Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Resumo

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Resumo

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introdução

O método descrito pretende analisar concentrações de corticosterona em fezes equina, a fim de fornecer uma avaliação não-invasiva da actividade supra-renal. Medir a atividade do hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) é uma abordagem aceite para estudar a resposta a situações potencialmente aversivas em ambas as espécies em cativeiro e domésticos. A técnica de referência e o método mais amplamente utilizado é o uso de ^um plasma sanguíneo no entanto, métodos alternativos, tais como a análise fecal foram desenvolvidas de modo a ultrapassar a tensão induzida por amostragem de sangue em si e permitem que a capacidade de monitorar as espécies que vão livre.

Durante uma situação de aversivo, homeostase fisiológica é interrompido. O hipotálamo no cérebro libera hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que atua na glândula pituitária e estimula a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). ACTH entra na corrente sanguínea e estimula o córtex adrenal a secretar speciede s glicocorticóides específicos (CG). Os glicocorticóides estão intimamente ligados a eventos estressantes ao invés de ser consistentemente produzidos em todos os estados de energia elevada, portanto, eles são muitas vezes medidos em preferência sobre outros de estresse ligado hormônios ^2. Os glucocorticóides são responsáveis ​​por diversos efeitos adaptativos em cavalos. A energia é rapidamente mobilizados a partir de locais de armazenagem no corpo sob a forma de ácidos gordos e de glucose, o consumo de oxigénio é aumentada, a função sensorial é reforçada ³ e o fluxo sanguíneo é reduzido em áreas não necessárias para o movimento ^4. Além de atuar como um mecanismo de enfrentamento, o aumento induzido stress na glicocorticóides também pode ajudar a preparar o animal para a próxima estressor ^5.

Avaliando os níveis de hormona no plasma e na saliva envolve a medição da hormona em circulação real no entanto, a medição dos metabolitos nas fezes medidas do produto final metabólico da hormona. esteróides circulantes são catabolized na lIver antes da excreção para a bílis onde sofrem mais alterações facilitados pelas atividades enzimáticas da flora bacteriana intestinal dentro da faixa ^6. Portanto, imunoensaios dirigidos a glucocorticóides no sangue pode não ser adequado para análise de metabolitos fecais ^{7 glucocorticóides.}

Como recolha de fezes pode ser levada a cabo sem perturbar o cavalo, a análise de fezes para corticosterona, tem sido amplamente utilizado para monitorizar a actividade HPA num número de circunstâncias. Corticosterona elevada nas fezes de cavalos tem sido relatada em resposta a situações potencialmente aversivas, nomeadamente durante o tratamento veterinário pós-operatório ⁸ e em habitação restritiva ^9. Amostragem fecal reflete um nível de glicocorticóides agrupada ao longo do tempo, em vez de o ponto de amostragem de tempo oferecido pelo plasma e saliva tornando-o adequado para o acompanhamento a longo prazo, crónica ou padrões sazonais ^10. Devido à não-invasivanatureza do método, as amostras podem ser colhidas repetidamente para um indivíduo sem a necessidade de captura ou de contenção ^11. No entanto, as espécies de tempo específico trânsito intestinal deve ser levado em conta no planejamento de um protocolo de amostragem. Em cavalos, tempo de trânsito intestinal é de cerca de 18 h, por conseguinte, ^12, resposta adrenal e metabolitos subsequentes de corticosterona pode ser detectado nas fezes um dia após a activação inicial do eixo HPA.

Ao utilizar técnicas de imunoensaio não-invasivos uma validação cuidadosa para a espécie a ser investigada é essencial ^13. Além disso, as diferenças de sexo na excreção de metabolitos da hormona foram relatados provavelmente devido a diferenças na taxa metabólica e o tipo de metabólito excretado corticosterona em várias espécies, incluindo ratos, ¹⁴ e ¹⁵ galinhas. Foi, portanto, importante como parte deste método que o ensaio foi validado para uso em cavalos domésticos masculinos e femininos, como está detalhado no the protocolo. Essa diferença no metabolismo hormonal entre os sexos tem consequências para a qualidade dos dados, no entanto, raramente é abordada e incluído como parte da validação do ensaio.

Este método não-invasivo permite a avaliação de longo prazo da atividade adrenal em cavalos domésticos. Os detalhes do protocolo tanto a validação do ensaio e da técnica de ensaio em si.

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Protocolo

declaração de ética: os procedimentos que envolvem temas de amostragem de campo e animais foram aprovados pela Escola de Animal, Rural e Ciência Ambiental (ARES) na Nottingham Trent University.

1. Recolha de amostras fecais

NOTA: Devem ser usadas luvas ao manusear amostras fecais e metanol. Se existe uma forte suspeita de que um animal pode estar sofrendo de uma doença zoonótica, roupas de proteção, como também deve ser usado um jaleco.

1. Recolha das amostras fecais, o mais rapidamente possível (dentro de minutos a algumas horas) após a defecação e colocá-los dentro de um saco de amostra. De três a cinco subamostras de qualquer amostra defecated com um peso total de aproximadamente 10 g. Rotular o saco com o tempo e a data da colheita, identificação individual e congelar a amostra a -20 ° C até à análise.
2. Para minimizar o erro, congelar as amostras a -20 ° C até o estudo estar completa, em seguida, reunir as amostras para análise em conjunto como um único lote.

2. Fecal Hormone Extração

1. Deixar as amostras fecais para descongelar à temperatura ambiente.
2. Certifique-se de que as amostras são homogeneizadas por mistura manualmente cada amostra em seu próprio saco de amostra.
3. Para cada amostra, pesar 0.50 (± 0,003 g) de material fecal numa microbalança de um barco de pesagem, em seguida, transferir as fezes para um frasco de vidro de 8 mL. Use um novo pesar barco para cada amostra e limpar a pinça com 30% de metanol entre cada amostra.
4. Combinar a 0,5 g de material fecal, com 5 ml de 90% de metanol: água, e agitar O / N num agitador orbital, à temperatura ambiente.
5. Na manhã seguinte, vortex a amostra e, em seguida, centrifuga-se durante 20 min a 600 g.
6. Decantar a fracção de metanol num tubo de vidro de 16 x 125 ^mm2 e colocar num suporte num banho de água regulado para uma temperatura de 37 ° C. Evaporar a seco usando ar em uma câmara de exaustão. Lavar o frasco de extração e coloque o sedimento fecal restante em um saco de resíduos clínicos para a eliminação.
7. Re-suspender os extractos fecais em 100%, 1 ml de metanol e transferir para um tubo de polipropileno de 12 x 75 ^mm2. Imediatamente PAC e armazenar a -20 ° C até análise.

3. Análise Hormona

1. Realizar a análise com uma enzima ligada-imunoensaio (EIA), utilizando soro policlonal corticosterona CJM006.
   NOTA:. Um segundo EIA foi testado (Cortisol R4866 anti-soro, mas este não conseguiu alcançar a etapa de validação bioquímica (ver secção 4.1) O anti-soro policlonal corticosterona CJM006 e Cortisol R4866 anti-soro e do respectivo HRP de são fornecidos por CJ Munro, da Universidade da Califórnia, Davis, CA.
2. Diluir o anti-soro a 1: 15000 em tampão de revestimento (NaHCO3 0,05 M, pH 9,6) utilizando uma pipeta repetitivo e uma ponta de pipeta 50 ul, carregar uma placa de microtitulação de 96 poços com 50 ul / poço. Cobrir a placa com um vedante de placa e incubar O / N a 4 ° C. Deixar dois poços não revestidos para representar as cavidades de ligação não específica (NSB).
3. Imediatamente antes da utilização lavar as placas de microtítulo cinco vezes utilizando um lavador de placas de microtitulação automático (solução de lavagem; 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20).
4. Carregar as placas com 50 ul por poço, durante a NSB de e poços [tampão EIA (0,1 M _NaPO4, NaCl 0,149, 0,1% de albumina de soro de bovino, pH 7,0) somente] "zero", padrões (corticosterona, 3,9 - 1.000 pg / bem) ou amostras de extracto fecal (apropriadamente diluído em 1:20 tampão EIA, ver secção 4.1). Normas e zeros deve ser executado em triplicado e quadriplicado, respectivamente. Diluídas amostras de extracto fecais e NSB de deve ser executado em duplicado.
5. Siga este imediatamente com a adição de 50 ul / cavidade do rótulo ^ᵻ rábano conjugado com peroxidase diluído em tampão EIA para 1: 70000.
6. Incubar as placas de microtitulação no escuro durante 2 horas à temperatura ambiente.
7. Lavam-se as placas de microtitulação com uma solução de lavagem 5 vezes e incuba-se as placas à TA no escuro com 100 ul / WELl de substrato RT [0,4 mM de 2,2'-azino-di- sal (ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico) de diamónio, 1,6 mM de H ₂ O _2, citrato 0,05 M, pH 4,0]. Prepara-se o substrato imediatamente antes do uso.
8. Usar um espectrofotômetro no comprimento de onda de 405 nm e ler as placas de microtítulo. A incubação das placas é considerada completa quando a densidade óptica dos poços de zero atinge 0,8 a 1,0.
9. Para assegurar a reprodutibilidade, utilizar controlos [normas EIA ou uma amostra biológica diluída em tampão EIA para se ligar a cerca de 30% (padrão EIA), 50% (uma amostra biológica, por exemplo, piscina de cavalo doméstico extracto fecal) e 70% (padrão EIA) ] para demonstrar uma intra- e inter-ensaio coeficientes de variação de <10% e <15%, respectivamente.

4. Enzyme Linked-imunoensaio: Validação para as espécies Estudo e Sexo

1. Biochemical Validation (Paralelismo)
   1. Usando tampão EIA, execute uma diluição em série em pool fecal adicionalct, de preferência proveniente de amostras suspeitas de alta e baixa concentração de hormônio de vários indivíduos (intervalo: puro, 1: 2 a 1: 8192) e executado no EIA como descrito na seção 3.
      NOTA: Um paralelismo é considerada alcançada quando as diluições em série de extractos fecais produzir uma curva de deslocamento paralelo com os resultados da curva de regressão linear e padrão demonstram R2> 0,90, uma inclinação> 0,50 e p <0,05. O extracto fecal diluídos em série que liga-se a cerca de 50% na curva padrão deve ser considerada a diluição ideal para executar todos os extractos fecais (por exemplo, 1:20). Não há nenhuma interferência considerado no ensaio, quando os resultados de regressão linear demonstram R2> 0,90 e p <0,05.
2. Biochemical Validation (Interferência)
   1. Pico de 200 ul de padrões diluídos em série (zero, 3,9 a 1000 ng / poço de corticosterona) com 200 ul do extracto fecal apropriadamente diluído reunidas [diluído a 50% de ligação determinadas por ParalleliSM (01:20)] e executado no EIA como na secção 3. A seguir trama análise EIA a concentração observada menos o fundo (concentração da amostra zero) em função da concentração esperada.
      NOTA: Se a adição de extrato fecal reunidas diluída com padrões não altera significativamente os resultados da regressão quantidade esperada e lineares produz R ^2> 0,90, uma encosta perto de 1,0 e p <0,05. Nenhuma interferência com o EIA foi alcançado.
3. Validação Biológica:
   NOTA: A demonstração de que o EIA escolhido tem a capacidade de medir as mudanças biologicamente relevantes da hormona de interesse [por exemplo, o aumento da concentração de glicocorticóides na sequência de um farmacológico (ACTH é muitas vezes um procedimento licenciado) ou desafio biológico (por exemplo, psicológica e / ou ambiental; mais provável que seja um acontecimento desregulada oportunista)].
   1. Selecione, extrair e analisar amostras fecais para as concentrações de metabólitos de glicocorticóidesusando o processo descrito nas secções 1-3 antes e depois de um evento desafiador.
      NOTA: Um evento desafiador será espécies específicas. Um método de exemplo é fornecido abaixo para o cavalo doméstico. Exemplos completos de eventos desafiadores para os cavalos têm sido publicados anteriormente, incluindo o uso de gestão ⁹ e maneio procedimentos ^16. Um aumento significativo nas concentrações de metabolitos de glucocorticóides após o evento desafiador devem ser observadas e confirmadas por meio de análise estatística. Esta deve incorporar, onde apropriado, o efeito de medidas repetidas, data da amostra e individuais. validação biológico é então considerado alcançado.

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Resultados

cavalos domésticos (n = 16, 8 éguas, 8 capões), com uma idade média de 15 anos (± 3) foram agrupados de acordo com o sexo e submetido a quatro projetos de habitação com níveis crescentes de isolamento social (n = 4 cavalo / tratamento). Habitação 1 envolveu cavalos que vivem em um ambiente de rebanho, simulando intimamente seu habitat natural. Habitação 2 envolvidos cavalos que vivem em pares em um celeiro interior. Habitação 3 cavalos envolvidos alojado sozinho em estábul...

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Discussão

análise de corticosterona fecal fornece um meio de avaliar os padrões de longo prazo da atividade adrenal em cavalos. A natureza não-invasiva do método supera os efeitos de confusão de outros métodos de amostragem utilizados para avaliar a atividade adrenal incluindo saliva e no plasma análise ^9. Além disso, a técnica tem uma vantagem não-invasivo claro se estudando cavalos livres que vão.

Há vários pontos-chave para discussão em relação a este método e seu uso ad...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore