Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Riepilogo

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Abstract

Molti batteri gram-negativi, tra cui patogeno Yersinia spp. Impiegano tipo III sistemi di secrezione di traslocare le proteine ​​effettrici all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. All'interno della cellula ospite proteine ​​effettrici manipolare funzioni cellulari a beneficio dei batteri. Per meglio comprendere il controllo di tipo III secrezione durante l'interazione cellula ospite, dosaggi precisi e sensibile per misurare la traslocazione sono obbligatori. Abbiamo qui descriviamo l'applicazione di un saggio basato sulla fusione di un frammento di proteina effettore Yersinia enterocolitica (Yersinia proteina esterna; YopE). Con TEM-1 beta-lattamasi di analisi quantitativa di traslocazione Il test si basa sulla scissione di una cella permeante FRET dye (CCF4 / AM) da traslocata fusione di beta-lattamasi. Dopo la scissione del nucleo cefalosporine CCF4 dalla beta-lattamasi, FRET da cumarina a fluoresceina viene interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu emissione di fluorescenza.Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, in un modello di topo. Rilevazione dei segnali di fluorescenza può essere eseguita utilizzando lettori di piastre, analisi FACS o microscopia a fluorescenza. Nella configurazione descritta qui, in vitro traslocazione di fusioni effettrici in cellule HeLa da diversi mutanti Yersinia è monitorato mediante microscopia a scansione laser. Registrazione conversione intracellulare del reporter FRET dalla beta-lattamasi effettori fusione in tempo reale fornisce risultati quantitativi affidabili. Siamo qui Mostriamo dati esemplificativi, dimostrando una maggiore traslocazione da un Y. enterocolitica YopE mutante rispetto al ceppo selvatico.

Introduzione

III sistemi di secrezione di tipo sono macchine proteina-export specializzata utilizzati da diversi generi di batteri gram-negativi per fornire direttamente le proteine ​​effettrici batteri codificate all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. Mentre il meccanismo secretorio stessa è altamente conservata, insiemi specializzati di proteine ​​effettrici sono evoluti tra le diverse specie batteriche per manipolare percorsi di segnalazione cellulare e facilitare specifiche strategie di virulenza batterica ^1. In caso di Yersinia, fino a sette proteine ​​effettrici, i cosiddetti (proteine ​​esterne Yersinia) YOPS, sono traslocato al contatto della cellula ospite e agire insieme per sovvertire le risposte delle cellule immunitarie come la fagocitosi e la produzione di citochine, vale a dire, per permettere la sopravvivenza extracellulare dei batteri ^2-4. Il processo di traslocazione è strettamente controllata in diverse fasi ^5. E 'stabilito che l'attivazione primaria del T3SS è innescata dal suo contatto con il ce bersaglioll ^6. Tuttavia, il meccanismo preciso di questa iniziazione deve ancora essere chiarito. In Yersinia un secondo livello di cosiddetta messa a punto di traslocazione si ottiene up- o down-regolare l'attività delle proteine ​​cellulari Rho GTP-binding Rac1 o RhoA. L'attivazione di Rac1 ad esempio invasina o citotossico necrotizzante fattore Y (CNF-Y) porta ad un aumento traslocazione ^7-9, mentre la funzione del GAP traslocato YopE (GTPasi attivando proteina) down-regola l'attività Rac1 e diminuisce di conseguenza traslocazione da un tipo di feedback negativo Meccanismo di ^10,11.

Metodi validi e precisi sono il presupposto per indagare come traslocazione è regolata durante l'interazione cellula ospite Yersinia. Molti sistemi differenti sono stati utilizzati per questo scopo, ciascuno con vantaggi e svantaggi specifici. Alcuni approcci si basano su lisi delle cellule infette, ma non i batteri da diversi detergenti seguita da western blot. The svantaggio comune di questi metodi è che la lisi batterica minore ma potenzialmente inevitabile contamina il lisato cellulare con batteri associati proteine ​​effettrici. Tuttavia, il trattamento di cellule con proteinasi K per degradare proteine ​​effettrici extracellulari e successivo utilizzo di digitonina per lisi selettiva delle cellule eucariotiche sono state proposte per minimizzare questo problema ^12. È importante sottolineare che questi test cruciale dipendono anticorpi anti-effector alta qualità, che non sono per lo più disponibili in commercio. I tentativi di utilizzare fusioni traduzionali delle proteine ​​effettrici e proteine ​​fluorescenti come la GFP per monitorare traslocazione non hanno avuto successo probabilmente a causa della struttura terziaria delle proteine ​​globulari fluorescenti e l'incapacità dell'apparato di secrezione a svolgersi prima secrezione ^13. Tuttavia, diverse etichette giornalista diversi, come il cya (calmodulina-dipendente ciclasi) dominio del tossina della pertosse Bordetella cyclolysin ^{14 o} Flashtag sono stati utilizzati con successo per analizzare traslocazione. Nel primo saggio di attività enzimatica di cya viene utilizzato per amplificare il segnale della proteina di fusione intracellulare, mentre il tag Flash, un tag brevissimo tetracysteine ​​(4Cys) motivo, permette per l'etichettatura con il colorante Flash biarsenical senza disturbare il processo della secrezione ^15.

L'approccio applicato qui è stato riportato per la prima volta da Charpentier et al. E si basa sulla conversione intracellulare del Förster Resonance Energy Transfer (FRET) dye CCF4 da traslocati effettore TEM-1 beta-lattamasi fusioni ¹⁶ (Figura 1A). CCF4 / AM è un composto cellulare permeanti in cui un derivato cumarina (donatore) e un residuo fluoresceina (accettore) sono collegati da un nucleo cefalosporina. All'entrata passivo nella cellula eucariotica, il non fluorescente esterificati composto CCF4 / AM viene elaborato dalle esterasi cellulari per il CCF4 carica e fluorescente e quindi intrappolatoall'interno della cellula. Eccitazione della porzione cumarina a 405 nm risultati in FRET alla frazione fluoresceina, che emette un segnale di fluorescenza verde a 530 nm. Dopo la scissione del nucleo cefalosporina dal FRET beta-lattamasi è interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu fluorescenza at460 nm. Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, la tecnica è stata utilizzata in un modello di infezione mouse per individuare le popolazioni leucocitarie mirati per traslocazione in vivo ^17-19. Lettura dei segnali può essere condotta utilizzando lettori di piastre, FACS o microscopia a fluorescenza. Da notare, il metodo prevede anche la possibilità di monitorare traslocazione in tempo reale mediante microscopia live-cellulare durante il processo di infezione ^20,21. Qui microscopia a scansione laser a fluorescenza è stato applicato per readout di segnali di fluorescenza in quanto fornisce massima sensibilità e precisione. In particolare, la capacità di regolare la finestra di emissione con precisione nanometrica in combinazione con rivelatori ad alta sensibili facilita ottimizzato rivelazione a fluorescenza e minimizzato cross-talk. Inoltre questa configurazione microscopia può essere adattato per il monitoraggio in tempo reale di traslocazione e potenzialmente consente per l'analisi simultanea di interazione ospite-patogeno a livello cellulare.

In questo studio i tassi di traslocazione di un Y. enterocolitica ceppo selvatico e una delezione mutante YopE esibendo un fenotipo hypertranslocator ^10,11 sono stati analizzati in modo esemplare.

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Protocollo

1. picco di emissione e Cross-talk Determinazione (vedi anche figura 2)

1. Al fine di determinare i picchi di emissione e la quantità di cross-talk tra il donatore (cumarina derivato V450) e accettore (fluoresceina) coloranti, eseguire scansioni spettrali di cellule marcate con entrambi i fluorofori individuali a 405 nm di eccitazione.
2. Determinare un bandwidth 10 nm entro il picco di ogni colorante che verrà utilizzato per i canali donatore e accettore (455-465 nm qui e 525-535 nm). Tracciare l'intensità normalizzata sulla lunghezza d'onda e calcolare la percentuale media di diafonia del colorante donatore nel canale accettore e viceversa (figura 2).

2. Preparazione di Y. enterocolitica ceppi per Cell Culture infezione

1. Utilizzare i seguenti ceppi: WA-314 PMK-ovuli (WA-314 trasformato con i plasmidi PMK-bla ¹⁷ e PMK-ovuli ^17, rispettivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE trasformato con il plasmide PMK-bla ¹⁷⁾
2. Almeno due giorni prima l'infezione striscia Y. enterocolitica ceppi WA-314 PMK-ovuli, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-BLA da crio scorte su piastre LB-agar contenenti antibiotici necessari (kanamicina per WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-ovuli , kanamicina e tetraciclina per WA-314ΔE PMK-bla) e crescere O / N a 27 ° C. Successivamente mantenere le piastre fino a una settimana a 4 ° C.
3. Un giorno prima dell'infezione inoculare 3 ml di LB-mezzo contenente antibiotici richiesti con una colonia dei rispettivi ceppi e incubare O / N a 27 ° C in un agitatore a 180 rpm.
4. Il giorno di infezione inoculare 2 ml della / coltura O N in 40 ml di LB fresco-mezzo senza antibiotici e incubare per 90 min a 37 ° C in un agitatore a 180 rpm per indurre l'espressione del sistema di secrezione di tipo III.
5. Trasferire le culture in un tubo adatto e mantenere le culture in ghiaccio oa 4 ° CD `ora in poi. Centrifugare le colture per 10 min a 5000 xg e 4 ° C.
6. Risospendere il pellet batterico in 2-3 ml di PBS freddo ghiaccio. Diluire la sospensione batterica ad una concentrazione di 8 x 10 ^{8 UFC} / ml utilizzando uno spettrofotometro. Determinare la corrispondente densità ottica individualmente. Mantenere questa sospensione in ghiaccio fino infettare le cellule HeLa.

3. Cellule placcatura HeLa

1. Un giorno prima seme infezione 1,5 x ¹⁰ 4 cellule HeLa in DMEM contenente 200 microlitri di siero 10% inattivato al calore fetale bovino (FCS) in pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e coltivate in un incubatore CO ₂ 5% a 37 ° C. Seed tre pozzi per ogni ceppo (tre diversi tempi di incubazione).

4. L'infezione di cellule HeLa e caricamento con CCF4

1. Infect cellule HeLa aggiungendo 3,5 ml di sospensione batterica al mezzo e mescolare pipettando delicatamente il mezzo due volte. Consentire ai batteri di sedimento sulle cellule ad una MOI (frazione di infezione) di circa 100 batteri per cellula. Per un corso di tempo iniziare infezioni a -90 min, -60 e -30 min min e incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5% fino 0 min per raggiungere un punto finale comune.
2. Quando l'incubazione è terminata, aspirare accuratamente il medium senza rimuovere le cellule HeLa e aggiungere 50 ml di PBS contenente 20 mg / ml di cloramfenicolo per fermare espressione di effettori e probenecid 2,5 mm per ridurre l'esportazione di CCF4.
3. A questo punto trasferire la piastra a 96 pozzetti in fase di microscopio e definire punti idonei per una successiva analisi in ciascun pozzetto. Terminate questa fase entro 10 minuti (per i dettagli dell'acquisizione vedere paragrafo 5.1).
4. Per bene, aggiungere 70 ml di soluzione di CCF4 / AM carico (soluzione 0,24 ml A, 1,2 ml soluzione B, 18,56 ml soluzione C (soluzione A, B, e C fornite entro CCF4 kit / AM carico) e 50 ml di PBS (contenenti 20 ug / ml di cloramfenicolo e probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. D'ora in lavoro senza interruzioni.
5. Aspirare la soluzione di carico e aggiungere 100 ml di PBS contenente 20 mg / ml cloramfenicolo e probenecid 2,5 mm con una pipetta a più. Poi il trasferimento rapido della piastra 96 ​​bene nella fase di microscopio e iniziare l'acquisizione entro 10 minuti dalla aspirazione della soluzione di carico.

5. Laser Scanning Microscopy e analisi dei dati

1. Acquisizione di immagini
   1. Impostare le condizioni di imaging in modo da massimizzare il numero totale di fotoni e minimizzare fototossicità, photobleaching e cross-eccitazione.
      1. In un moderno microscopio confocale a scansione laser, usare un numerico alto obiettivo 20X apertura ad immersione, aprire il rilevatore foro stenopeico di 2,5 unità Airy (ad esempio, a livello di sezionamento ottico), scegliere alta sensibilità GaAsP Rivelatori canali donatore e accettore attivi contemporaneamente, profondità 8 bit , ~ 750 nm dimensione dei pixel, 3 volte telaio media e excite con il 10% di un diodo laser 405 nm.
      2. Per assicurare una corretta quantificazione impostare il guadagno del rivelatore di entrambi i canali sullo stesso valore e per evitare eventuali pixel saturi.
         Nota: Qui, i guadagni sono stati fissati al 150%.
   2. Assicurare immersione continua diffondendo mezzo di immersione al fondo dei pozzetti, per esempio con una siringa da 1 ml, ed evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
   3. Attivare la luce trasmessa e trovare un campo rappresentativo di vista in ogni pozzetto. Utilizzare una fase automatico tarato correttamente e marcare la posizione nel software.
   4. Dopo la rimozione della piastra per la colorazione (vedere paragrafo 4.3), reinserire la piastra e aggiungere un peso sopra per evitare spostamenti focale. Rivedere le posizioni salvate con la modalità di scansione laser e regolare il fuoco e posizione laterale correttamente.
   5. Impostare il lasso di tempo di 2 minuti, la durata di 2 ore e iniziare l'acquisizione.
2. Quantificazione Immagine (esempi sarà dato per Bitplane Softwsono tali da Imaris)
   1. Importare il set di dati in un software che permette di calcoli aritmetici di matrici di pixel. A tale scopo, trascinando il file di origine che contiene sia il donatore e il canale accettore sull'icona del software.
   2. Sottrarre il fondo in entrambi i canali con lo stesso offset. Per fare questo, fare clic su Menu e quindi fare clic su Immagine> produzione> Baseline sottrazione. Selezionare un canale e immettere il valore di base.
   3. Correggere lo sfiato-through del canale donatore (Ch1) nel canale accettore (Ch2) con il predeterminato correzione del fattore f (vedi 1.1), creando un nuovo canale:
      Ch2 '= Ch2 - Ch1 * f
      NOTA: A spurgo attraverso del accettore nel canale donatore non era rilevabile rispetto al livello di rumore.
      1. Fare clic su Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e inserire abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Successivamente eliminare Canale 2 facendo clic su Menu> Modifica> Elimina Canali. Assicurarsi che ilspurgo attraverso il canale accettore corretto rimane come il nuovo canale 2. Opzionale: Modificare il colore del canale dal grigio al colore originale andando su Menu> Proprietà Modifica> Immagine. Selezionare Channel 4> mappata colore> colore di base e modificarlo, ad esempio,, verde.
   4. Creare un nuovo canale con la seguente operazione per determinare il coefficiente relativo FRET:
      Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')
      1. Vai a Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e inserire ch2 ./ (ch1 + ch2)
   5. Per una corretta visualizzazione del canale FRET in un'immagine a 8 bit, creare un quarto canale:
      Ch4 = 255 * Ch3
      1. Vai a Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e immettere 255 * ch3. Cambiare il colore del canale andando su Menu> Proprietà Modifica> Immagine. Selezionare Channel 4> mappata File Table colori> Colore> Jet.
   6. Applicare un filtro mediano 3x3 ai canali CH3 e CH4 that ridurrà il rumore nelle immagini. Per fare questo, fare clic su Menu> Elaborazione immagini> Smoothing> Filtro mediano. Selezionare entrambi i canali e applicare un formato del filtro "3x3x1".
   7. Per la quantificazione dei segnali cellulari, rilevare le cellule in Ch4 impostando correttamente l'offset e filtrare le strutture in base alla dimensione di escludere troppo piccole strutture.
      1. Selezionare il Surpass Visualizza e fare clic sull'icona "Aggiungi nuove superfici". Definire i parametri dell'algoritmo di rilevamento nella finestra di superficie. Per l'elaborazione più veloce, attivare la due caselle di controllo "Segmento solo una regione di interesse" e "Processo intera immagine finalmente". Definire la regione di interesse, modificando le sue dimensioni.
      2. Selezionare Channel 4 come canale sorgente e impostare la soglia da Thresholding> Sfondo Sottrazione (Contrasto Locale) e impostare un diametro di 10 micron. Impostare la soglia minima intensità manualmente a 0 e la soglia massima al massimo intensity. Filtrare le strutture per area e impostare il valore minimo per esempio, 187 μm². Finire la rilevazione della superficie.
   8. Estrarre i valori medi per intensità di fluorescenza del donatore (Ch1) e il coefficiente relativo FRET (Ch3) e loro deviazioni standard nell'entità cellulare. Per fare questo, andare alle proprietà di superficie. Modificare l'aspetto delle strutture selezionando Surfaces Style / Qualità> Surface. Selezionare tutte le strutture facendo clic sulla scheda filtri. Unificare le strutture rilevate andando a processo di selezione> Unify. Esportare le statistiche di superficie in MS Excel facendo clic sulla scheda statistica> Esporta tutte le statistiche su file.
   9. Tracciare questi valori nel tempo. Identificare l'intervallo 10 min di pendenza massima di aumento della fluorescenza canale donatore per ogni condizione come un parametro ragionevole per rappresentare la quantità di effettore traslocato. Calcolare la pendenza come m = Δ intensità di fluorescenza del donatore / tempo Δ (min).

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Risultati

Per dimostrare la capacità del metodo descritto per analizzare quantitativamente effettrici traslocazione in cellule bersaglio, sono stati studiati due ceppi Yersinia con differenti cinetiche traslocazione: Y. enterocolitica ceppo selvatico WA-314 (sierogruppo O8, l'ospitare il plasmide di virulenza pYVO8 ²²⁾ e la sua derivata WA-314ΔYopE (WA-314 ospitare pYVO8ΔYopE ^23). Lavoro precedente ha mostrato che Y. mutanti enterocolitica privi funzionale mostra Yo...

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Discussione

Siamo qui applicato con successo un saggio basato TEM-1 beta-lattamasi giornalista per l'analisi quantitativa dei effettori traslocazione di Y. enterocolitica. Molte diverse varianti di questa tecnica sensibile, specifico e relativamente semplice sono state descritte in letteratura. In questo studio microscopia a scansione laser è stato condotto per il rilevamento più sensibile e preciso dei segnali di fluorescenza. Specificamente la correzione per diafonia tra i coloranti donatore e accettore e ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-Agar	Roth	X969.2
LB-Medium	Roth	X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom)	Greiner Bio One	655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco/Life Technologies	31966-047
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM	Life Technologies	K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate	Sigma-Aldrich	L4895	Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a	BD Bioscience	560469	Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil	Zeiss	444969-0000-000	Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW
Imaris 7.6 software	Bitplane		Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime	MathWorks
Prism 5	GraphPad software