo. Un certo numero di modelli dormienza, compreso mathemodelli matico ^12,13, modelli in vitro ^7,8,14,15, modelli in vivo di xenotrapianto ^16, combinazioni di in vitro e modelli di xenotrapianto ^17,18 e tumorali e metastasi spontanee modelli ^19, hanno dato qualche informazione in dormienza cellula tumorale ²⁰ . Ognuno di questi modelli hanno i loro limiti e sono di se stessi in primo luogo utile per generare ipotesi per quanto riguarda la segnalazione molecolare e interazioni che governano dormienza da testare in modelli più biologicamente rilevanti.

Con l'obiettivo generale di definire i meccanismi molecolari di dormienza, le interazioni con il microambiente che si traduce in arresto del ciclo, ridifferenziazione e resistenza terapeutica e dei meccanismi che provocano recidiva + cellule ER, abbiamo sviluppato un modello in vitro che fornisce selezionato elementi rilevanti del stromale microambiente ^7. Questo modello, mentre relativamente scarsa nella sua componenti, è sufficientemente robusto per permettere agli investigatori di ricavare i meccanismi molecolari specifici che influenzano le funzioni significative di dormienza. Questi esperimenti generano ipotesi che possono essere testati direttamente in vivo. Il modello si basa su alcuni elementi chiave che abbiamo dimostrato di essere rilevanti in dormienza. Essi comprendono l'uso di cellule di carcinoma mammario estrogeno-dipendenti, coltura di cellule ad una densità clonogenico dove loro interazione è principalmente con il substrato e componenti solubili del mezzo, un substrato fibronectina e la presenza del fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-2) nel mezzo.

Abbiamo caratterizzato i meccanismi che regolano il sistema in vitro, compresa l'induzione di arresto del ciclo cellulare da FGF-2 ^21, mediata attraverso TGFβ ^22, la sopravvivenza di segnalazione attraverso PI3 chinasi e ERK ^{7,8 8} e differenziazione morfogenica ad un fenotipo epiteliale, che dipendeva inattivazione RhoA, integrina45; 5β1 upregulation e legatura dei stromale fibronectina per la sopravvivenza ^7,15 (Figura 1). Gli effetti in vitro del ciclo cellulare di FGF-2 in cellule MCF-7 cominciano a concentrazioni almeno un log inferiore a 10 ng / ml ^21,23. Il razionale era basato sul controllo temporale del FGF-2 governa mammaria morfogenesi duttale, espansione ciclica e recessione in un certo numero di sistemi di mammifero ^24-27. Abbiamo dimostrato che FGF-2 induce la differenziazione, tra cui morfogenesi duttale in coltura 3D ^28, e che l'espressione di FGF-2 sono generalmente perso con trasformazione maligna dei tumori umani ^29. L'espressione di FGR1 rimasto intatto nei carcinomi mammari intervistati ²⁹ e MCF-7 cellule continuare ad esprimere tutte le 4 recettori FGF ^30. Nel contesto di dormienza, FGF-2 è esportato da e pesantemente depositato sul midollo osseo stroma ^31,32 dove funziona nella conservazione di cellule staminali ematopoietiche ^33. Noi demonstrated che FGF-2 induce uno stato dormiente in ER + di cancro al seno cellule coltivate su substrati di fibronectina, anche abbondanti nel midollo, dove induce la differenziazione morfogenica ^7. Nel modello, le cellule del cancro al seno sono la crescita inibita, inattivare Rho A attraverso la RhoGap GRAF, ridifferenziare ad un fenotipo epiteliale e ri-express integrine α5β1 lost con la progressione maligna. Si legano fibronectina attraverso l'integrina α5β1 e attivano la sopravvivenza segnalando che rendono resistenti alla terapia citotossica ^7,8,15 (Figura 1). L'inibizione della Rho GTPasi classe è stato dimostrato in precedenza per indurre un fenotipo dormiente ^34.

Qui ci illustrerà le procedure specifiche che permetteranno ai ricercatori di stabilire il modello e studiare i meccanismi molecolari e cellulari specifiche che disciplinano dormienza di cellule ER + di cancro al seno. Negli esperimenti qui presentati per illustrare l'utilizzo del modello, Abbiamo mirato il percorso PI3K (Figura 1B) con un inibitore di Akt e un inibitore della PI3K e tutti i membri della famiglia Rho (Figura 1B) con un inibitore pan-Rho e Rho chinasi (ROCK) inibitore.

Protocollo

1. clonogenica

1. Preparare una singola sospensioni di cellule di linee cellulari di cancro al seno estrogeno-dipendenti MCF-7 e T47D cellule utilizzando la procedura descritta di seguito
   1. Aspirare il mezzo di coltura (DMEM / 10% di calore inattivato siero fetale bovino / glutammina e pen / strep) da un tessuto piatto le colture 10 cm, non confluenti superiore al 50% con MCF-7 o cellule T-47D. Risciacquare con PBS. Incubare con tripsina / EDTA 0,25% 2,21 mM disciolto in DMEM alto glucosio a 37 ° C per 1-4 min.
   2. Controllare cellule a intervalli di 1 minuto sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire una distribuzione singola cellula. Risospendere le cellule con una pipetta 2 ml pipettando su e giù parecchie volte per interrompere il contatto cellula-cellula per ottenere un, lo stato della cella singola quasi invariabile.
   3. Continuare a incubare cellule in tripsina a 37 ° C per un massimo di 4 minuti se si osserva grumi di cellule dopo soli 2 minuti di incubazione. Non utilizzare queste cellule per studi clonogeniche se rimangono aderenti alla postaach altro dopo 4 minuti di tripsinizzazione perché sarà introdotto errore nella resa numero di colonia.
      NOTA: Se le cellule sono raggruppate, il numero di colonie formate rifletterà il prodotto di un minor numero di cellule rispetto al numero incubata. Se le cellule sono eccessivamente tripsinizzate, il loro potenziale clonogenico può essere ridotta.
   4. Preparare una sospensione di cellule singole di 1500 cellule / ml terreno di coltura per 24 pozzetti, o meno, (+ 500 cellule / ml, a seconda del tipo di cellula o numero di passaggio), per diluizioni seriali in un tubo master contenente l'intero volume necessario per tutte le variabili nell'esperimento.
      NOTA: L'obiettivo è una densità cellulare finale di 800 cellule / cm ² (gamma di circa 500 a 1.100 cellule / cm ^2). L'obiettivo è di produrre circa 100 + 50 colonie, che permette relativamente facile conteggio, impedisce affollamento e permette colonie sufficienti per portare a differenze statistiche significative quando le colonie sono aumentati o diminuiti di perturba sperimentalezioni.
2. Incubare le cellule a clonogenica densità con procedura descritta di seguito
   1. Incubare le cellule in pozzetti quadruplice su 24 piastre fibronectina rivestite pozzetti ad una densità di 1.500 clonogenica cellule / pozzetto da un master singolo tubo sospensione cellulare di 1500 cellule / ml. Triturare il terreno contenente celle con una pipetta da 5 ml mediante l'elaborazione di 3 ml e l'erogazione di 1 ml di mezzo in ognuna delle 2 pozzi.
      NOTA: fibronectina rivestite piastre devono essere acquistati già rivestito da un fornitore commerciale. Piastre rivestimento esterno di una qualità controllata, risultati processo automatizzato in una superficie irregolare inadatto per questo dosaggio.
   2. Mescolare la sospensione pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml, elabora 3 ml di sospensione cellulare e riempire 2 pozzi con 1 ml ciascuno. Riempire solo 2 pozzetti alla volta da una pipetta. Restituisce il volume rimanente nella pipetta alla sospensione cellulare nel tubo principale, risospendere le cellule ancora pipettando su e giù e redige un altro 3 ml per riempire altri 2 wells con 1 ml ciascuno.
      NOTA: La continua miscelazione del tubo principale è necessario perché le cellule saranno continuamente sedimentare. Elaborazione di volume sufficiente per riempire solo 2 pozzetti è necessario aggiungere il numero di cellule simili a ciascun pozzetto perché cellule sedimentare nella pipetta pure.
   3. Lavorare rapidamente per distribuire i grandi volumi di cellule perché le cellule che consentono di sedersi in sospensione a temperatura ambiente e la concentrazione di CO ₂ si modula loro clonogeniche potenziali (osservazioni non pubblicate).
   4. Ottimizzare la distribuzione spaziale delle cellule durante l'atto della loro pipettando nei pozzetti per saggi colonia. Farlo lentamente pipettando la sospensione contenente la concentrazione cellulare finale nel mezzo del pozzo. Non sottoporre il piatto per favorire il movimento prima di cellule si depositano sul fondo. Non agitare la piastra perché miscelazione circolare efficacemente centrifugare le cellule al perimetro delle ben creando alte densità di cellulari e colonie confluenti innumerevoli a 6 giorni.
      NOTA: Non mescolare se non necessario in quanto questo è meno desiderabile di alcuna miscelazione a tutti dopo l'introduzione del volume con le cellule in sospensione. Se è necessario miscelare cellule, farlo spostando la piastra posteriore e indietro in direzioni perpendicolari mentre poggia su una superficie piana.
   5. Incubare le cellule a 37 ° C 5% di CO ₂ senza cambiamento dei media per 6 giorni. Il piccolo numero di cellule in un pozzo dopo 6 giorni non influisce significativamente la composizione nutritiva o citochina né il pH del mezzo originale.
   6. Progettare il decorso del test nel modo seguente: incubare celle su fibronectina rivestite substrati del giorno 1. Sostituire medio esistente con 1 ml di media fresco o mezzo fresco contenente 10 ng / ml il giorno 0. cellule macchia il giorno 6, come di seguito 2 FGF- in 1.4). Condurre eventuali perturbazioni sperimentali il giorno 3, come di seguito al punto 1.3).
3. Perturbazioni set up sperimentale di molecolare di segnalazione o di Adesione Molecole
   1. Il giorno 3, aggiungere 10056; l di una soluzione contenente 10 volte della concentrazione finale previsto dell'agente perturbante al mezzo 1 ml nei pozzetti. Non mescolare. Continuare ad incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per altri 3 giorni.
      NOTA: Agenti perturbante può includere una varietà di inibitori e agenti di blocco delle molecole di adesione, recettori o altre proteine ​​di superficie, gli inibitori di vie intracellulari di segnalazione, molecole, fattori, cofattori o proteine ​​strutturali, che possono svolgere un ruolo nel sostenere lo stato dormiente.
   2. Colonie Stain il giorno 6, come segue.
4. Colonie Stain
   1. Cellule Macchia dopo 6 giorni in coltura con un fresco 0,1% viola cristallo nel 2% di etanolo / 10 mM borato di sodio (pH 9,0) soluzione. Aspirare e aggiungere la soluzione al cristalvioletto uno ml a ciascun pozzetto per 20 min.
   2. Lavare le piastre immergendole con le aperture e rivolti verso il basso con un angolo acuto in un secchio di ghiaccio traboccante di rubinetto in esecuzione continuadell'acqua nel lavandino. Inclinare la piastra per un angolo orizzontale, una volta sott'acqua, bene l'apertura verso il basso, e poi inclinare indietro ad angolo acuto quando si toglie in un unico movimento fluido delicato.
   3. Ripetere l'immersione 2 o 3 volte fino a quando l'acqua sul fondo dei pozzetti non è blu. Lavaggi vigorosi possono rimuovere le cellule o colonie che sono meno aderente causa di intervento sperimentale, che aumenta notevolmente l'errore nel conteggio e dati.
   4. Lastre secche durante la notte mettendo a testa in giù sul asciugamani sul banco accanto ai loro corrispondenti coperture etichettati.
5. Conta Colonie
   1. Contare il numero di crescita e dormienti colonie in ogni bene dopo 6 giorni di incubazione, colorazione e asciugatura. Contare le colonie in modo ottimale a 40X con lo zoom in un microscopio a contrasto di fase invertito. Contare colonie di> 30 cellule come cresce e colonie di 12 o meno celle, con l'aspetto morfologico di dimensioni molto grandi rispetto alle cellule in crescita, grande Expacitoplasma nded con ampio citoplasma al nucleo rapporti, mostrati in figura 1 ^7,15.
      NOTA: Gruppi di 13-29 cellule non sono normalmente considerati come non sono molto frequenti nei saggi di dormienza semplici. Essi possono essere conteggiati se perturbazioni spostano il potenziale di crescita sia cellule in crescita o dormienti. Questi risultati saranno poi bisogno di essere correlato con significato biologico.

2. clonogenica Incubazione per immunofluorescenza Studies

1. Regolare il numero di cellule a circa 7,500-8,000 cellule / pozzetto in 6 pozzetti, per corrispondere alla cella i numeri / superficie analoga a 24 esperimenti così.
2. Posizionare un giro, sterile, fibronectina rivestite fodera in ogni base ben di 6 piatti e per studi di imaging prima dell'aggiunta delle cellule. Cellule Pipettare in 3 ml di volume in ciascun pozzetto 2 pozzetti alla volta a concentrazioni delineati, come descritto per gli esperimenti clonogeniche sopra in 1.2).
3. Incubare le celluleper 6 giorni, come sopra in 1.2.4 e 1.2.5. Aggiungere fattori perturbanti il ​​giorno 3 a 10x concentrazioni in 300 volumi microlitri, come descritto nelle procedure di saggio colonia in 1.3).
4. Cellule Stain il giorno 6 con anticorpi per cellulare molecole di adesione come integrine α4, α5, α6, β1, β3, per esempio, di adesione focale molecole complesse FAK, paxillina e vinculina, per esempio, proteine ​​coinvolte nella motilità quali α-tubulina, per esempio, di segnalazione membri pathway come fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, per esempio, o qualsiasi altra proteina che è la destinazione di ricerca per il suo ruolo in dormienza, utilizzando tecniche standard per la diretta o indiretta immunofluorescenza.
   1. Rimuovere i vetrini con una pinza giorno 6. Fissare in acetone / metanolo 1: 1 a -20 ° C per 20 min e aria secca. Un fissativo alternativa, ad esempio paraformaldeide, possono essere utilizzati, se necessario. Cellule permeabilize con 0,1% Triton X-100, 0,1% di citrato di sodio per 2 min fo il rilevamento di antigeni intracellulari. Lavare le cellule con PBS.
   2. Per la colorazione immunofluorecence indiretta, scivoli blocco per 1 ora a temperatura ambiente con il 5% BSA o con 10% di siero preimmune dalla specie in cui si genera l'anticorpo secondario.
   3. Incubare per una notte a 4 ° C con anticorpi primari a cellula molecole di adesione, molecole complesse focali, segnalando membri pathway o qualsiasi altra proteina che è l'obiettivo di ricerca per il suo ruolo in dormienza diluito per diluizioni specifiche consigliate dal produttore in PBS 0,1% TRITON X -100.
   4. Lavare 3 volte con PBS. Incubare coprioggetto con anticorpi fluoroforo-coniugato a temperatura ambiente per 2 ore. Come esempio, Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG anticorpo può essere utilizzato per rilevare anticorpi primari monoclonali murini. Mount coprioggetto lato della cella verso il basso su vetrini utilizzando un agente antifade con Dapi. Sigillare i perimetri con smalto.
   5. Per immunofluorescenza diretta, effettuare la BSAil blocco di cui sopra al punto 2.4.2), incubare con anticorpo primario fluoroforo coniugato notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Incubare i vetrini con un agente antifade e Dapi e sigillare con smalto.
   6. Vassoi diapositive Coprire con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per l'imaging e la fotografia in qualsiasi momento fino a diverse settimane più tardi. Visualizzare e fotografia cellule utilizzando qualsiasi sistema di imaging microscopici fluorescenza dotato di una fotocamera a 1,000x ingrandimenti.
   7. Per fibrillare actina colorazione, i vetrini blocco in 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 min e incubare in BODIPY FL-Phallacidin (verde) o Rodamina phalloidin (rosso) a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungi un agente antifade e sigillare come sopra.

3. clonogenica incubazione per studi molecolari

1. Western Blot
   1. Incubare ER + di cancro al seno cellule MCF-7 o T47D a densità clonogenici di 20.000 cellule / 60 mm Piastra e 50.000 cellule mm piastra / 100 su fibronecstagnato piastre a 37 ° C in 5% CO _2.
   2. Incubare le cellule a densità leggermente superiori di 75.000 cellule / 100 millimetri piatto per studi molecolari richiedono quantità mg per le proteine ​​da lisati. Usa fino a dieci targhe per punto sperimentale per raccogliere sufficienti proteine ​​per studi molecolari con macchie occidentali o per l'isolamento di RNA per Northern blot.
   3. Numero delle cellule in gel a base di carico è un complemento necessario per confrontare l'espressione della proteina in cellule di crescita e dormienti molto diverse dimensioni. Raccogliere le cellule per trypsinizing e contare una aliquota in un emocitometro nello 0,2% Trypan Blue per la preparazione di lisati per Western blot invece di raschiare via le cellule con una sola lama bordo.
   4. Cellule centrifuga a 10.000 xg per 2 minuti, togliere i media per aspirazione, aggiungere 200 microlitri tampone di lisi, sonicazione le cellule in tampone di lisi e determinare la concentrazione di proteine.
   5. Calcolare la quantità di proteina per cellula dividendo la resa di proteine ​​per il numero di celluleche hanno generato tale importo. Caricare il lisato in ogni pozzetto di gel di poliacrilammide separati che rappresenta sia) quantità equivalenti di proteine ​​e b) le quantità di proteine ​​che rappresentano il numero di cellule equivalenti. Almeno 25 ug di proteine ​​deve essere caricato in ciascun pozzetto.
      NOTA: Questo permetterà il confronto tra crescita e dormienti cellule, che sono significativamente differenti in termini di dimensioni e di proteine ​​(Figura 1).
2. Citometria A Flusso
   1. Raccogliere le cellule da 100 lastre mm da tripsinizzazione, come in 3.1 e analizzare con la fluorescenza delle cellule attivi standard (FACS) i protocolli utilizzando primaria o secondaria colorazione immunofluorescenza per antigeni intracellulari o extracellulari, come indicato in 2.4.
      NOTA: Rimozione cellule da piastre di coltura tissutale mediante tripsinizzazione non influenza la concentrazione di proteine ​​di membrana come determinato mediante etichettatura anticorpo.

Risultati

Gli esperimenti sono stati condotti per ricapitolare il test. L'andamento temporale dell'esperimento è mostrato in Figura 2A. Le cellule vengono incubate a densità clonogenica giorno -1, si aggiunge FGF-2 in un mezzo fresco al giorno 0 e le cellule sono coltivate fino al giorno 6, quando sono macchiati e le colonie sono contate. Eventuali perturbazioni al sistema vengono somministrati il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni finali desiderato. Figura 2B ...

Discussione

Il nostro modello è composto da diversi elementi chiave della dormienza nel midollo osseo. Consiste di estrogeni cellule sensibili, che sono del tipo destinato a rimanere sospeso nel osseo per prolungati periodi ^10, si compone di fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo, FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dal stroma del midollo osseo e pesantemente depositato nella matrice extracellulare del midollo osseo ^31,32 e l'incubazione delle cellule con densità ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931