Relacionando condutância estomática a Folha atributos funcionais

Resumo

Desvendando como a fisiologia e morfologia estão ligados permite uma compreensão mais profunda do funcionamento mecanicista das folhas da planta. Nós apresentamos tanto um procedimento para obtenção de parâmetros de regulação dos estômatos a partir de medições de condutância estomática e correlações com características foliares funcionais tradicionais.

Resumo

Características funcionais folha são importantes porque refletem as funções fisiológicas, como a transpiração e assimilação de carbono. Em particular, as características morfológicas de folhas têm o potencial para resumir estratégias de plantas em termos de eficiência do uso da água, padrão de crescimento e utilização de nutrientes. O espectro folha economia (LES) é uma estrutura reconhecida no funcional ecologia vegetal e reflete um gradiente de aumento da área foliar específica (SLA), de nitrogênio nas folhas, fósforo e teor de cátions, e diminuindo o conteúdo foliar de matéria seca (LDMC) e razão de nitrogênio de carbono ( NC). O LES descreve as diferentes estratégias que vão desde a de folhas de curta duração com elevada capacidade fotossintética por massa de folha de folhas de longa duração com baixas taxas de assimilação de carbono à base de massa. No entanto, traços que não estão incluídos no LES pode fornecer informações adicionais sobre a fisiologia da espécie, tais como aqueles relacionados ao controle dos estômatos. Protocolos são apresentados por uma vasta gama de folha functiotraços Nal, incluindo características do LES, mas também características que são independentes do LES. Em particular, um novo método que é apresentado refere comportamento regulamentar das plantas na condutância estomática ao défice de pressão de vapor. Os parâmetros de regulação estomática resultantes pode então ser comparado com o LES e outras características funcionais de plantas. Os resultados mostram que as características funcionais da folha LES também foram preditores válidos para os parâmetros de regulação estomática. Por exemplo, a concentração de carbono foliar foi positivamente relacionado com o déficit de pressão de vapor (DPV) no ponto de inflexão e pelo máximo da curva de condutância-vpd. No entanto, traços que não estão incluídos no LES informação adicionada para explicar os parâmetros de controle estomático: o vpd no ponto de inflexão da curva de condutância-vpd foi menor para as espécies com maior densidade estomática e maior índice estomático. No geral, traços estômatos e veia foram preditores mais poderosos para explicar a regulação dos estômatos than traços utilizados no LES.

Introdução

Para avançar a compreensão funcional de folhas de plantas, muitos estudos recentes têm tentado relacionar morfológica, anatômica e características foliares química para respostas fisiológicas, como a condutância estomática (g _S) ^1-4. Além disso, para características foliares, condutância estomática é fortemente afetada por condições ambientais, tais como fotossinteticamente ativa densidade de fluxo de fótons, temperatura do ar e vpd ^5. Várias maneiras têm sido propostos para modelar gs - curvas VPD ^6-8 que se baseiam principalmente em regressão linear de gs em vpd ^6. Em contraste, o modelo apresentado neste estudo regride logits de condutância estomática relativa (isto é, a relação de G _S a condutância estomática máxima _SMAX g) em VPD e contribui para a não linearidade através da adição de VPD como um termo quadrático regressor.

Comparado a outros modelos, o novo modelo permite a derivação de parâmetros que descrevemo vpd em que g _S é regulada para baixo sob a escassez de água. Da mesma forma, o VPD é obtido em que G _S é máxima. Como tais parâmetros fisiológicos pode ser esperado para ser firmemente ligado a assimilação de carbono ^9,10 uma estreita ligação entre esses parâmetros do modelo e as características foliares chave para alocação de nutrientes e de recursos, tal como reflectidas no LES deve ser esperado ^3,11. Em consequência, deve haver também uma estreita relação entre as estratégias de regulação dos estômatos com traços LES. Essa relação é esperado em especial para as hábito folha (evergreen contra decídua) como hábito folha é tanto correlacionado com o LES e com eficiência de uso da água ^12,13. Espécies perenes tendem a crescer mais lentamente, mas são mais eficientes em ambientes pobres em nutrientes ^14. Assim, hábito folha deve traduzir-se em diferentes padrões de regulação dos estômatos, com uma estratégia de uso da água mais conservadoras do que as espécies caducifólias.

Comparing um grande conjunto de espécies de árvores de folhas largas em uma situação Jardim comum, as seguintes hipóteses foram testadas: 1) Os parâmetros do modelo de g _{S -} modelos VPD estão ligados a características foliares relacionados com o espectro folha economia. 2) espécies perenes apresentam menor média g _{S e} g _SMAX valores que espécies decíduas.

Protocolo

1. condutância estomática

1. As medições de condutância estomática
   NOTA: Os autores fizeram uso de um tipo simples de porômetro estado estacionário (Decagon SC1). O design do porômetro tem a vantagem de tamanho pequeno, a operação manual intuitiva e de alta confiabilidade. Ao medir a condutância estomática no campo, certifique-se de minimizar a distância entre indivíduos medidos para um ciclo de medição repetida de ser o mais eficiente possível.
2. Escolha folhas de diferentes espécies e indivíduos de acordo com um padrão reprodutível (mesma altura, mesma exposição, mesma posição dentro da planta, se possível somente a partir do mesmo nó, e só a partir de uma categoria; sol ou na sombra das folhas, etc.).
   1. Apenas medida deixa em condição saudável, não danificado e totalmente desenvolvido. Marque as folhas das pessoas (por exemplo, com laços de cabo ou fita cor), para assegurar que as medidas repetidas são feitas na mesma folha.
      NOTA: MEASURements de condutância estomática deve ser feita apenas na superfície da folha, evitando a nervura central e fortes veias da folha.
   2. Comece medições nas primeiras horas da manhã, antes do nascer do sol, tendo cinco a dez medições repetidas até que os valores de condutância estomática mostra um claro declínio ao meio-dia.
      NOTA: Um curso diário das medições vai entregar bons dados para analisar as relações entre vpd e condutância estomática.
3. Medições VPD
   1. Com cada medição _S g, temperatura e umidade relativa do registro de preferência com loggers portáteis para medir directamente as condições na posição da mesma folha. Para o cálculo do déficit de pressão de vapor usar a fórmula de agosto a Roche Magnus ^15.

pressão de vapor de água = saturação e _s [hPa]

T = temperatura [° C]

4. Modelo g _S - resposta VPD
   1. Agora espécie-sábios enredo de todos os dados g _S contra vpd, combinando todos os cursos diários de folhas individuais em uma análise por cada espécie. Extrair o valor máximo observado a partir dos dados condutância estomática através de pesquisa para o valor máximo. Para dimensionar o modelo para a comparabilidade espécies-sábio, dividir os valores observados através do valor máximo observado para essa espécie (g _{S /} g _SMAX).
   2. Para cada espécie, os regredir logitos g de _{S (g} s / g _SMAX) para VPD e o termo quadrático em VPD usando um modelo linear generalizado com uma distribuição de erro binomial (a, b e c representam parâmetros de regressão):

Figura 1. Exemplo dos valores plotados e do modelo ajustado para g _{S -.} Vpd condutância estomática plotados em função do déficit de pressão de vapor para as espécies Liquidambar formosana. Pontos vazios representam os valores observados. (A) condutância estomática máxima, o vpd a condutância estomática máxima e média condutância estomática foi extraído do absoluto condutância estomática, portanto, não-dimensionado (g _S) de dados. (B) dados da condutância estomática Scaled (g _{S /} g _SMAX) foram plotados para extrair os parâmetros relativos (mostrados como pontos cheios) ^20. Re-print com a permissão de ^20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Todos os modelos embutidos para todas as espécies. Gráficos modelo para os dados de condutância estomática a regressão vpd para todas as espécies. Espécies perenes são representadas por linhas pretas, espécies caducifólias por linhas vermelhas ^20. Re-imprimir com a permissão de ^20.

NOTA: Utilizando as logits em vez de regredir g _S diretamente para vpd, leva ao ponto que modelou os valores máximos não ultrapassam g _SMAX e que g _S se aproxima de 0 a alta vpd.

5. Extraia parâmetro de regulação dos estômatos para cada espécie
   1. Calcular g modelado valores absolutos _Smax (MaxFit na Figura 1B). Para fazer isto, calcule a condutância máxima em VPD estomática de fixar o primeiro derivado de 1.4.2 a zero, o que dá VPD _gsMaxFit = -b / 2a. Insira vpd _gsMaxFit na fórmula de 1.4.2 e elevar ao poder do e obter MaxFit. Calcula-se a mEAN de todas as medições de condutividade de cada espécie (ver Figura 1A).
      NOTA: Use o software estatístico R (http://www.r-project.org).
   2. Para calcular os valores relativos, a partir do modelo escalado _(g s / g _Smax), extrair a condutância estomática e valores de VPD para os dois pontos seguintes: (1) a condutância estomática e VPD no máximo do modelo (MaxFit) e (2) VPD no segundo ponto de inflexão da curva (ver Figura 1B). Multiplicar esses valores por g _SMAX obter valores absolutos g _S para estes pontos. Ver Figura 2 para uma sobreposição completa dos modelos individuais de todas as 39 espécies analisadas.

2. Medidas de estomática Traits

1. Retirar amostras de preferência a partir de folhas exactamente as mesmas que foram utilizadas para as medições de condutância estomática. Se isso não for possível, aplicar o mesmo procedimento de selecção que foi aplicada para escolher as folhaspara as medições de condutância estomática, de preferência nos mesmos indivíduos.
2. Aplique uma fina camada de incolores, secagem rápida esmaltes (teste de diferentes marcas, alguns são mais adequados do que outros) para uma amostra fresca. Se as amostras não podem ser processados ​​imediatamente, armazená-los em álcool 70%. Após a unha polonês secou, ​​descascar delicadamente a impressão de a partir da folha e prossiga para a análise microscópica, como acontece com uma amostra de folha normal.
   NOTA: Para o caso de folhas com uma alta densidade de tricomas passo anterior, por aplicação de hidróxido de sódio ou de uma solução 1: 1 de ácido acético e peróxido de oxigénio pode levar a melhores resultados.
3. Analytics microscópio óptico
   1. Conecte uma câmera para um microscópio óptico capaz de ampliações entre 40X a 400X. Depois que a câmera é conectada ao microscópio, coincidir com as fotos tiradas com a ampliação ótica e resolução da imagem, por exemplo, com a ajuda de uma escala.
   2. Empregando i open sourcesoftware de processamento de mago como ImageJ ¹⁶ analisar estas imagens.
      1. Desenhar uma forma com a ferramenta de forma a partir da ferramenta de análise de imagem na imagem em uma área sem sujeira, impressões do polegar, áreas danificadas, ou grandes veias da folha. Contagem estômatos nesta área e no total de pelo menos 50.000 mm ² por amostra.
      2. Meça guarda dos estômatos comprimento celular e comprimento dos poros. Calcule o número de estômatos por mm ^2. Calcular o índice de estomática como a razão entre a densidade estomática epidérmica número de células ^por mm2.

3. Avaliação da veia da folha Traits

NOTA: Para a avaliação de traços veia de folha, um protocolo de Sack & Scoffoni ¹⁷ foi empregado modificado.

1. Preparação de amostra
   NOTA: Para otimizar a visibilidade das veias da folha, as folhas são primeiro branqueada e, em seguida, coradas com safranina e verde malaquita.
   1. Para branquear o leaves, deixá-los em menos de 72 horas em 50% solução de descolorante (teste de diferentes marcas, novamente algum poderia funcionar melhor). Em alternativa, utilizar 5% de solução ou solução de KOH a 10% ou 25% de solução de NaOH _{2 H2O.}
   2. Aquece-se a solução até 30 ° C ou combinar as diferentes soluções a partir do passo 3.1.1 para melhores efeitos. Lavar várias vezes em água depois. Adaptar o processo de branqueamento para as espécies específicas, dependendo das suas características de folha.
      NOTA: Thicker folhas podem precisar de períodos mais longos de banho e solução ou as soluções mais agressivas. Folhas tenras mais fino e pode ser branqueada a um grau satisfatório em menos de 72 horas.
   3. Para colorir as folhas colocá-los em 100% de etanol. Colori-los, durante 2 - 30 min em solução de safranina 1%. Para melhorar a coloração, adicione um tratamento adicional com 1% de solução de verde malaquita apenas para alguns segundos. Adaptar o protocolo para todas as espécies em termos de tempo e intensidade para atingir os melhores resultados. Enxágüe several vezes na água depois. Se as folhas são profundamente manchada, algum tempo em etanol ou descolorante pode ajudar.
2. Análise da Amostra
   1. Digitalizar as folhas com um scanner de luz de fundo em uma resolução de cerca de 1.200 dpi. Combine as varreduras tomadas para a resolução da imagem, por exemplo, com a ajuda de uma escala, para garantir que o comprimento do pixel pode ser rastreada até medidas absolutas da folha digitalizada comprimento.
   2. Medir a área, perímetro, comprimento e largura das folhas. Calcular vários índices, por exemplo, comprimento / largura e circunferência ^{2 /} área. 1 Corte um retângulo por um centímetro fora do centro da imagem. Medir o diâmetro das veias de primeira e segunda ordem (não incluem a veia principal meio). Medir o comprimento de todos os veios de primeira ordem nesta quadrícula (densidade veia).

4. Avaliação dos Outros Folha Traits

NOTA: Asses traços típicos da folha, como específicade área foliar (SLA), teor de matéria seca foliar (LDMC), área foliar, conteúdo do elemento, hábito folha, folha pinnation, folha tipo composto, folha tipo de margem etc. seguindo protocolos estabelecidos ^18,19.

1. Características foliares observacionais
   1. Avaliar pinnation folha, folha tipo composto, folha tipo de margem ea presença de nectários extraflorais ^18,19 por meio da observação no campo.
2. Características foliares analíticos
   1. Coletar amostras de folhas frescas, de preferência sobre os mesmos indivíduos que foi utilizado nas outras medições, para a determinação da área específica foliar (SLA), área foliar e conteúdo da folha de matéria seca (LDMC) ^18,19. Depois de 48 horas na estufa de secagem a 80 ° C, medir o conteúdo do elemento e proporções, de preferência, sobre as mesmas folhas.

Resultados

Muitos parâmetros de condutância estomática e regulação dos estômatos foram encontrados para ser relacionado para morfológica, anatômica e características foliares químicos. Em seguida, o foco será nos links para VPD no ponto de inflexão, que diminuiu com densidade estomática (p = 0,04) e índice estomático (p = 0,03) e aumentou com o conteúdo da folha de carbono (p = 0,02, Veja a Figura 3). Os resultados mostram que com a redução VPD no ponto de inflexão, houve uma diminuição na densidade estomática e índice estomática. Em contraste, nenhum parâmetro de condutância estomática mostraram uma clara relação ao hábito folha. A alta variação dentro dos dois grupos de hábito folha mostra que diferentes mecanismos de regulação existem tanto dentro do grupo de evergreen e hábitos de folhas decíduas.

Figura Figura 3. Resultado de the ligações entre padrões de traços de regulação da condutância e estomática déficit de pressão de vapor (DPV) no ponto de inflexão da _S g -. curva vpd (VpdPoi) como uma função de (A) densidade de estômatos, (B) índice de estômatos, e (C) folha teor de carbono ^20. Re-print com a permissão de ^20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os parâmetros de regulação dos estômatos extraídas pelo método apresentado neste artigo sublinham a importância de traços estômatos, como a densidade de estômatos eo índice de estômatos. Estes novos relacionamentos demonstrar o potencial de ligar os parâmetros de modelos fisiológicos para morfológicos, anatômicos e folha química traços ^20. Em comparação com outros métodos, a presente abordagem tem a vantagem de capturar um valor vpd única e inequívoca em que condutância estomática é regulada para baixo a metade do máximo do g modelado _s.

De todas as etapas descritas no protocolo os mais críticos são as medições de condutância estomática. Devido à regulamentação multifatorial das condições meteorológicas condutância estomática ambiente tem uma forte influência sobre g _S. Medições de condutância estomática na humidade relativa elevada e baixa intensidade de luz pode não ser confiável ^21-23. Com relação à morfológicas e Anattraços efec- tuada, o protocolo deve ser sempre adaptados às espécies-alvo incluídas no estudo. Em particular para a análise da densidade óptica, a duração da coloração e clareamento das folhas deve ser variada, dependendo da estrutura da folha e tenacidade. Potenciais limitações do método incluem espécies, para o qual as medições de condutância estomática são impossíveis ou complicado e propenso a erros devido a formas de folha extraordinárias. Isso pode incluir coníferas e gramíneas com lâminas foliares muito estreitas.

Nossos resultados confirmam, em parte, a primeira hipótese de uma ligação entre os parâmetros da condutância estomática e características foliares do espectro folha economia (LES), o que corresponde a vários outros estudos. Por exemplo, Poorter e Bongers (2006) ^{24 relataram} uma ligação estreita entre g _S e traços representados pelo LES, por exemplo, com g _S diminuindo com o aumento da expectativa de vida da folha. Por conseguinte, Schulze et ai. (1994) ¹ demonstligações claras avaliado entre teor de nitrogênio foliar e g _SMAX. Da mesma forma, Juhrbandt et al. (2004) ²⁵ encontraram relações significativas entre g _SMAX e área foliar e de nitrogênio na folha conteúdo.

A segunda hipótese de diferenças claras no que diz respeito ao hábito folha não pôde ser confirmada. A alta variação dos parâmetros e características de medição dentro evergreen e hábito folha decídua indicam que o hábito folha não é uma boa descritor do LES. Brodribb e Holbrook (2005) ²⁶ que discutiu estratégias fisiológicas hábito folha e da folha não pode ser inevitavelmente ligados desde ampla variação característica é comum em todos os tipos de hábito folha.

A abordagem pode ser alargada a traços e características fisiológicas de outros do que as folhas, por exemplo, para caracteres relacionados à hidráulica xilema órgãos da planta, tais como condutividade hidráulica xilema específico e madeira microscopia traços ^27. Da mesma forma, outrostipos de características foliares como derivados de microscopia como a estrutura do parênquima paliçádico e estrutura da camada de cera epicuticular poderiam ser incluídos ^28.

Em resumo, este estudo confirmou a estreita ligação entre o LES ea regulação dos estômatos. Além disso, o método aqui apresentado revelou facetas de padrões de regulação estomática que não estão relacionados com o LES. Especialmente características foliares específicas, tais como o tamanho dos estômatos, densidade e índice, bem como comprimento veia merecem futura atenção em estudos de plantas funcionais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC 1 Porometer	Decagon	NA	Any other porometer is suitable
Cable ties to mark leaves	NA	NA	NA
Plastic sample bags	NA	NA	NA
Paper sample bags	NA	NA	NA
Hygrometer	Trotec	NA	Any other is suitable
Nail polish	NA	NA	NA
Axioskop 2 plus	Zeiss	NA	Any other is suitable
Ethanol	NA	NA	NA
Bleach	NA	NA	NA
5% NaOH	NA	NA	NA
10% KOH	NA	NA	NA
25% H2O2	NA	NA	NA
Malachite green	NA	NA	NA
Safranine	NA	NA	NA