Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Resumo

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Resumo

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.

The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.

This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Introdução

O campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos está avançando rapidamente, com avanços na traquéia e nos rins regeneração duas conquistas recentes notáveis. Os biomateriais desenvolvidos na engenharia de tecidos estão se tornando mais acessíveis, com oportunidades para transferir tais protocolos para laboratórios menos especializados. Um campo preparado para se beneficiar através do aumento da utilização de biomateriais está em diagnóstico in vitro.

Os estudos in vitro são uma importante plataforma para investigar vias de sinalização intra-celulares dentro de tipos de células individuais, e ajudaram a delinear mecanismos subjacentes inúmeras pathophysiologies doença. Estes estudos geralmente dependem de um único tipo de célula a ser cultivada como uma monocamada em plástico de cultura de tecido (TCP); um bidimensional (2D) superfície rígida muito menos elástico e poroso do que as células de ambiente (3D) tridimensional são expostos a dentro de um tecido ou órgão. Os modelos animais têm sido tradicionalmente employed para confirmar os efeitos encontrados in vitro também se traduzem em todo o tecido, e também pode ser utilizado como plataformas pré-clínicos para investigar doenças humanas. No entanto, as diferenças entre espécies minar esta confiança em modelos animais em nossa compreensão da doença humana ^-. Por exemplo, muita compreensão da asma doença pulmonar é baseado em um modelo de rato, apesar das diferenças inerentes entre a condição humana e este modelo, incluindo pouca evidência de infiltração de mastócitos do feixe de músculo liso das vias aéreas, ou a capacidade de desenvolvimento da doença espontânea dentro do animal modelar ^3,4. Há também considerações éticas relacionadas com a utilização de modelos animais, com o "3Rs" padrão de "substituição, aperfeiçoamento e redução" na experimentação animal que está sendo incentivada no Reino Unido e em outros países.

Uma alternativa atraente seria a recapitulação de tecido humano na estrutura criando vitros para investigar a natureza cooperativa entre os tipos de células de seres humanos adultos, em uma única unidade. As células existem em estruturas multicelulares 3D dentro de tecido, cada um dentro de um micro-ambiente único. A cultura de células em TCP só permite a cultura de monocamadas de células, incapazes de se replicar este ambiente, ou fornecer a capacidade para a cultura multi-celular. Biomateriais avanço proporciona a oportunidade de desenvolver ambas as plataformas 3D naturais e sintéticos para cultura de células. Descelularizado ECM pode ser utilizado para cultura de células 3D quando repovoados com outros tipos de células, incluindo células-tronco ^1, no entanto, tais protocolos pode ser complexo e demorado, com a disponibilidade de tecido e limitada em grande parte de origem não-humana. Outros protocolos permitem maior controle sobre os ambientes celulares criadas como nanoimpressão, a deposição de ECM, tecnologias de camada de células, ou electrospinning. Electrospinning cria esteiras porosas 3D não-tecidos de fibras com diâmetros que variam de nanômetros para micrômetro, replicating dimensões ECM naturais. Andaimes electrospun são cada vez mais utilizados como plataformas de cultura de células em 3D ^-. Manipulação dos parâmetros Electrospinning permite o controle intrincado sobre características de andaime, tais como o tamanho dos poros, diâmetro da fibra, topografia e alinhamento, e química de superfície. As alterações de tais parâmetros foram mostrados para afectar directamente a adesão celular e o crescimento, quando as células foram cultivadas isoladamente.

Estas vantagens têm sido explorado no presente estudo para permitir que a cultura de vários tipos de células como uma única construção de tecido 3D, utilizando o bronquíolo das vias aéreas como uma estrutura de tecido modelo 3D. A parede bronquíolo consiste em três regiões principais (Figura 1). A mucosa é em que as células epiteliais das vias respiratórias sentar-se na interface ar-líquido (ALI), proporcionando uma barreira importante para o meio ambiente externo. Eles residem na membrana reticular basal (RBM), a ECM firmemente compacta composta principalmente de collagen IV, perlecans e lamininas. A camada de sub-mucosa encontra-se imediatamente abaixo da mucosa, uma região mais porosa composta por vários tipos de células incluindo fibroblastos, miofibroblastos e leucócitos de infiltração sob condições de doença. Finalmente feixes de músculo liso das vias aéreas a envolver em torno de uma forma helicoidal, e são constituídas por folhas alinhadas de músculo liso das vias aéreas (ASM). É parente estado contrátil do músculo liso do que controla o tônus ​​das vias respiratórias. O emprego de andaimes electrospun dentro do sistema pulmonar tinha até recentemente sido limitada a fins regenerativos; com uma substituição traqueal electrospun ser transplantadas com sucesso. Embora bem sucedido, esses tratamentos são limitados em número, e estão focados em cima da traquéia devido à natureza relativamente simples da função do tecido. Exemplos limitado de modelos de vias aéreas utilizadas para diagnóstico in vitro existem, e estão principalmente concentradas em medições contração do músculo ^liso,. O não-tóxico e nãopolímero de tereftalato de polietileno n-degradável (PET) foi previamente electrospun, e foi utilizado no presente estudo para garantir andaimes produzidos pode ser armazenada por longos períodos sem degradar (o que lhes permite ser usado "na prateleira"), e também ser adequado para cultura de células estável durante períodos de tempo prolongados. Estudos anteriores de nosso grupo mostraram que o emprego de três variações de um protocolo de electrospinning base, três andaimes electrospun PET individuais podem ser produzidos para fornecer topografias óptimas para a cultura epitelial das vias aéreas, de fibroblastos e células musculares lisas em ^21,22 isolamento e a co-cultura das vias aéreas células epiteliais e de fibroblastos ^22. Diâmetro da fibra foi encontrado para afectar grandemente funcionalidade epitelial ^22, o alinhamento das fibras e permitiu a geração de folhas alinhadas de músculo liso ^21. Estes estudos foram realizados de forma independente um do outro, em condições estáticas. No presente estudo, estes differeandaimes nt, contendo as células de seres humanos adultos totalmente diferenciada foram co-cultivadas durante uma semana no ALI num biorreactor disponível comercialmente como uma secção 3D de parede das vias aéreas, proporcionando uma fisiologicamente relevantes no modelo in vitro para investigar as respostas das vias respiratórias inter-celulares. Embora este protocolo está usando o bronchiole das vias aéreas como um sistema modelo, poderia ser adaptado como uma plataforma para a co-cultura 3D de unidades mucosas de outros órgãos.

Protocolo

ASM células primárias a partir de indivíduos não-asmáticos foram isoladas a partir de biópsias brônquicas no Hospital Glenfield (Leicester, Reino Unido), conforme descrito anteriormente. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Leicestershire e os pacientes deram seu consentimento informado por escrito.

1. Electrospinning PET Andaimes (Figura 2)

1. Prepara-se uma solução (10 ml) de grau de bebida garrafa de PET numa proporção de 1: 1 de diclorometano (DCMro) - uma solução de ácido trifluoroacético (TFA). Concentrações de PET de 8%, 30% e 10% em peso / volume (p / v) são necessários para nanofibras, microfibra e andaimes alinhados, respectivamente, e, em seguida, agita-se a solução O / N à temperatura ambiente durante o PET para dissolver.
2. Transferir a solução PET para uma seringa e anexar uma 23-G (por nanofibras) ou um 18-G (para microfibra e alinhado) agulha na seringa e coloque a seringa em uma bomba motorizada seringa. Certifique-se a ponta da agulha é rodado para a parte inferior.
3. Posicione o mandrel 15 cm de distância da ponta da agulha, assegurando a agulha é apontada para o centro do tambor.
4. Conecte o fornecimento de energia elétrica para a ponta da agulha com clips de crocodilo e aterrar o mandril (através da tomada de banana) para a terra. Ligar o fornecimento de energia para o mandril e ajustar a velocidade de 60 rotações por minuto (equivalente a cerca de 13,2 m · min ^-1) de nanofibras e microfibras andaimes. Regule a velocidade de 2.000 rpm (equivalente a cerca de 440 m · ^min-1) andaimes para Alinhados.
5. Definir a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,5 mL · h ^-1 para andaimes aleatórios e alinhadas nanofibras ou 2,0 ml · h ^-1 para andaimes de microfibra. Permitir que a bomba funcionar até que a solução é extrudida a partir da ponta da agulha, a fim de remover todo o ar no interior da agulha. Em seguida, parar a bomba.
6. Na bomba de seringa, definir o volume total da solução a ser expelido para 2 ml e ligar a bomba.
7. Set alimentação de tensão a 14 kV, e ligue o supp poderly.
8. Electrospin até 2 ml de solução foi electrospun (4 horas por nanofibras e andaimes alinhados, 1 hr para andaimes de microfibra).
9. Cortar o andaime com uma lâmina ao longo da largura do mandril. Isto produz uma folha de 2D de andaime o tamanho da área de superfície do mandril (neste caso, uma folha rectangular 22 centímetros x 11 cm), que pode ser cuidadosamente descascada o mandril). Guarde o andaime em papel de alumínio para reduzir a carga eletrostática).
   Nota: andaimes bifásicas são produzidos por eletrofiação seqüencial um andaime de nanofibras diretamente sobre um andaime de microfibra.

2. Esterilização de andaimes antes da utilização em cultura de células

1. A partir da folha de andaime, punch out discos de andaimes bifásicos ou alinhadas usando uma caneta biópsia 0,8 milímetros de diâmetro e furar a junta usando cola aquário não-tóxicas.
2. Esterilizar andaimes utilizando irradiação ultra-violeta durante 30 minutos de cada lado dos suportes antes da imersão em um 20% Vol / vol solução de antibiótico / antimicótico (2x10 ⁵ unidades de ^ml-1 de penicilina G, 2,000 mg mL ^-1 de sulfato de estreptomicina e 500? G ml ^-1 de anfotericina B) O / N a 4 ° C.
3. Lave andaimes com PBS três vezes, e depois armazená andaimes em placas de poços TCP em PBS a 4 ° C até o uso.

3. Celulares Constituintes Meios de Cultura

1. As células epiteliais de cultura CALU3 em meio DMEM-F12 suplementado com soro a 10% vol / vol de vitelo fetal (FCS), solução 2 nM de L-glutamina, 1% vol / vol de antibiótico / solução antimicótica (10.000 unidades de ^ml-1 de penicilina G, 100 mg ml ^-1 de sulfato de estreptomicina e 25 ug ml ^-1 anfotericina B).
2. Culturas de fibroblastos MRC5 e ASM em meio DMEM suplementado com soro a 10% vol / vol de vitelo fetal (FCS), solução 2 nM de L-glutamina, 1% vol / vol de antibiótico / solução antimicótica (10.000 unidades de ^ml-1 de penicilina G, 100 mg ml ^-1 de sulfato de estreptomicina e 25 ug ml ^-1 anfotericina B).
3. Cultura de co-culturas de células epiteliais de fibroblastos-ASM em um DMEM-F12 70:30: mistura de meio DMEM.

4. Sementeira de fibroblastos e células epiteliais para Bifásico Andaime

1. Numa placa de cultura de tecidos, embeber os andaimes em meio DMEM suplementado e incubar a 37 ° C durante 1 h antes de semeadura de células.
2. Remova a mídia DMEM-suplementados, coloque a fase de microfibra de andaime apical e sementes 1.5 x10 ⁴ MRC5 células de fibroblastos em 30 � de meio DMEM-suplementados. Agitar placa num agitador orbital durante 2 horas, antes de deixar em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ em ar S / N.
3. Rode o andaime sobre o modo da fase de nanofibras de andaime enfrenta apical, semente 3.0 x10 ⁴ CALU3 células epiteliais em 30 � de meio-completada DMEM-F12 para a fase de nanofibras do andaime e incubar foR 2 h a 37 ° C, 5% de CO ₂ em ar antes de submergir o andaime em 70:30 de DMEM-F12: DMEM suplementados com meios de O / N antes da transferência para o biorreactor.

5. Sementeira de Células ASM para o Alinhados Andaime

1. Numa placa de cultura de tecidos, embeber os andaimes em meio DMEM suplementado e incubar durante 1 hora a 37 ° C antes da semeadura 2,5 x10 ⁴ células em 30 ul de meio DMEM suplementado e incubando durante 2 horas (37 ° C, 5% de CO ₂ em ar). Mergulhe andaime em retorno de mídia DMEM suplementado para incubadora e deixar O / N antes da criação de um tri-cultura no biorreator.

6. Configurar o Tri-cultura utilizando o Sistema de biorreator (Figura 7)

1. Coloque a junta suporte bifásico na ranhura dentro de uma câmara com a fase epitelial voltada para cima na câmara.
2. Coloque o andaime alinhado por baixo do suporte bifásico (por isso é adjacente ao microfiber fase do andaime bifásico) e bloquear as duas câmaras do biorreator juntos.
3. Montar dois circuitos de fluxo de perfusão ligados a dois reservatórios médio (meio DMEM-F12 suplementado em reservatório apical, DMEM-F12 / meio DMEM suplementado em reservatório basal) e meios de bomba em torno dos dois circuitos em cerca de 0,1 mL / min utilizando uma bomba peristáltica (40 ml de meio é reciclado através de cada circuito). Casa todas as partes do sistema dentro de uma incubadora a 37 ° C, 5% de _CO2 em ar.
4. Depois de uma semana, remova a mídia da câmara apical e cultura as células epiteliais do ALI por mais um semana antes da análise.

Resultados

Imagens de microscopia eletrônica de varredura de tecido das vias aéreas decelularizado ou imagens immunohistological de biópsias de vias aéreas identificadas características desejáveis ​​do ECM vias aéreas queríamos introduzir em topografias de andaime electrospun: Native RBM matriz constituído por fibras de cerca de 153 nm ± 30,6 nm (média ± DP n = 50 medições ) de diâmetro (Figura 3A e 5A), enquanto que a matriz em torno do MAE foi mais porosa na natureza (Figura 3C). Seções immunohistological através de feixes musculares lisas mostrar ASM presente como folhas alinhadas de células ²¹ (Figura 3E). Esta informação foi utilizada para guiar as características introduzidas nos andaimes electrospun. Um mandril rotativo foi capaz de rodar de forma estável em altas velocidades (> 2.000 rpm / 440 m · min ^-1) para produzir scaffolds com fibras alinhadas. Mandril rotação lenta (60 rpm 13,2 m · min ^-1) não afetou a orientação da fibra, Mas produziu andaimes com espessura mais uniforme do que quando eletrofiação em um prato estático. Ao alterar os parâmetros electrospinning (concentração de PET e de taxa de fluxo de solução), que foi possível a criação de andaimes fibras com diâmetros de alguns micrómetros ou centenas de nanómetros (electrospinning parâmetros são estabelecidos na Tabela 1).

Electrospun fibras com diâmetros de fibra equivalentes às fibras naturais FRP (a 150 nm) foram produzidos utilizando uma solução de 6% de PET, no entanto em concentrações tão baixas PET, perolização das fibras ocorreu (Figura 4A). Este foi eliminado através do aumento da concentração da solução de PET a 8%, o que produziu nanofibras uniformes possuindo um diâmetro médio de 255 nm ± 2,4 nm (média ± SEM) e o tamanho médio de poros de 1,43 ^ M ± 0,02 uM (Figuras 4B, 5A e B). Para electrospin nanofibras era necessária para reduzir o tamanho da agulha de 18 G a 23 G, permitindo taxas de fluxo mais lentas whilst manter uma velocidade de fluxo mais elevada e reduzir a obstrução da agulha, um problema recorrente com a agulha maior. Quando electrospinning microfibras, um aumento na solução de PET para> 30% de chumbo de PET a uma falta de uniformidade de diâmetro de fibra (Figura 4F) em adição a vários bloqueios na ponta da agulha, devido à alta viscosidade da solução. Esteiras de microfibra uniformes que possuem um diâmetro médio de fibra de 2,50 ± 0,02 ^ M ^ M (média ± SEM) e o tamanho médio do poro de 10,45 ± 0,13 ^ M ^ M foram produzidas quando o PET electrospinning uma solução peso / volume a 30% a uma taxa de fluxo de 2 ml / h ^-1 (Figuras 4F, 5A e B). Electrospinning sequencial do andaime de nanofibras directamente sobre um andaime de microfibra (ainda ligado ao mandril) criado um suporte bifásico (Figura 3D). Os diâmetros médios de fibra eram de 280 nm ± 20 nm e 2,30 ± 0,06 ^ M ^ M para as fases de nanofibras e microfibras, respectivamente,comparável às dimensões de nanofibras e microfibras andaimes individuais. Além disso, a espessura do suporte bifásico foi semelhante à soma das nanofibras e microfibras andaimes individuais (Figura 5C). Através do aumento da velocidade mandril (2.000 rpm / 440 m · min ^-1), nano ou microfibra andaimes altamente alinhados foram produzidos. A solução a 8% de PET p / v não era óptima para a produção de nanofibras alinhados e fibras produzidas possuem uma morfologia de onda (Figura 3F). Um aumento de 10% de PET anulada este efeito, mas ainda resultou em um diâmetro de fibra reduzida (216 nm ± 2,2 nm (média ± SEM)) em comparação com os suportes de nanofibras alinhadas aleatoriamente. Alinhamento das fibras foi calculada por determinação do desvio do ângulo de cada fibra a partir do ângulo de fibra de média. Em andaimes nanofibras alinhados 79% de fibras estavam alinhados (± 10 ° de ângulo de fibra de média) em comparação com 10,2% de fibras alinhadas aleatoriamente scaff nanofibrasidade (Figura 5D).

O andaime nanofibras 8% foi usada para recapitular o MAE em que as células epiteliais residem, e foi utilizado para suportar a cultura de células CALU3 (uma linha de células epiteliais das vias respiratórias). O peso / vol andaime de microfibra de 30%, sendo mais porosa na natureza foi usado para imitar a região sub-mucosa, e foi cultivado com células MRC5 (uma linha de células de fibroblasto das vias aéreas). Os 10% peso / volume de nanofibras alinhados andaime fornecida referência topológica para garantir o alinhamento de células ASM quando cultivadas no cadafalso. Todos os três tipos de células mostraram um aumento na viabilidade quando cultivadas nos seus suportes individuais ao longo de um período de 2 semanas (Figura 6A), e expressaram proteínas específicas do tipo de células, após o período de cultura de duas semanas (Figura 6B, 6C, e 6D). Além disso caracterização de interações célula-andaime individuais têm sido relatados em outros lugares ^21,. O electrospinning sequencial do andaime de nanofibraspara o andaime de microfibra produzido um suporte bifásico para a co-cultura das células epiteliais CALU3 e células de fibroblastos MRC5 para as fases de nanofibras e microfibras, respectivamente. A cultura de células os dois em conjunto sob condições estáticas foi relatada noutro local ^22. Além disso o trabalho de tentar adicionar outras camadas de células ou prolongar os tempos de cultura bifásicas para além de 2 semanas sob condições estáticas, não foi bem sucedida (dados não mostrados). Para a cultura de um modelo tri-camadas durante um período prolongado, usamos um biorreator fluxo de perfusão. O CALU3 e MRC5 células foram semeadas sobre o suporte bifásico, e as células semeadas em ASM um andaime alinhados, e ambas foram cultivadas separadamente, durante 2 dias. Os dois suportes, em seguida, foram comprados em conjunto para formar um modelo tri-camada de parede das vias aéreas dentro do bioreactor (Figura 7). Ambas as câmaras foram perfundidos com meios para 7 dias antes da câmara de epitélio apical tinha seus meios removido, e as células epiteliais foram cultivadas a aALI durante mais 7 dias. Os andaimes foram fixadas e quer seccionado e corado, ou andaimes inteiras foram histoquímica para marcadores específicos de células. Secções através da cultura tri-camada mostrou núcleos celulares distribuídos através de todas as três camadas da co-cultura (Figura 8B). Quando as células foram imunocoradas para marcadores específicos das células, as células epiteliais preenchida a fase de nanofibras apical como uma camada confluente de células e coraram positivas para citoqueratina (Figura 8C), na fase de microfibra, fibroblastos coradas positivas para S100A4 (Figura 8D), e em os 10% de células andaime ASM alinhados manchadas positivo para SM22α (Figura 8E), indicando boa sobrevida de cada tipo de célula dentro do modelo 3D da parede das vias aéreas.

Figura 1. O bronchiole vias aéreas. A biópsia brônquica de um gravedas vias aéreas asmáticas que mostra o epitélio sobre a membrana reticular porão (RBM), com a região da submucosa subjacente preenchido com células mesenquimatosas, e os feixes de músculo liso que envolve povoadas com células de músculo liso do músculo liso coradas para alfa-actina (castanho). A barra de escala indica 200 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Um diagrama esquemático do equipamento de electrospinning. Uma seringa contendo a / solução solvente do polímero (com agulha) é colocada numa bomba de seringa de frente para o mandril. Um potencial eléctrico é estabelecido entre a agulha e fazendo com que as fibras do mandril a ser ejectadas a partir da ponta da agulha e depositadas no mandril rotativo. À medida que a fibra passa através da atmosfera,o solvente evapora, causando deposição de fibras de polímero sobre o mandril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Comparação de andaimes electrospun para ECM vias aéreas nativa. Imagens de microscópio eletrônico de varredura de membrana decelularizado cave (A), vias aéreas decelularizado bronchiole seção transversal (C) e um corte histológico de um pacote de músculo liso das vias aéreas (corados com hematoxilina e eosina, escala bar 40 mm) (E), em comparação com nanofibras (B) bifásica (D) e alinhados (F) andaimes PET. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.

Tabela 1. Parâmetros utilizados para eletrofiação a microfibra, nanofibras e andaimes alinhados individualmente e para o suporte bifásico.

Figura 4. A alteração na concentração de PET afecta as características da fibra. Imagens de microscopia electrónica de varrimento de andaimes electrospun fiados a partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% e 35% (EG) (p / v), soluções de PET . Também são mostrados andaimes alinhados produzido a partir de 8% (D) e 30% de soluções PET (H) peso / vol. AD fotografada na ampliação 5,000X, EH fotografada com uma ampliação de 1000X. Por favor clique aqui para ver um maiorversão desta figura.

Figura 5. Propriedades de andaimes PET electrospun. Curvas (A) Distribuição mostrando distribuição do diâmetro das fibras da matriz extracelular da membrana basal reticular (RBM ECM), nano e micro-fibra de andaimes alinhadas aleatoriamente, eo andaime de nanofibras alinhados. (B) Histograma mostrando a distribuição de tamanho de poro relativo em nano- e micro-fibra de andaimes. (C) A espessura média das nanofibras, microfibras, andaimes bifásicas e alinhadas (média ± desvio padrão, n = 6). (D) Histograma gráfico que mostra o desvio da orientação das fibras médio em andaimes nanofibras aleatórios ou alinhados análise de fibra andaime foi realizada utilizando o software ImageJ. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. A cultura dos tipos de células individuais sobre os suportes individuais. (A) os resultados do ensaio alamarBlue a viabilidade das células para células ASM em estruturas de suporte alinhados, CALU3 células em estruturas de suporte de nanofibras e células MRC5 em estruturas de suporte de microfibra (média ± SEM, n = 3- 20). Imagens de microscopia eletrônica de varredura do nanofibras, microfibra e andaimes fibra alinhados (B, C e D, respectivamente) e imagens de imunofluorescência de células CALU3 coradas para E-caderina (vermelho), MRC5 células marcadas para vinculin (vermelho) e ASM células coradas para SM22α (vermelho) tudo em seu andaime especializado (E, F e G, respectivamente). Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul), barra de escala indica 40 &# 181;. M Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Sistema de Perfusão para tri-camada de modelo parede das vias aéreas. (A) Fotografia do navio biorreator conectado a bomba peristáltica e reservatórios de mídia 2x. (B) Esquema dos andaimes tri-camadas. (C) esquemática dos dois circuitos de biorreatores quando o modelo das vias aéreas é realizada na interface ar-líquido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Completa 3D modelo da parede das vias aéreas. (A) A biópsia brônquica da parede das vias aéreas com a camada mucosa destacados em vermelho, a região da submucosa destacada em verde, eo feixe de músculo liso destaque em ouro. (B) Seção através da parede das vias aéreas em camadas-tri consiste em andaimes bifásicas e alinhadas povoadas com epitelial, fibroblastos e células musculares lisas fixas após 2 semanas de co-cultura. Núcleos celulares foram coradas com DAPI (azul) com reflectância andaime (cinza) simultaneamente trabalhada. Andaimes também foram fixados e histoquímica para marcadores específicos de células após 2 semanas, com células CALU3 coradas para citoqueratina (verde) (C), MRC5 células marcadas para S100A4 (verde) (D), e células musculares lisas coradas para SM22α (vermelho) ( E). A barra de escala indica 200 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1.

Discussão

A capacidade de electrospin fibras poliméricas com propriedades estruturais comparáveis ​​a ECM natural leva a numerosos polímeros naturais ou sintéticos, ou misturas de polímeros que são electrospun para recriar estes ^ambientes,. Manipulação dos parâmetros do processo (incluindo a escolha do polímero, concentração de polímero, solvente, temperatura e distância da ponta da agulha) todos podem características influência de andaime; no entanto, alguns parâmetros podem ter maior impacto sobre as propriedades de andaime que outros ^25,. Ao modificar o diâmetro da fibra de PET, encontramos os parâmetros chave para ser a concentração do polímero utilizado, a taxa em que a solução de polímero foi electrospun, e o diâmetro da agulha. Quando eletrofiação fibras alinhadas aos parâmetros principais são o método de coleta utilizado (um mandril rotativo), e a velocidade com que a rotação do mandril. Através da redução da velocidade de mandril para 60 rpm, encontramos os andaimes alinhadas aleatoriamente produzidos apresentaram maior uni andaimedeformidade em comparação com eletrofiação para um coletor de placa lisa.

As características do tecido descelularizado vias aéreas foram analisados ​​para proporcionar orientação para as diferentes topografias de andaime desenvolvidos para a cultura de cada tipo de células das vias respiratórias. Nanofibras electrospun são um andaime atraente para replicar estruturas de membrana basal, devido ao tamanho de poro pequeno, mas elevada porosidade global que permite o aumento da difusão metabolito mesmo tempo que restringe o movimento celular. ⁹ Enquanto optimizar os parâmetros de electrospinning, uma gama de concentrações de PET e as taxas de fluxo foram testados. As fibras mais finas foram conseguidos utilizando uma solução de p / vol% de PET 6, previamente utilizado por outros grupos. No entanto, altos níveis de beading, e uma falta de uniformidade foram problemas constantes. As tentativas iniciais para remover a perolização incluído a adição de um agente tensioactivo catiónico, brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), para a solução para reduzir a tensão de superfície, e teste de várias fontesde PET. A adição de agente tensioactivo reduziu a quantidade de perolização, mas não totalmente. Depois de tentar uma série de fontes comerciais de grãos de PET, alimento bebida grau garrafa PET foi utilizado, cortando-se garrafas de bebidas e dissolver estes no DCM: solução de solvente TFA. Utilizando esta como a fonte de PET resultou num aumento da uniformidade da fibra e uma redução em fibra de perolização. Aumentando a concentração da solução ligeiramente a 8% p / v e a redução do diâmetro da agulha (18G a 23G) que consistentemente produzidos nanofibras livre de defeitos com um diâmetro de fibra de cerca de 250 nm. Andaimes nanofibras electrospun pode ser altamente eletrostática após a recolha do mandril fazendo movimentação manual dos andaimes difíceis. Este foi melhorado, armazenando os andaimes em papel alumínio após fiação e imersão em 70% IMS antes do uso. Este apareceu para ajudar a dissipar a carga eletrostática residual deixado no cadafalso do processo de eletrofiação.

Para fornecer topoographies semelhante aos microambientes individuais encontradas pelos três tipos de células das vias aéreas principais dentro parede das vias aéreas, um protocolo de electrospinning básica foi adaptada para produzir três andaimes exclusivos para estes tipos de células: por eletrofiação uma solução PET baixa concentração lentamente, nanofibras alinhadas aleatoriamente foram gerados, em que as células epiteliais foram semeadas (mimetizando o MAE). Por electrospinning uma solução mais elevada concentração de PET a uma taxa mais rápida, microfibras alinhadas aleatoriamente foram gerados (produzindo um andaime mais porosa), no qual foram semeados fibroblastos (imitando a área da sub-mucosa imediatamente abaixo da RBM). Por electrospinning uma solução de baixa concentração de PET para uma alta velocidade de rotação do mandril alinhado nanofibras foram produzidos, sobre o qual as células de músculo liso orientados na direcção das fibras, produzindo folhas de células alinhadas.

Diâmetros de fibras aumentou a vantagem para o aumento da dimensão dos poros, permitindo maior penetratio celularn em andaimes e assim ajudar a criar um verdadeiro ambiente ^3D,. Andaimes microfibra foram empregues para a cultura de fibroblastos no estudo para assegurar que as células residia em planos múltiplos dentro do andaime. Ao aumentar a concentração de PET e 30% em peso / volume, de fibras de PET com um diâmetro médio de 2,5 um foi produzido. Fibras de maior diâmetro (≈ 4 mm) foram produzidas usando uma solução a 35% de PET p / v, mas a uniformidade da espessura de andaime foi perdido, e maior variabilidade entre as fibras individuais era aparente. Poros no andaime de microfibra foram mais de 7 vezes maior do que os medidos nos andaimes de nanofibras (10,45 mm vs 1,43 mm, respectivamente), mas ainda estática semeadura de células fornecida limitada penetração celular. Este foi melhorada por sementeira de forma dinâmica as células usando um misturador orbital, um método demonstrou ser eficaz anteriormente.

Andaimes nanofibras altamente alinhadas foram criados por eletrofiação a 10%em peso / vol solução PET para o mandril em rotação a 2000 rpm (440 ≈ m · min ^-1). A concentração de PET foi aumentada de 8% para evitar uma morfologia irregular de onda que as fibras expostas a concentrações mais baixas. Apesar do aumento da concentração, o alinhamento das fibras reduziu o diâmetro médio da fibra (216 nm versus 255 nm, alinhadas vs aleatório). A alta velocidade do mandril desenho as fibras para fora antes de terem secado é susceptível de causar este efeito. O alinhamento das fibras influenciado o alinhamento de células ASM, e também tem outros efeitos fisiológicos sobre as células ASM que foram caracterizadas em outra parte ^21.

A principal limitação deste protocolo é a incapacidade de células vivas imagem on / nos andaimes que fazem de ligação celular ou diferenciação inicial ao longo de um período de tempo prolongado impossível determinar, sem sacrificar amostras. Isso significa mais de otimização ocorre após o período de cultura, ou seja, corrigiring amostras e depois medir se cultura de células foi bem sucedida depois de não durante a cultura de células. Observando uma mudança de cor em andaimes incubadas em alamarBlue (azul para rosa) indica células estão presentes e viável, mas não é o ideal. Electrospinning polímeros mais transparentes, tais como gelatina pode ajudar a visualizar as células nos andaimes. O electrospinning de um andaime nanofibrous dentro do nosso modelo permitiu a replicação do FRP das vias aéreas, de forma semelhante composto de nanofibras densas em que as células epiteliais residem. Foi previamente demonstrado que as células estruturais não pode migrar através do andaime de nanofibras ^22, embora as células imunes são capazes de (dados não mostrados). Embora vantajosa para a cultura de tipos de células específicos sobre uma superfície em 3D (tais como células epiteliais e endoteliais), esta prevenção da migração das células através das nanofibras estrutural pode ser prejudicial para a cultura de outros tipos de células. Como músculo liso é incapaz de migrar através the alinhado nanofibras andaime que montou o co-cultura tri-camadas com o músculo liso e camadas de fibroblastos frente para o outro (oposto ao cadafalso alinhados que separa os dois tipos de células). Enquanto isto permite que as células sejam em estreita justaposição, o presente estudo não pode concluir se um tipo de célula (ou o de fibroblastos ou o músculo liso) ultrapassaria toda a camada ao longo de um período de cultura de mais prolongado. Apesar destas limitações, um modelo tri-camada viável de parede das vias aéreas tem sido desenvolvida que fornece uma plataforma alternativa para investigar as interacções entre estes vários tipos de células. Um estudo semelhante tri-camadas foi recentemente publicado onde fibroblastos foram incorporados dentro de um colagénio cilíndrica eu hidrogel com músculo liso semeados sobre a superfície externa e células epiteliais na superfície luminal ^17. A estabilidade mecânica dos andaimes electrospun desenvolvidos aqui permitiria tubular semelhante constrói a ser formada, e mantém-se uma corrente ReseaRCH objetivo dentro do nosso grupo. Enquanto o estudo tem incidido sobre as vias respiratórias, vários órgãos dentro do corpo partes desta unidade estrutural básica da mucosa, e através da modificação dos inquilinos realçado neste estudo, plataformas semelhantes poderia ser desenvolvido para tecidos contendo uma unidade de membrana basal, vasos sanguíneos, incluindo o da bexiga e a córnea, onde modelos baseados em várias camadas de colagénio têm sido utilizados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene terephthalate (PET)	Lucozade (GSK) bottles	N/A	Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary
Dichloromethane (DCM)			Solvent for PET
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma		Solvent for PET
Rotating Mandrel	Built in house		Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented
Syringe Pump	Harvard apparatus		used in the electrospinning process
DMEM-F12	Gibco		Culture medium for CALU3 cells
DMEM	Gibco		Culture medium for HASM cells
MEM	Gibco		Culture medium for MRC5 cells
Antibiotic/ antimycotic solution	Gibco		Media supplement
FCS	Gibco		Media supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503)	Stuart Scientific		For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds
Peristaltic Pump	Watson Marlow		For providing media flow through bioreactor
3DKube	Kiyatec		Bioreactor for 3D cell culture