Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Резюме

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Аннотация

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Введение

Метод, описанный предполагает анализ концентрации кортикостерона в лошадиного кала, чтобы обеспечить неинвазивный оценку надпочечниковой активности. Измерение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси деятельности является общепринятым подходом к изучению реакции на потенциально аверсивных ситуации в обоих неволе и домашних видов. Эталонный метод и наиболее широко используемым методом является использование плазмы крови ¹ , однако, альтернативные методы , такие как фекальные анализа были разработаны для того , чтобы преодолеть стресс , вызванный самой забора крови и позволяет возможность отслеживать свободные диапазоне видов.

Во время аверсивного ситуации, физиологический гомеостаз нарушается. Гипоталамус в выпусках мозга кортиколиберин (CRH), который действует на передней доли гипофиза и стимулирует высвобождение адренокортикотропного гормона (АКТГ). АКТГ поступает в кровоток и стимулирует кору надпочечников секретируют звонкойспецифичный глюкокортикоиды (GC). Глюкокортикоиды тесно связаны с стрессовыми событиями , а не последовательно производится во всех энергетических состояниях повышенной , поэтому они часто измеряется предпочтение по сравнению с другими стресс - связанных гормонов ^2. Глюкокортикоиды ответственны за несколько адаптивных эффектов у лошадей. Энергия быстро мобилизован из мест хранения в организме в виде жирных кислот и глюкозы, потребление кислорода увеличивается, сенсорная функция усиливается ³ и кровоток уменьшается на области , не необходимых для движения ^4. А также действует как механизм преодоления трудностей, то стресс , вызванный рост глюкокортикоидов может также помочь подготовить животное к следующему стрессора ^5.

Оценка уровней гормонов в плазме и слюне включает в себя измерение фактического циркулирующего гормона, однако, измерение метаболитов в мерах фекалии метаболический конечный продукт гормона. Циркулирующие стероиды катаболизировано в лIver , прежде чем экскреции с желчью , где они подвергаются дальнейшим изменениям , облегченные ферментативной активности бактериальной флоры в кишечном дорожки ^6. Таким образом, иммунологические тесты, направленные к глюкокортикоидов в крови не могут быть пригодны для анализа фекальных глюкокортикоидных метаболитов ^7.

Как сбора фекалий может осуществляться без каких-либо помех на лошади, анализ кала на кортикостерона, широко используется для мониторинга активности HPA в ряде обстоятельств. Повышенные кортикостерона в фекалиях лошадей было сообщено в ответ на потенциально аверсивных ситуациях , включая во время послеоперационного ветеринарии для лечения ⁸ и в ограничительной корпусе ^9. Фекальные выборки отражает уровень объединял глюкокортикоиды с течением времени , а не момент времени выборки , предлагаемой плазме и слюне , что делает его подходящим для мониторинга на долгий срок, хронический или сезонный характер ^10. В связи с неинвазивнымприроды метода, образцы могут быть собраны несколько раз для индивидуума без необходимости захвата или ограничения ^11. Тем не менее, определенные разновидности кишки транзитное время должны быть приняты во внимание при планировании протокола отбора проб. У лошадей, время прохождения кишка составляет около 18 ч ¹² поэтому, надпочечниковой ответ и последующие кортикостерона метаболиты могут быть обнаружены в кале через один день после первоначальной активации оси HPA.

При использовании неинвазивных методов иммунологического тщательное обоснование для данного вида расследуется имеет важное значение ^13. Кроме того, половые различия в гормональном метаболит экскреции сообщалось , вероятно , из - за различий в скорости обмена веществ и типа кортикостерона метаболита выводится из организма у различных видов , включая мышей , ¹⁴ и ¹⁵ кур. Поэтому важно, как часть этого метода, что анализ был апробирован для использования в мужских и женских домашних лошадей, как подробно описано в гое протокола. Эта разница в гормональном обмене веществ между мужчинами и женщинами имеет последствия для качества данных пока она редко рассматриваются и включены как часть проверки анализа.

Этот неинвазивный метод позволяет долгосрочную оценку надпочечниковой активности в домашних лошадей. Подробности протокола и проверки достоверности анализа и сама методика анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление по этике: процедуры, связанные с поля выборки и животных предметы были одобрены школой животных, сельских и науки об окружающей среде (Ares) в Nottingham Trent University.

1. Сбор образцов фекалий

Примечание: перчатки следует носить при обработке фекальных образцов и метанола. Если есть сильное подозрение, что животное может страдать от зооноза, защитной одежды, такие как пальто лаборатории также должны носить.

1. Сбор образцов фекалий как можно скорее (в течение минут до нескольких часов) после дефекации и поместить их в мешок образца. Возьмите три-пять подвыборок любого осветленного образца с общим весом около 10 г. Этикетка мешок с датой и временем сбора, индивидуальный ID, и заморозить образец при температуре от -20 ° C до проведения анализа.
2. Чтобы свести к минимуму ошибки, заморозить все образцы при -20 ° C до завершения исследования затем собрать образцы вместе для анализа в качестве одной партии.

2. Фекальные Гормон Extraction

1. Оставьте фекальные образцы оттаивают при комнатной температуре.
2. Убедитесь, что образцы гомогенизируют вручную смешивания каждого образца в отдельном пакете образца.
3. Для каждого образца весят 0,50 (± 0,003 г) фекального материала на микровесов в лодке взвешивании затем передать фекалии в стеклянную пробирку емкостью 8 мл. Используйте новую взвешивать лодку для каждого образца и очистки пинцет с 30% метанола между каждой пробы.
4. Смешивают 0,5 г фекалий с 5 мл 90% метанол: вода, и трясти O / N на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
5. На следующее утро, вихревые образец и затем центрифугировать в течение 20 мин при 600 г.
6. Декантируйте метанольной фракции в стеклянную трубку и место 16 х 125 мм ² в стойке на водяной бане до температуры 37 ° С. Выпаривают досуха с использованием воздуха в вытяжном шкафу. Ополосните флакон для экстракции и поместите оставшиеся фекальные гранулы в мешок клинических отходов для утилизации.
7. Повторное приостановить фекальных экстрактов в 100%, 1 мл метанола и переносят в полипропиленовую пробирку 12 х 75 мм ^2. Сразу не колпачком и хранить при температуре -20 ° С до проведения анализа.

3. Анализ Гормон

1. Проведение анализа с помощью фермента, связанного иммуноанализа (EIA) с использованием поликлональных кортикостерона CJM006 антисыворотки.
   Примечание:. Второй EIA был протестирован (кортизол R4866 антисыворотки, но это не удалось достичь биохимического этапа проверки (см раздел 4.1) поликлональных кортикостерона CJM006 антисыворотки и кортизол R4866 антисыворотки и соответствующие СПВН снабжены CJ Munro, Калифорнийский университет, Davis, CA.
2. Развести антисыворотки в соотношении 1: 15000 в буфере для покрывания (0,05 М NaHCO3, рН 9,6) с использованием повторяющихся пипетку и наконечник пипетки 50 мкл, загрузите 96-луночного микротитрационного планшета с 50 мкл / лунку. Накройте тарелку с тарелкой герметиком и инкубировать O / N при температуре 4 ° С. Оставьте две скважины, не покрытом представлять неспецифического связывания скважин (NSB).
3. Непосредственно перед использованием промыть микротитровальные планшеты пять раз с использованием автоматического планшет для микротитрования шайбу (мойка раствора; 0,15 М NaCl, 0,05% твин 20).
4. Загрузите планшеты с 50 мкл на лунку для NSB - х и «нулевой» скважины [буфера EIA (0,1 М NaPO _4, 0,149 М NaCl, 0,1% бычий сывороточный альбумин, рН 7,0) только], стандарты (кортикостерона, 3,9 - 1000 пг / а) или образцы фекалий экстракта (надлежащим образом разбавленные в 1:20 EIA буфера, смотрите раздел 4.1). Стандарты и нули должны быть проложены в трех экземплярах и четырежды, соответственно. Разведенные образцы фекалий экстракта и NSB должны быть запущены в двух экземплярах.
5. Следуйте за этим сразу же с добавлением 50 мкл / лунку этикетке хрена конъюгированной пероксидазой , разведенного в буфере EIA 1 ^ᵻ: 70000.
6. Инкубируйте микротитрационных планшетах в темноте в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Вымойте микротитровальные планшеты с промывочным раствором 5 раз и инкубировать пластин при комнатной температуре в темноте со 100 мкл / вэйл РТ субстрата [0,4 мМ 2,2'-Азино-ди- (3-этилбензтиазолин кислоты сульфоновая) диаммонийфосфат соли, 1,6 мМ H ₂ O _2, 0,05 М цитрата, рН 4,0]. Подготовьте субстрат непосредственно перед использованием.
8. Используйте spectrophometer при длине волны 405 нм для считывания микротитрационных планшетов. Инкубация пластин считается завершенной, когда оптическая плотность нулевых скважин достигает от 0,8 до 1,0.
9. Для обеспечения воспроизводимости, используйте элементы управления [Стандарты EIA или биологического образца , разведенного в буфере EIA для связывания приблизительно 30% (стандарт EIA), 50% (биологический образец , например, пул домашней лошади фекального экстракта) и 70% (стандарт EIA) ], чтобы продемонстрировать внутри- и между анализами коэффициенты вариации <10% и <15% соответственно.

4. Фермент Linked-иммунологический: Проверка по изучению видов и секс

1. Биохимический Validation (параллелизм)
   1. Использование буфера EIA, выполнить серийное разведение на объединенных фекально экстракт, в идеале взяты из подозреваемых в высоких и низких концентраций образцов гормона из нескольких особей (диапазон: аккуратный, 1: 2 до 1: 8192) и запустить по ОВОС, как описано в разделе 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: параллелизм считается достигается, когда серийные разведения фекальных экстрактов дают кривую перемещения параллельно стандартной кривой и результаты линейной регрессии показывают, R2> 0,90, уклоне> 0,50 и р <0,05. Последовательный разбавленный фекально экстракт , который связывает около 50% от стандартной кривой следует считать идеальным разбавление для выполнения всех фекальных экстрактов (например, 1:20). Там нет никакого вмешательства рассматривается на анализе, когда линейные результаты регрессии показывают, R2> 0,90 и р <0,05.
2. Биохимический Validation (Помехи)
   1. Шип 200 мкл серийно разведенными стандартов (от нуля, от 3,9 до 1000 нг / лунку кортикостерона) с 200 мкл соответствующим образом разбавленного объединенном фекального экстракта [разведенного в 50% связывания определяется Параллелисм (1:20)] и работать на EIA, как и в разделе 3. После анализа EIA участке наблюдаемая концентрация минус фон (концентрация нулевого образца) по сравнению с ожидаемой концентрацией.
      Примечание: Если добавление разбавленного пула фекального экстракта стандартов не приводит к существенному изменению ожидаемой суммы и линейные результаты регрессии дает R ^2> 0,90, наклон , близкий к 1,0 и р <0,05. Отсутствие взаимодействия с ОВОС не было достигнуто.
3. Биологические проверки:
   Примечание: Демонстрация того, что выбранная EIA имеет возможность измерения биологически значимых изменений гормона интереса [например, рост глюкокортикоидов концентраций следующих фармакологической (АКТГ часто является лицензированным процедура) или биологической проблемой (например, психологические и / или окружающей среды, более вероятно, будет уступающую нерегулируемого событие)].
   1. Выберите, извлекать и анализировать образцы фекалий для глюкокортикоидов метаболита концентрациис помощью процесса, подробно описанную в разделах 1 - 3 до и после сложного события.
      Примечание: Сложные события будут конкретные виды. Примерный способ приведен ниже для домашней лошади. Полные примеры сложных событий для лошадей были опубликованы ранее в том числе использование управления ⁹ и рыбоводства процедур ^16. Значительный рост глюкокортикоидов метаболита концентрации после сложного события должны быть соблюдены и подтверждены с помощью статистического анализа. Это должно включать в соответствующих случаях, эффект повторных измерений, дата выборки и индивидуальных. Биологическая проверка затем считается достигнута.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Внутренние лошади (п = 16, 8 кобылы, 8 меринов) со средним возрастом 15 лет (± 3) были сгруппированы в зависимости от пола и подвергают четырех конструкций жилищного с увеличением уровня социальной изоляции (п = 4 лошади / лечение). Все для дома 1 участвуют лошади, живущие в сред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Фекальные анализ кортикостерона предоставляет средства оценки долгосрочных моделей надпочечниковой активности у лошадей. Неинвазивный характер метода преодолевает искажающие эффекты других методов отбора проб , используемых для оценки активности коры надпочечников , включая слюн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore