Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Resumo

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Resumo

Muitas bactérias gram-negativo patogénico incluindo Yersinia spp. Empregam sistemas de secreção de tipo III para translocar proteínas efectoras para células alvo eucarióticas. Dentro da célula hospedeira as proteínas efectoras manipular funções celulares para o benefício de as bactérias. Para entender melhor o controle da secreção de tipo III durante a interação célula hospedeira, sensível e ensaios precisos para medir a translocação são obrigatórios. Nós aqui descrever a aplicação de um ensaio com base na fusão de um fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína exterior Yersinia; YopE). Com TEM-1 beta-lactamase para a análise quantitativa de translocação O ensaio baseia-se na clivagem de uma célula permeante FRET corante (CCF4 / AM) por translocado fusão beta-lactamase. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina de CCF4 pela beta-lactamase, a partir de cumarina FRET para f luoresceina é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul.Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, num modelo de ratinho. A detecção dos sinais de fluorescência pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. Na configuração descrita aqui, a translocação de fusões efectoras in vitro em células HeLa por diferentes mutantes Yersinia é monitorizada por microscopia de varrimento de laser. Gravação de conversão intracelular do repórter de FRET pela fusão efectora da beta-lactamase em tempo real fornece resultados quantitativos fiáveis. Nós aqui mostram dados exemplificativos, demonstrando o aumento da translocação de um Y. enterocolitica YopE mutante em comparação com a linhagem selvagem.

Introdução

III sistemas de secreção do tipo são máquinas de proteínas para a exportação especializada utilizados por diferentes gêneros de bactérias gram-negativas para entregar diretamente proteínas efetoras bacterially codificados em células alvo eucarióticas. Embora a própria maquinaria de secreção é altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras têm evoluído entre as diferentes espécies de bactérias para manipular vias de sinalização celular e facilitar estratégias bacterianos de virulência ^específicos 1. Em caso de Yersinia, até sete proteínas efectoras, os chamados (proteínas exteriores Yersinia) Yops, são translocados aquando do contacto da célula hospedeira e agir em conjunto para subverter as respostas das células imunes, tais como fagocitose e produção de citocina, ou seja, para permitir a sobrevivência extracelular das bactérias ^2-4. O processo de translocação é rigidamente controlado em diferentes fases ^5. Está provado que a ativação primária do T3SS é desencadeada por seu contato com a ce-alvoll ^6. No entanto, o mecanismo preciso desta iniciação está ainda a ser elucidados. Em Yersinia um segundo nível de chamada afinação de translocação é conseguido por cima ou para baixo-regulação da actividade das proteínas Rac1 ou RhoA-GTP Rho de ligação celular. Ativação de Rac1 por exemplo, invasina ou citotóxico fator necrosante Y (CNF-Y) leva ao aumento da translocação ^7-9, enquanto o GAP (GTPase proteína ativadora) função de translocado YopE down-regula a actividade Rac1 e, consequentemente, diminui a translocação por um tipo de feedback negativo mecanismo de ^10,11.

Os métodos válidos e precisos são o pré-requisito para investigar como a translocação é regulada durante a interação célula hospedeira Yersinia. Muitos sistemas diferentes têm sido utilizados para esse fim, cada um deles com vantagens e desvantagens específicas. Algumas abordagens assentam sobre a lise de células infectadas mas não as bactérias por diferentes detergentes, seguido por análise Western blot. ºe inconveniente comum destes métodos é que a lise bacteriana pequena mas inevitável potencialmente contamina o lisado celular com proteínas efectoras bactérias associadas. No entanto, foram propostas tratamento de células com proteinase K para degradar proteínas efectoras extracelulares e uso subsequente de digitonina para a lise selectiva das células eucarióticas para minimizar este problema ^12. Mais importante, estes ensaios depender crucialmente anticorpos anti-efectoras de alta qualidade, que não são na sua maioria disponíveis comercialmente. As tentativas de utilizar fusões traducionais das proteínas efectoras e proteínas fluorescentes como GFP para monitorar a translocação não foram bem sucedidas provavelmente devido à estrutura terciária das proteínas globulares fluorescentes e a incapacidade do aparelho de secreção para desdobrá-las antes de secreção de ^13. No entanto, várias marcas diferentes, como o repórter cya (dependente de calmodulina adenilato ciclase) domínio da toxina pertussis Bordetella cyclolysin ^{14 ou} o Flashtag foram usadas com sucesso para analisar a translocação. No primeiro ensaio, a actividade enzimática de CyA é utilizado para amplificar o sinal da proteína de fusão intracelular, enquanto que a etiqueta do Flash, uma marcação motivo muito curto tetraciste�a (4Cys), permite a marcação com o Flash corante biarsenical sem perturbar o processo de secreção ^15.

A abordagem aqui aplicado foi relatado pela primeira vez por Charpentier et al., E baseia-se na conversão intracelular da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) por corante CCF4 translocados efectora TEM-1 beta-lactamase fusões ¹⁶ (Figura 1A). CCF4 / AM é um composto de células-permeante em que um derivado da cumarina (doador) e uma porção de fluoresceina (aceitador) estão ligadas por um núcleo de cefalosporina. Após a entrada na célula passiva eucariótica, o não-fluorescente esterificado CCF4 / AM composto é processado por esterases celulares para o CCF4 carregada e fluorescente e assim presono interior da célula. Excitação da porção cumarina a 405 nm resulta em FRET para a porção f luoresceina, que emite um sinal de fluorescência verde a 530 nm. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina pelo FRET da beta-lactamase é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul at460 nm. Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, a técnica foi utilizada em um modelo de rato de infecção para identificar as populações de leucócitos identificados para a translocação in vivo ^17-19. A leitura dos sinais pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. De nota, o método também fornece a possibilidade de monitorar a translocação em tempo real por meio de microscopia de células ao vivo durante o processo de infecção ^20,21. Aqui microscopia de fluorescência de varredura a laser foi aplicado para readout de sinais de fluorescência, pois proporciona maior sensibilidade e precisão. Em particular, a capacidade para ajustar a janela de emissão, com uma precisão nanométrica em combinação com detectores de alta sensibilidade facilita a detecção de fluorescência optimizado e minimizada a diafonia. Além disso, esta configuração microscopia pode ser adaptada para a monitorização em tempo real de translocação e, potencialmente, permite a análise simultânea de interacção hospedeiro-patogénio a nível celular.

Neste estudo as taxas de translocação de um Y. enterocolitica estirpe do tipo selvagem e um mutante de deleção YopE exibindo um fenótipo hypertranslocator ^10,11, foram exemplarmente analisados.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. pico de emissão e Cross-talk Determinação (ver figura 2)

1. A fim de determinar os picos de emissão e quantidade de diafonia entre o doador (derivado cumarina V450) e do aceitador (fluoresceína) corantes, efectuar análises espectrais de ambas as células marcadas com fluoróforos individuais a 405 nm de excitação.
2. Determinar uma largura de banda de 10 nm no pico de cada corante que vai ser utilizado para os dadores e aceitadores (aqui canais a 455-465 nm e 525-535 nm). Traçar a intensidade normalizada ao longo do comprimento de onda e calcular a percentagem média de cross-talk do corante doador no canal receptor e vice-versa (Figura 2).

2. Preparação de Y. enterocolitica Cepas para celular Cultura Infecção

1. Use as seguintes estirpes: WA-314 PMK-óvulos (WA-314 transformada com os plasmídeos PMK-bla ^{17 e} PMK-óvulos ^17, respectivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformada com o plasmídeo PMK-bla ¹⁷⁾
2. Pelo menos dois dias antes da raia infecção Y. enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-blá de crio stocks em placas de LB-agar contendo os antibióticos necessários (canamicina para WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-óvulos ; canamicina e tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) e crescer O / N a 27 ° C. Depois manter as placas durante até uma semana a 4 ° C.
3. Um dia antes da infecção inocular 3 mL de meio LB contendo os antibióticos necessários com uma colónia das respectivas estirpes e incubar O / N a 27 ° C num agitador a 180 rpm.
4. No dia da infecção inocular 2 ml da cultura D / N em 40 ml de meio fresco LB sem antibióticos e incubar durante 90 min a 37 ° C num agitador a 180 rpm, para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo III.
5. Transferir as culturas para um tubo apropriado e manter as culturas em gelo ou a 4 ° Cdaqui em diante. Centrifugar as culturas durante 10 min a 5000 xg e 4 ° C.
6. Ressuspender o sedimento bacteriano em 2-3 ml de PBS gelado. Dilui-se a suspensão bacteriana a uma concentração de 8 x 10 ⁸ ufc / mL, utilizando um espectrofotómetro. Determinar a densidade óptica correspondente individualmente. Mantenha esta suspensão em gelo até infectar as células HeLa.

3. As células HeLa Galvanização

1. Um dia antes da semente de infecção de 1,5 x 10 ⁴ células HeLa em DMEM de 200 ul contendo 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) em poços de uma placa de 96 poços em cultivar e um _5% de CO2 a 37 ° C. Semente três poços para cada cepa (três tempos de incubação diferentes).

4. A infecção de células HeLa e carregando com CCF4

1. Infectar as células HeLa pela adição de 3,5 ul da suspensão bacteriana para a forma e misturar por pipetagem suave do meio duas vezes. Permitir que as bactérias para sedimentar emàs células a um MOI (porção de infecção) de cerca de 100 bactérias por célula. Para iniciar um curso de tempo de infecções a -90 min, -60 min e -30 min e incubar a 37 ° C numa atmosfera de _5% de CO2 até 0 min para atingir um ponto final comum.
2. Quando a incubação estiver completa, cuidadosamente aspirar o meio, sem a remoção de células HeLa e adicionar 50 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol para parar a expressão de efectores e probenecid 2,5 mM para reduzir a exportação de CCF4.
3. Neste ponto transferir a placa de 96 poços na platina do microscópio e definem pontos adequados para análise posterior em cada poço. Terminar esta etapa dentro de 10 minutos (para obter detalhes sobre a aquisição ver secção 5.1).
4. Por cavidade, adicionar 70 ul de solução CCF4 / AM de carga (solução 0,24 ul A, 1,2 ul de solução B, de 18,56 ul da solução C (solução A, B e C, desde que dentro do kit / AM carregamento CCF4) e 50 ul de PBS (contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM), utilizando um multi pipette e incubar durante 5 min à TA. A partir de agora trabalhar sem interrupções.
5. Aspirar a solução de carregamento e adicionar 100 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM usando um multi pipeta. Em seguida, transferir rapidamente a placa de 96 bem no palco microscópio e começar a aquisição no prazo de 10 min da aspiração da solução de carregamento.

5. Laser Scanning Microscopy e Análise de Dados

1. A aquisição de imagens
   1. Defina as condições de imagem de forma a maximizar a contagem total de fótons e minimizar fototoxicidade, fotodegradação e cross-excitação.
      1. Em um moderno microscópio confocal de varrimento laser, use uma alta objetiva de imersão abertura numérica 20X, abra o pinhole detector de 2,5 unidades Airy (ou seja, ampla seccionamento óptico), escolha de alta sensibilidade GaAsP-detectores com doador e receptor canais ativos simultaneamente, profundidade de 8 bits , ~ 750 nm tamanho do pixel, 3 vezes quadro de média e excite com 10% de um laser de diodo 405 nm.
      2. Para garantir a correta quantificação definir o ganho do detector de ambos os canais com o mesmo valor e para evitar quaisquer pixels saturadas.
         Nota: Aqui, os ganhos foram ajustados para 150%.
   2. Assegurar a sua imersão contínua por meio de imersão para espalhar o fundo dos poços, por exemplo com uma seringa de 1 ml, e evitar o aprisionamento de bolhas de ar.
   3. Ative a luz transmitida e encontrar um campo representante de vista em todos os poços. Use uma fase automática corretamente calibrados e marcar a posição no software.
   4. Após a remoção da placa por coloração (ver secção 4.3), reinserir a placa e adicionar um peso no topo para evitar deriva focal. Reveja as posições salvas com o modo de varredura a laser e ajustar o foco ea posição lateral corretamente.
   5. Defina o lapso de tempo de 2 minutos, a duração de 2 horas e começar a aquisição.
2. Quantificação imagem (exemplos será dado para Bitplane Softwsão como Imaris)
   1. Importe o conjunto de dados em software que permite cálculos aritméticos de matrizes de pixel. Faça isso arrastando e soltando o arquivo de origem que contém tanto o doador eo receptor de canal no ícone do software.
   2. Subtrair o fundo em ambos os canais usando o mesmo deslocamento. Para fazer isso, clique em Menu e, em seguida, clique em Imagem> Processamento> Linha de Base subtração. Selecione cada canal e insira o valor da linha de base.
   3. Corrija o sangramento-through do canal doador (CH1) para o canal receptor (CH2) com o pré-determinada correção do fator f (ver 1.1), a criação de um novo canal:
      Ch2 '= Ch2 - Ch1 * f
      NOTA: Uma sangria através do aceitador para o canal de dador não era detectável em relação ao nível de ruído.
      1. Clique em Menu> Processamento de Imagem> Canal Arithmetics e entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Depois excluir Canal 2, clicando em Menu> Editar> Excluir Channels. Certifique-se de que osangrar-through canal receptor corrigido permanece como o novo Canal 2. Opcional: Mude a cor do canal de cinza para a cor original, vá ao menu Editar> Propriedades> Imagem. Selecione Channel 4> mapeada Cor> Cor Base e alterá-lo para, por exemplo, verde.
   4. Criar um novo canal com a seguinte operação para determinar o coeficiente de FRET relação:
      = CH2 CH3 '/ (CH1 + Ch2')
      1. Vá ao Menu> Processamento de Imagem> Canal Arithmetics e entrar ch2 ./ (CH1 + CH2)
   5. Para visualização adequada do canal FRET em uma imagem de 8 bits, criar um quarto canal:
      CH4 = 255 * Ch3
      1. Vá ao Menu> Processamento de Imagem> Canal Arithmetics e digite 255 * ch3. Mude a cor do canal, vá ao menu Editar> Propriedades> Imagem. Selecione Channel 4> mapeada tabela de arquivos Color> Color> Jet.
   6. Aplicar um filtro mediano 3x3 para canais Ch3 Ch4 e that vai reduzir o ruído nas imagens. Para fazer isso, clique em Menu> Processamento de Imagem> Suavização> filtro mediano. Selecione ambos os canais e aplicar um filtro de tamanho "3x3x1".
   7. Para a quantificação de sinais celulares, detectar as células em Ch4 por corretamente configurar o deslocamento e filtrar as estruturas por tamanho para excluir demasiado pequenas estruturas.
      1. Selecione o Ultrapasse Exibir e clique no ícone "Adicionar novas superfícies". Defina os parâmetros do algoritmo de detecção na janela de Superfície. Para um processamento mais rápido, ativar a duas caixas de verificação "Segmento de apenas uma região de interesse" e "todo o processo de Imagem finalmente". Definir a região de interesse, editando suas dimensões.
      2. Selecione Channel 4 como o canal de origem e definir o limite por Thresholding> A subtração (Contraste Local) e definir diâmetro de 10 mm. Defina o limite de intensidade mínima manualmente para 0 eo limite máximo para a intensificação máximaty. Filtrar as estruturas por área e definir o valor mínimo para, por exemplo, 187 μm². Termine a detecção de superfície.
   8. Extraia os valores médios de intensidade de fluorescência do doador (CH1) e coeficiente de FRET relativa (CH3) e seus desvios-padrão na entidade celular. Para fazer isso, vá para as propriedades de superfície. Alterar a aparência das estruturas selecionando Surfaces Estilo / Qualidade> Surface. Selecione todas as estruturas, clicando na guia filtros. Unificar as estruturas detectadas indo ao processo de seleção> Unify. Exportar as estatísticas de superfície para o MS Excel, clicando na aba estatísticas> Exportar todas as Estatísticas para arquivo.
   9. Traçar esses valores ao longo do tempo. Identificar o intervalo de 10 min de inclinação máxima de aumento de fluorescência de canal doador para cada condição como um parâmetro razoável para representar a quantidade de effector translocado. Calcular o declive como m = Δ intensidade de fluorescência de dador / Δ tempo (min).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para demonstrar a capacidade do método descrito para analisar quantitativamente efectora translocação para células alvo, duas estirpes de Yersinia com diferentes cinéticas de translocação foram estudados: Y. enterocolitica estirpe selvagem WA-314 (sorogrupo O8, o plasmídeo de virulência pYVO8 ²²⁾ e seu derivado WA-314ΔYopE (WA-314 abrigar pYVO8ΔYopE ^23). Trabalhos anteriores mostraram que Y. mutantes enterocolitica falta funcional exposição YopE sign...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Nós, aqui aplicada com êxito um ensaio baseado TEM-1 repórter de beta-lactamase para a análise quantitativa de efector translocation por Y. enterocolitica. Muitas variações diferentes da técnica sensível, específico e relativamente simples têm sido descritos na literatura. Neste estudo de microscopia de varrimento a laser foi realizada para detecção mais sensível e precisa dos sinais de fluorescência. Especificamente, a correcção em função da conversa cruzada entre os corantes dadores...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-Agar	Roth	X969.2
LB-Medium	Roth	X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom)	Greiner Bio One	655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco/Life Technologies	31966-047
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM	Life Technologies	K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate	Sigma-Aldrich	L4895	Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a	BD Bioscience	560469	Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil	Zeiss	444969-0000-000	Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW
Imaris 7.6 software	Bitplane		Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime	MathWorks
Prism 5	GraphPad software