대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

요약

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

초록

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

서문

방법 설명 목적은 부신 활성의 비 침습적 평가를 제공하기 위해서 말 대변 코르티 코스 농도를 분석한다. 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축 활동을 측정하는 것은 포로 및 국내 종 모두에서 잠재적으로 혐오 상황에 대한 반응을 연구하는 허용 방법입니다. 참조 기술과 가장 널리 사용되는 방법은 그러나, 배설물 분석과 같은 다른 방법이없는 범위 종을 감시하는 기능을 채혈 자체에 의해 유도 된 응력을 극복 할 수 있도록하기 위해 개발 된 혈장 ^(1)의 사용이다.

혐오 상황시, 생리적 항상성이 파괴된다. 앞쪽에 뇌하수체에 작용하여 부 신피질 자극 호르몬 (ACTH)의 방출을 자극 방출 호르몬 (CRH)를 corticotrophin 뇌 릴리스의 시상 하부. ACTH는 혈류를 입력하고 종을 분비하는 부신 피질을 자극s의 특정 글루코 코르티코이드 (GC). 글루코 코르티코이드는 밀접하지 않고 지속적으로 그러므로 그들은 종종 다른 스트레스 링크 ^호르몬이 이상 환경에서 측정 된 모든 에너지를 높게 한 상태에서 생산되고보다 스트레스가 이벤트에 연결되어 있습니다. 글루코 코르티코이드는 말을 여러 적응 효과에 대한 책임이 있습니다. 에너지가 급속 지방산 및 글루코스의 형태로 본문에 저장 사이트로부터 동원되는 산소 섭취량은 감각 기능 ^3을 향상 혈류가 이동 ⁴ 불필요 영역 감소, 증가된다. 뿐만 아니라 대응 메커니즘으로 작용하는 글루코 코르티코이드에 의한 응력 상승은 다음 스트레스 ⁵ 동물을 제조하는 데 도움이된다.

호르몬 혈장 수준과 침을 평가하는 것은 배설물 대책 호르몬의 대사 최종 제품 대사를 측정하지만 실제 순환 호르몬을 측정하는 것을 포함한다. 순환 스테로이드는 리터에 이화된다그들은 장 트랙 ^6에서 세균성 식물의 효소 활성에 의해 촉진 추가 변경을 거쳐 담즙에 배설하기 전에 이베. 따라서, 혈중 글루코 코르티코이드 지향 면역은 배설물 글루코 코르티코이드의 대사 산물 ^(7)의 분석에 적합하지 않을 수 ^{있습니다.}

찌끼 모음 말 아무런 방해하여 수행 될 수있는 바와 같이, 코르티 대한 대변의 분석은 다수의 환경에서 HPA 활동을 모니터링하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 말의 배설물에 상승 코르티 코스 테론은 수술 후 의학적 치료 ^8시 제한적 하우징 ^(9)을 포함하여 잠재적 인 혐오 상황에 대한 응답으로보고되었다. 대변 ​​샘플링은 시간이 지남에 풀링 된 글루코 코르티코이드 수준보다는 장기, 만성 또는 계절 패턴 ^(10)을 모니터링하기위한 적절하고 혈장과 타액에서 제공하는 시간 샘플링에있는 점을 반영한다. 때문에 비 침습적으로방법의 본질은, 샘플 캡처하거나 구속 ¹¹ 없이도 개인 반복적으로 수집 될 수있다. 샘플링 프로토콜을 계획 할 때, 종 특정 장내 통과 시간이 고려되어야한다. 말에서 소화관 통과 시간 따라서, 부신 반응과 후속 코르티 대사는 HPA 축의 활성화 후 초기 언젠가 대변 검출 할 수 약 18 내지 ¹² 시간이다.

비 침습적 면역 기술을 활용하면 조사중인 종에 대한주의 깊은 검증이 ¹³ 필수적이다. 또한, 호르몬 대사 산물의 배설에 성별 차이로 인해 신진 대사 속도와 마우스 ^(14), 닭 ⁽¹⁵⁾ 등 다양한 종으로 배설 코르티 코스 테론의 대사 산물의 종류의 차이에 아마보고되었다. 일에 자세히 설명되어 있습니다로는 분석이 남성과 여성의 국내 말 모두에 사용하기 위해 검증 된이 방법의 일환으로, 따라서 중요전자 프로토콜입니다. 남녀 간의 호르몬 대사의 차이는 해결하지 않고 분석 검증의 일부로 포함 거의되어 아직 데이터 품질에 대한 처벌을 받게됩니다.

이 비 침습적 방법은 국내 말에 부신 활동의 장기 평가를 할 수 있습니다. 프로토콜 세부 분석의 검증 및 분석 기술 자체를 모두.

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프로토콜

윤리 문 : 현장 샘플링과 동물 과목을 포함하는 절차는 노팅엄 트렌트 대학의 동물, 농촌 및 환경 과학 (ARES)의 학교에 의해 승인되었습니다.

대변​​ 샘플 1. 컬렉션

참고 : 분변 샘플 및 메탄올을 취급 할 때는 장갑을 착용한다. 동물은 또한 착용해야 실험실 코트와 같은 인수 공통 질병, 보호 복을 앓고 될 수 있다는 강한 의심이있는 경우.

1. 배변 다음 (몇 시간에 분 이내) 가능한 한 빨리 배설물 샘플을 수집하고 샘플 가방에 배치합니다. 약 10 g의 총 중량과 어떤 똥 샘플의 3 ~ 5 부 표본을 가져 가라. 시간과 수집, 개별 ID의 날짜와 가방 레이블 및 분석 때까지 -20 ° C에서 샘플을 동결.
2. 모든 샘플을 동결 오차를 최소화 -20 ° C까지의 연구이다 완료 후 일괄 적으로 분석을 위해 함께 샘플을 수집합니다.

2. 대변 호르몬 추출

1. 실온에서 해동하는 배설물 샘플을 남겨주세요.
2. 샘플을 수동으로 자신의 샘플 가방에 각각의 샘플을 혼합하여 균질화되어 있는지 확인합니다.
3. 각 샘플은 무게 보트에서 마이크로 저울에 0.50 분변 물질 (g 0.003 ±)을 무게를 들어 다음 8 ㎖의 유리 병에 대변을 전송합니다. 각 샘플에 대한 새로운 무게 보트를 사용하여 각 샘플 사이에 30 % 메탄올로 핀셋을 청소하십시오.
4. 5 90 % 메탄올 용액으로 분뇨 0.5 g의 결합 물, 및 RT에서 오비탈 진탕 기에서 O / N을 흔들어.
5. 다음 날 아침, 샘플 와동 후 600g에서 20 분 동안 원심 분리.
6. 37 ℃의 온도로 설정된 수욕 랙에 16 × ^125mm이 유리관 제자리 메탄올 분획을 경사 분리한다. 흄 찬 공기를 사용하여 건조시켜 증발. 추출 병을 씻어 폐기에 대한 임상 폐기물 가방에 남아있는 대변 펠렛을 배치합니다.
7. 100 %에서 1 ml의 메탄올을 대변 추출물을 다시 중단하고 12 X 75mm ² 폴리 프로필렌 튜브에 전송할 수 있습니다. 즉시 분석 할 때까지 -20 ° C에서 모자 및 저장.

3. 호르몬 분석

1. 클론 코르티 코스 테론의 CJM006 항혈청을 사용하여 효소 연결된 면역 측정법 (EIA)와 분석을 수행합니다.
   참고 :. 두 번째 EIA는 (코르티솔 R4866 항혈청을 테스트했지만,이 (4.1 절 참조) 폴리 클로 날 코르티 코스 테론 CJM006 항혈청과 코르티솔 R4866 항혈청과 각각의 HRP의이 CJ 먼로, 캘리포니아 대학에서 제공하는 생화학 적 검증 단계를 달성하는 데 실패, 데이비스, 캘리포니아
2. 1의 항혈청 희석 : 코팅 버퍼 (0.05 M을 NaHCO3, pH를 9.6)에서 15,000 반복적 인 피펫과 50 μL 피펫 팁을 사용하여 / 잘 50 μL와 96 웰 마이크로 타이 플레이트를로드합니다. 접시 실러와 함께 접시를 덮고 4 ° C에서 O / N을 품어. (N을 비 - 특이 적 결합을 나타내는 웰을 코팅되지 않은 두 개의 웰을 남겨SB).
3. 사용 직전 자동화 된 마이크로 타이 터 플레이트 세척기 (0.15 M의 NaCl, 0.05 % 트윈 20 세정액)를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 다섯 번 세척 하였다.
4. 1,000 페이지 / - NSB의 잘 당 50 μL와 '제로'우물 [EIA 버퍼 (0.1 M 나포 _4, 0.149 M의 NaCl, 0.1 % 소 혈청 알부민, pH를 7.0) 만, 표준 (코르티 코스 테론, 3.9으로 판을로드 잘) 또는 적절하게 1시 20분 EIA 버퍼에 희석 배설물 추출물 샘플 (,) 섹션 4.1을 참조하십시오. 표준과 0은 각각 세중 및 4 번씩 실행해야합니다. 희석 배설물 추출물 샘플과 NSB의 중복에서 실행해야합니다.
5. 70,000 : 50 ㎕를 첨가 / 웰의 1 EIA 버퍼에 희석 라벨 고추 냉이 퍼 옥시 다제 공액 ^ᵻ 즉시이 작업을 수행합니다.
6. 실온에서 2 시간 동안 어둠 속에서 마이크로 타이 플레이트를 품어.
7. 100 μL와 함께 어둠 속에서 실온에서 접시를 세척 용액으로 5 회 마이크로 타이 플레이트를 세척하고 품어 / 아RT 기판 [0.4mm의 2,2'- 아지노 디 - (3-ethylbenzthiazoline 술폰산) 디 암모늄 염, 1.6 mM의 H ₂ O _2, 0.05 M 시트 레이트, pH가 4.0]의 L. 사용하기 직전에 기판을 준비합니다.
8. 미크로 역가 플레이트를 읽는 405 nm의 파장에서 spectrophometer를 사용한다. 제로 웰의 광학 밀도가 0.8 이상 1.0에 도달 할 때 배양 플레이트는 완료된 것으로 간주된다.
9. 반복성을 보장하기 위해, 약 30 % (EIA 표준), 50 % (생물학적 샘플 예를 들어, 국내 말 배설물 추출물의 수영장) 70 % (EIA 표준)를 결합하는 EIA 버퍼에 희석 제어 [EIA 표준 또는 생물학적 샘플을 사용 ]는 각각 <10 %의 변화와 <15 %의 인트라 간 분석 계수를 설명합니다.

4. 효소 연결된 면역 : 연구 종과 섹스에 대한 검증

1. 생물 유효성 검사 (병렬)
   1. EIA 버퍼를 사용하여 풀 배설물 여분의 직렬 희석을 수행코네티컷, 이상적으로 여러 사람들로부터 의심 높고 낮은 호르몬 농도 샘플에서 가져온 (범위 : 깔끔한, 1 : 8192 : 2 1)과 3 장에 설명 된대로 EIA에서 실행됩니다.
      주 : 분변 추출물의 계열 희석 표준 곡선의 선형 회귀 결과 변위 곡선 평행 수득 때 병렬성이 달성 된 것으로 간주된다 R2> 0.90, 기울기> 0.50 및 p <0.05를 보여준다. 표준 곡선에 약 50 %를 결합하는 일련 묽은 배설물 추출물은 모든 배설물 추출물을 실행하는 데 이상적인 희석을 고려하여야한다 (예를 들면 1:20). 선형 회귀 결과 R2> 0.90 및 p <0.05을 설명 할 때 분석에서 고려 간섭이 없다.
2. 생물 유효성 검사 (간섭)
   1. 50 %로 희석 적절하게 풀 희석 된 배설물 추출물 [200 μL가 paralleli에 의해 결정 바인딩과 (3.9 1000 NG / 잘 코르티 코스 테론 제로) 직렬 희석 기준의 200 μl를 스파이크SM (1:20)] 및 EIA 분석 플롯 다음 섹션 3과 EIA에서 실행 관측 된 농도 - 예상 농도 대 배경 (제로 샘플의 농도).
      주 : 표준 희석 풀링 분변 추출물의 첨가가 유의 양 예상 선형 회귀 결과를 변경하지 않으면 ^R이> 0.90, 1.0 및 p <0.05에 가까운 기울기를 산출한다. 환경 영향 평가와 간섭을 달성 없습니다.
3. 생물 유효성 검사 :
   참고 : 선택한 EIA 관심 호르몬의 생물학적으로 중요한 변화를 측정 할 수있는 능력이있는 데모 [예는, 약리학 다음 글루코 코르티코이드 농도의 상승 또는 생물학적 도전 (ACTH가 종종 허가 절차) (예를 들어, 심리적 및 / 또는 환경, 기회주의 관계가없는 이벤트가 될 가능성이 더 높습니다)].
   1. 선택 추출물과 글루코 코르티코이드 대사 산물 농도에 대한 분변 샘플을 분석이전과 도전 이벤트 - 3 절에서 1 설명 된 프로세스를 사용하여.
      주 : 도전 이벤트가 특정 종 수 있습니다. 예시적인 방법은 국내 말은 아래 제공된다. 말에 대한 도전 이벤트의 전체 예는 관리 ⁹ 축산 절차 ^(16)의 사용을 포함하여 이전에 발표되었다. 도전 이벤트 다음 글루코 코르티코이드의 대사 산물 농도의 유의 한 증가가 관찰 및 통계 분석을 사용하여 확인해야합니다. 이것은 반복 측정 샘플 날짜 및 개인의 영향을 적절 포함한다. 생물학적 검증은 달성 된 것으로 간주된다.

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결과

국내 말 (N = 16, 8 암말, 8 geldings) 십오년 (± 3)의 평균 연령은 성별과 사회적 고립 (N = 4 말 / 치료)의 증가 수준 4 개의 주택 디자인 대상에 따라 분류 하였다. 밀접하게 그들의 자연 서식지를 시뮬레이션, 무리 환경에서 생활 주택 1 관련된 말. 실내 헛간에 쌍에 살고있는 주택이 포함 된 말. 하우징 (3) 참여 말은 마구간에 있지만, 다른 말과 말의 하우징 (4) 관련 총 격리 시각?...

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토론

분변 코르티 분석 말 부신 활성의 장기 패턴을 평가하는 수단을 제공한다. 상기 방법의 비 침습적 자연 타액 플라즈마 분석 ⁹ 포함한 부신 활성을 평가하기 위해 사용되는 다른 샘플링 방법의 교란 효과를 극복한다. 또한이 기술은 무료에 이르기까지 말을 공부하는 경우 명확한 비 침습적 인 장점이 있습니다.

이 방법의 적절한 사용에 관한 논의하기 위해 몇 가지 주?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore