<em&gt; 체외</em&gt; 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구

요약

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

초록

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

서문

질병 빨리 작은 종양 혈관 ^{2,3- 개발로,} 검출 ^한 전에 유방암 세포는 골수 전이. 전이 과정은 신속한하지만 비효율적이다. 세포는 하루 ⁴ 당 수백만, 빠르게 새로운 혈관을 입력하지만 몇 원격 장기 ^(5)에 여행을 생존. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 전이는 뼈에서 생존 및 단일 세포 또는 새로 진단 된 환자 ^1에서 골수 흡인 작은 세포 덩어리로 찾을 수 있습니다. 이러한 세포들을 ^6을 제거 할 목적으로 아주 반트 투여되는 화학 요법 레지스트. 이 저항은 골수 미세 환경 ^7,8과의 상호 작용에 의해 개시 시그널링 생존하여, 실질적으로 부여된다. 미세 전이는 지역화 된 유방암 여성의 약 1/3에서 찾을 수 있으며, 단 변량 분석 ^(9)에 의해 분석 할 때 생존의 독립적 인 지표를 나타낼 수 있습니다. 일부 micrometastases 성장 시작하지만 재발의 패턴은 세포 유형에 따라 달라집니다. 트리플 부정적인 유방암 환자는 휴면 상태를 통해 가난한 제어를 제안, 1~4년 사이에 재발하는 경향이있다. ER / PR + 세포를 포함한 다른 세포 유형은 재발 ^(10)의 안정, 지속적인 속도, 최대 20 년 동안 휴면 남아있을 수 있습니다. ER + 및 ER- 유방암 세포주와 종양 사이의 휴면 유전자 발현 서명 차이는 다른 휴지 전위 ^(11)를 반영하지만, 골수 기질과의 상호 작용 가능성 휴면에 크게 기여하고있다.

미세 전이가 드문 이상 10 ⁶ -fold에 의해 조혈 세포에 의해 열세 때문에 생체 내에서 휴면의 연구는 매우 어렵다. 따라서, 관련 모델 메커니즘을 제안하고 생체 내에서 검증 가능한 가설을 생성 할 수 있습니다 체외 데이터를 제공하는 생성해야합니다. mathe 포함 휴면 모델 번호,matical 모델 ^{(12, 13),} 시험 관내 모델 ^7,8,14,15, 생체 이종 이식 모델 ^(16), 시험 관내 조합 및 이종 이식 모델 ^{(17, 18)} 및 자발적 종양 및 전이 모델 ^(19), 암 세포 휴면 ^(20)에 대한 통찰력을 수득 한 . 이러한 모델은 각각 자신의 한계를 가지고 있고 자신 분자 시그널링 및 휴면 더 생물학적으로 중요한 모델에서 시험 될 지배 상호 작용에 관한 가설을 생성하기위한 주로 유용하다.

휴면의 분자 메커니즘, ER + 세포의 재발을 초래할주기 정지, 재분화 및 치료 저항 및 메커니즘 결과 미세 환경과의 상호 작용을 정의의 전반적인 목표로, 우리는의 관련 요소를 선택 제공하는 체외 모델을 개발 간질 미세 ^7. 그 COMPO에있는 동안 상대적으로 드문 드문 한이 모델은,넌트는 휴면의 중요한 기능에 영향을주는 특정 분자 메커니즘을 유도하기 위해 수사관을 허용 할 수있을만큼 충분히 강력하다. 이러한 실험은 생체 내에서 직접 테스트 할 수있는 가설을 발생시킨다. 이 모델은 우리가 휴면에 관련 증명 몇 가지 핵심 요소에 의존한다. 그들은 그들의 상호 작용이 기층과 매체의 수용성 성분, 피브로넥틴 하층 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자의 존재에 주로 클론 원성 밀도 에스트로겐 의존성 유방암 세포, 세포 배양의 사용을 포함한다 (FGF-2) 배지.

우리는, TGFβ ^(22)을 통해 매개 된 FGF-2 ^(21)에 의해 세포주기 정지의 유도를 포함한 체외에서 시스템을 제어하는 메커니즘을 특징에 의존 상피 표현형에 PI3 키나제 ^7,8 및 ERK ^(8)와 형태 형성의 분화를 통한 신호 생존 에서 RhoA의 비활성화, 인테그린45; 5β1 상향 조절과 생존 ^7,15에 대한 기질 피브로넥틴의 결찰 (그림 1). MCF-7 세포에 FGF-2의 생체 외 세포주기 효과는 농도 10 NG / ㎖ ^(21,23) 아래에 적어도 하나의 로그를 시작한다. 이론적 근거는 포유류 ^{24 ~ 27의} 숫자에 유방 유관 형태 형성, 순환 확장과 경기 침체에 적용 FGF-2 발현의 시간적 제어를 기반으로했다. 우리는 FGF-2 도관 3D 문화 ^(28)의 형태 형성, 일반적으로 인간의 종양 ^(29)의 악성 변화로 손실되는 FGF-2의 발현을 포함, 분화를 유도하는 것을 보여 주었다. FGR1의 발현은 4 FGF 수용체 ^(30)을 표현하기 위해 계속 ⁽²⁹⁾ 및 MCF-7 세포 조사 유방암에 그대로 남아 있었다. 휴면 맥락에서, FGF-2에 의해 반출되고, 심하게는 조혈 줄기 세포 ^(33)의 기능에 보존 골수 기질 ^{(31, 32)} 상에 침착. 우리 민주 공화국FGF-2가 ⁷ 형태 형성 ^분화를 유도 골수에도 풍부한 피브로넥틴 하층, 배양 ER + 유방암 세포에서 휴면 상태를 유도함 onstrated. 모델에서 유방암 세포 성장 억제되어, RhoGap 그라프를 통해의 Rho을 비활성화 상피 표현형에 재분화 및 악성 진행과 인테그린 α5β1 lost-Express를 다시. 그들은 인테그린 α5β1 통해 피브로넥틴을 결합하고 그 세포 독성 치료 ^7,8,15 (그림 1)에 내성 렌더링 신호 생존을 활성화합니다. 클래스의 Rho GTP 아제 저해 휴면 ^{34 표현형을} 유도하는 이미 입증되었다.

여기에서 우리는 모델을 설정하고 ER + 유방암 세포의 휴면을 관리하는 특정 분자 세포 메커니즘을 연구하는 연구자를 허용 할 특정 절차를 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 실험에서는 모델의 사용을 설명하기우리의 Akt 억제제 및 PI3K 억제제와 팬의 Rho 억제제와의 Rho 키나제 (ROCK) 억제제와의 Rho 가족 (그림 1B)의 모든 회원들과 PI3K 경로 (그림 1B)를 대상으로.

프로토콜

1. 클론 원성 분석

1. 단계를 이용하여 MCF-7 및 T47D 세포는 아래 설명 에스트로겐 의존성 유방암 세포주의 단일 세포 현탁액을 준비
   1. MCF-7, T-47D 세포를 더 이상 50 % 합류하지 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지 (DMEM / 10 % 열 비활성화 우태 혈청 / 글루타민 및 펜 / 패 혈성)를 대기음. PBS로 씻어. 1-4 분 동안 37 ° C에서 0.25 % / 2.21 mM의 EDTA는 DMEM 높은 포도당에 용해 된 트립신 품어.
   2. 단일 세포 분포를 보장하기 위해 위상차 현미경 하에서 1 분 간격으로 세포를 확인한다. 거의 불변, 단일 세포 상태를 달성하기 위해 세포 - 세포 접촉을 방해하는 여러 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 2 mL를 피펫으로 세포를 재현 탁.
   3. 당신이 배양의 2 분 후 세포의 덩어리를 관찰하는 경우 최대 4 분 동안 37 ° C에서 트립신에서 세포를 배양 계속합니다. 그들은 전자에 부착 남아 있으면 클론 원성 연구에 대한 이러한 세포를 사용하지 마십시오트립신의 4 분 후에 다른 ACH는 오류가 콜로니 번호 수율로 도입 될 것이기 때문에.
      주 : 세포가 응집되어있는 경우, 콜로니의 수가 배양 세포 수보다 적은 수의 제품을 반영 할 것이다. 세포를 트립신 처리 지나치게되면 그 전위는 클론 원성이 감소 될 수있다.
   4. 필요한 전체 볼륨을 포함하는 하나의 마스터 튜브의 연속 희석하여 (셀 타입 또는 통로의 수에 따라, + 500 세포 / ml) 24 웰 플레이트, 이하 대한 / ㎖ 배지 1500 세포의 단일 세포 현탁액을 제조 실험에서의 모든 변수.
      참고 : 목표는 800 세포 ^/ ㎠ (약 500 1,100 세포 ^/ ㎠의 범위)의 최종 세포 밀도이다. 목표는 상대적으로 쉽게 계산을 허용하는, 약 100 + 50 식민지를 얻을 것입니다 군집을 방지하고 식민지가 증가 또는 실험 perturba 감소 할 때 통계적으로 유의 한 차이가 발생하기에 충분한 식민지를 허용TIONS.
2. 단계를 사용하여 클론 원성 밀도에 품어 세포는 아래에 설명
   1. 1,500 세포 / ml의 마스터 단일 세포 현탁액 관에서 / 잘 1,500 세포의 클론 원성 밀도에서 24 잘 피브로넥틴 코팅 접시에 사통 우물에서 세포를 품어. 3 ㎖를 그리기 2 각 웰에 1 ml의 배지를 조제하여 5 ml의 피펫 세포를 함유하는 배지를 씹다.
      참고 : 피브로넥틴 코팅 된 플레이트는 사전 코팅 구입해야 상용 공급 업체. 제어 품질의 외부 도장 판은, 요철면의 자동화 된 처리 결과는이 분석을 위해 적합하지.
   2. , 5 ㎖의 피펫와 피펫 팅에 의해 아래로 현탁액을 혼합 세포 현탁액 3 ㎖를 작성하고 1 ml를 각각 2 우물을 입력합니다. 한 피펫에서 한 번에 단지 2 우물을 입력합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 다시, 마스터 튜브에 세포 현탁액에 피펫에 재현 탁 세포를 나머지 볼륨을 반환하고 다른 2 WEL을 채우기 위해 다른 3 ㎖를 작성1 ml를 각각 LS.
      주 : 세포가 연속적으로 침강하므로 마스터 튜브의 연속 혼합이 필요하다. 단지 2 웰을 채우는 데 충분한 용적을 그리기 세포뿐만 피펫 퇴적물 때문에 각 웰에 유사한 세포 수를 추가 할 필요가있다.
   3. 허용 세포들은 클론 원성 잠재력 (관찰되지 않은)을 변조한다 실온 CO ₂ 농도로 현탁액에 앉아 있기 때문에 세포의 대량 분배 빠르게 작동.
   4. 식민지 분석을위한 우물로 피펫 팅의 행위 중에 세포의 공간 분포를 최적화 할 수 있습니다. 천천히 웰의 중앙으로 최종 세포 농도를 함유하는 현탁액을 피펫 팅에 의해 그렇게. 세포가 바닥에 정착하기 전에 운동을 촉진 할 수있는 판을 가하지 마십시오. 원형 혼합 효과적으로 육일에서 잘 만드는 높은 세포 밀도와 셀 수없는 합류 식민지의 주변에 세포를 원심 분리 때문에 판을 소용돌이하지 마십시오.
      참고 :이 전혀 현탁액 세포와 볼륨을 도입 한 후 믹싱보다 바람직하기 때문에 필요한 경우가 아니면 함께 사용하지 마십시오. 이 세포를 혼합 할 필요가있는 경우,이 평탄한 표면에 달려있는 동안 수직 방향으로 앞뒤로 이동하여 판 그렇게.
   5. 육일에 대한 미디어의 변화없이 37 ℃, 5 % CO _2에서 세포를 품어. 도 6 일 후 세포의 수는 현저히 작은 영양소 또는 사이토킨 조성물도 원래 배지의 pH에​​ 영향을주지한다.
   6. 다음과 같이 분석의 시간 코스 디자인 : 1 ml의 새로운 배지 또는 새로운 배지 함유 매체를 기존의 교체 일 1. 피브로넥틴 코팅 하층에 세포를 품어 FGF-2와 아래 하루 6 일 0 얼룩 세포에 10 ng를 / ㎖ 1.4). ) 1.3에서 다음과 같이, 3 일에 모든 실험 섭동을 실시한다.
3. 분자 신호 전달 또는 접착 분자의 설정 실험 교란
   1. 3 일에 100를 추가56; 웰에 1 ml의 배지에 섭동 화제의 최종 농도의 10 배의 의도를 함유하는 용액의 리​​터. 혼합하지 마십시오. 추가로 3 일간 37 ℃, 5 % CO _2에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다.
      참고 : 에이전트를 교란하는 휴면 상태를 지원하는 역할을 할 수있는 억제제의 종류 및 부착 분자, 수용체 또는 다른 표면 단백질, 세포 내 신호 경로, 분자, 요소, 보조 인자 또는 구조 단백질의 억제제의 차단제를 포함 할 수있다.
   2. 6 일에 얼룩 식민지로는 다음과 같다.
4. 얼룩 식민지
   1. 2 % 에탄올 / 10 MM의 붕산 나트륨의 갓 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (PH 9.0) 용액과 문화 6 일 후 얼룩 세포. 기음 미디어와 20 분 동안 각 웰에 하나 ㎖의 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
   2. 얼음 양동이에 예각으로 아래로 향하게 아니라 구멍이 지속적으로 실행 탭 넘쳐로 몰입하여 판을 씻으십시오싱크대에 물. 한 번 수중 수평 각도 판을 기울 잘 아래로 열고, 한 부드러운 흐르는 움직임에 제거 할 때 다음 예각으로 다시 기울이십시오.
   3. 웰의 바닥에 물이 더 이상 청색이 될 때까지 침지 2 또는 3 회 반복하지 않는다. 활발한 세척은 계산과 데이터의 오류에 크게 추가로 인해 실험 개입에 덜 부착되어 세포 나 식민지를 제거 할 수 있습니다.
   4. 거꾸로 대응하는 표지 커버 옆에있는 벤치 위에 수건을 배치하여 밤새 건조 판.
5. 식민지 카운트
   1. 배양, 염색 및 건조의 각 웰 후 6 일 만에 성장과 휴면 콜로니의 수를 계산합니다. 역 위상차 현미경에 최적으로 40 배 배율로 식민지를 계산합니다. 세포 성장, 큰 expa에 비해 매우 큰 사이즈의 형태 학적 외관, 성장과 12 이하 세포의 식민지로> (30) 세포의 콜로니를 계산큰 세포질과 nded 세포질 그림 1 ^7,15에 표시된 비율을, 핵.
      주 :이 간단 휴면 분석에 매우 자주하지로 13-29 세포의 클러스터가 정상적으로 계산되지 않습니다. 섭동 어느 성장 또는 휴면 세포의 성장 잠재력을 이동 한 경우에는 계산 될 수있다. 이러한 결과는 생물학적 중요성과 상관 될 필요가있다.

면역 형광 연구 2. 클론 원성 배양

1. 숫자 / 24 아니라 실험과 유사한 표면 영역을 셀에 대응, 6 웰 플레이트에 / 웰 약 7,500-8,000 세포에 세포 수를 조정합니다.
2. 세포 또한 이전 이미징 연구를위한 6 웰 플레이트의 각 웰 기본으로 라운드, 멸균, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립을 놓습니다. 1.2)에서 상기 클론 원성 실험 한 바와 같이 각 웰에 3 ㎖의 부피 피펫 세포 농도에서 한번에 2 웰은 설명했다.
3. 세포를 품어위와 1.2.4과 1.2.5 6 일합니다. 1.3의 식민지 분석 절차에 설명 된대로), 300 μL 볼륨에서 10 배 농도에서 3 일에 섭동 요소를 추가합니다.
4. 항체 6 일째 얼룩 세포는, 예를 들면 인테그린의 α4, α5, α6, β1, β3, 예를 들면, 국소 유착 복잡한 분자 FAK, paxillin 및 vinculin 같은 부착 분자를 셀에 같은 α-tubulin에 같은 운동성에 관여하는 단백질, 예를 들면, 인산화 된 Akt, 인산화 ERK, 포스 P38, 포스 JNK, 예를 들면, 또는 휴면에서의 역할에 대한 연구의 대상이 직접 또는 간접적으로 표준 기술을 이용하여, 임의의 다른 단백질로서 시그널링 경로 부재 면역 형광 염색법.
   1. 아세톤에 집게 하루 6. 수정을 슬라이드 / 제거 메탄올 1 : 1 -20 20 분 공기 건조를 위해 C를 °. 대안 정착액 필요할 경우 파라 포름 알데히드와 같은, 사용될 수있다. 2 분 F 0.1 % 트리톤 X-100, 0.1 % 시트르산 나트륨으로 세포 Permeabilize 하시려면세포 내 항원 또는 검출. PBS로 세포를 씻으십시오.
   2. 간접 immunofluorecence 염색, 5 % BSA와 함께 실온에서 1 시간 동안 또는 이차 항체가 생성 된 종으로부터의 10 % 혈청 preimmune 블록 슬라이드.
   3. 경로 구성원이나 PBS에 제조업체에서 권장하는 특정 희석에 희석 수면에서의 역할에 대한 조사의 대상은 다른 단백질 신호, 부착 분자, 초점 복잡한 분자를 셀에 차 항체를 4 ℃에서 하룻밤 품어 0.1 % 트리톤 X -100.
   4. PBS로 3 회 반복한다. 실온에서 2 시간 동안 형광체 공역 항체 커버 슬립을 부화. 예로서, 형석 알렉사 488 당나귀 항 - 마우스 IgG 항체는 뮤린 모노클 일차 항체를 검출하는데 사용될 수있다. 마운트 DAPI와 antifade 에이전트를 이용한 유리 슬라이드에 내려 셀측을 커버 슬립. 매니큐어와 둘레를 밀봉합니다.
   5. 직접 면역 형광의 경우, BSA을 수행위와 2.4.2에서) 차단, 4 ℃에서 하룻밤 형광체 - 복합 일차 항체에 품어. PBS로 3 회 반복한다. 매니큐어와 antifade 에이전트와 DAPI와 물개와 슬라이드를 품어.
   6. 4에서 알루미늄 호일 및 저장과 커버 슬라이드 트레이 영상 및 사진에 대해 언제까지 몇 주 이상으로 C를 °. 1000 배 확대 한 카메라가 장착 임의 형광 현미경 영상 시스템을 이용하여 조회 및 사진 셀.
   7. 근모 액틴 염색, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 슬라이드 블록을 30 분 동안 및 실온에서 20 분 동안 BODIPY FL-Phallacidin (녹색) 또는 로다 민 팔로이 딘 (적색)에서 배양. antifade 에이전트를 추가하고 위와 같이 밀봉.

분자 연구 3. 클론 원성 배양

1. 서양 오 점
   1. fibronec에 20,000 세포 / 60mm 판과 50,000 세포 / 100mm 판의 클론 원성 밀도에서 ER + 유방암 세포 MCF-7 또는 T47D을 품어주석 도금, 5 % CO _2에서 37 ℃에서 플레이트.
   2. 해물에서 단백질 mg의 양을 필요로하는 분자 연구에 75,000 세포 / 100mm 판의 약간 높은 밀도에서 세포를 품어. 서양 말을 사용하여 분자 연구 또는 북부 말에 대한 RNA 분리에 대한 충분한 단백질을 수집하는 실험 포인트 당 열 플레이트까지 사용할 수 있습니다.
   3. 휴대폰 번호를 기반으로 젤 로딩은 매우 다른 크기의 성장과 휴면 세포에서 단백질 발현을 비교하기위한 필요한 부가입니다. trypsinizing에 의해 세포를 수집하고 대신 하나의 에지 블레이드 세포를 긁어 서양 말에 대한 해물의 준비를 위해 0.2 % 트리 판 블루에서 혈구에서 나누어지는을 계산합니다.
   4. 원심 셀 2 분 동안 10,000 XG에서, 흡인 매체를 제거 200 μL 용해 완충액을 추가 용해 완충액에 세포를 초음파 처리하고, 단백질 농도를 결정한다.
   5. 셀의 개수에 의해 단백질 수율 나누어 세포 당 단백질의 양을 계산그 금액을 생성합니다. 동등한 세포 수를 나타내는 단백질의) 상응하는 금액과 B) 단백질의 양을 모두 나타내는 별도의 폴리 아크릴 아마이드 겔의 각 웰에 해물을 넣습니다. 적어도 25 μg의 단백질은 물론 각에로드해야합니다.
      참고 :이 크기와 단백질 함량 (그림 1)에서 유의 한 차이가있는 성장과 휴면 세포 사이의 비교를 허용합니다.
2. 유동 세포 계측법
   1. 3.1에서와 같이, 트립신에 의해 100mm 판에서 세포를 수집하고 2.4에 설명 된대로, 세포 내 또는 세포 외 항원 중 하나에 대한 기본 또는 보조 면역 형광 염색법을 사용하여 (FACS) 프로토콜을 정렬 기준 형광 활성 세포에 의해 분석한다.
      주 : 항체 표지에 의해 결정되는 트립신에 의해 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리하는 막 단백질의 농도에 영향을 미치지 않는다.

결과

실험은 분석 요점을 되풀이하기 위해 실시 하였다. 실험의 시간 코스는도 2a에 도시되어있다. 세포가 하루 -1에 클론 원성 밀도로 배양, FGF-2 새로운 배지에서 하루 0에 추가되고 그들이 염색하고 식민지가 계산 될 때 세포는 6 일까지 배양. 시스템에 대한 교란이 10 배 최종 농도 100 μL 볼륨에서 3 일에 투여 원하는. 그림 (b)는 성장과 휴면 식민지의 전형적인 모습을 보?...

토론

우리의 모델은 골수에서 휴면 여러 주요 요소로 구성된다. 그것은 피브로넥틴, 골수의 주요 구성 요소, FGF-2, 성장 인자가 풍부 골수 기질 합성 이루어져 에스트로겐 장시간 ¹⁰ 골수에서 휴면 가능성 유형 감수성 세포를 이루어져 무겁게 상호 작용은 주로 하층 아르 클론 원성 세포의 밀도에서 골수 ^31,32 배양의 세포 외 매트릭스에 침착. 골수 미세 환경을 훨씬 더 복잡하지만 특정 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931