Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Resumo

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Resumo

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Introdução

Hemostasia requer a atividade combinada e regulado de células, proteínas, íons e tecidos em um contexto espaço-temporal restrito ^1. actividade não controlada pode conduzir a hemorragia ou trombose e morbidade ou mortalidade num espectro de distúrbios relacionados com a coagulação do sangue. Um experimento de câmara de fluxo microfluídico é uma técnica desafiadora que imita hemostasia in vitro. Esta abordagem permite a investigação da interação complexa de processos que fazem parte de hemostasia com um papel de liderança para as plaquetas do sangue.

A seguir a lesão vascular, as plaquetas aderem às proteínas de matriz subendotelial exposta (glico) para evitar a perda de sangue. Após a adesão, activação e agregação de plaquetas em resposta a auto- e paracrino sinalização que, finalmente, conduz à formação de uma rede de plaquetas, estabilizado por fibrina e resultando num firme, ferida trombo ² de vedação. Diferentemente da maioria dos outros testes de função plaquetária, experimentos com câmaras de fluxo tomar em consideração o parâmetro físico do fluxo sanguíneo e, portanto, a influência de reologia nas células que participam biomoléculas e ^3,4.

experimentos câmara de fluxo geraram conhecimentos marco na hemostasia e trombose variando parâmetros-chave que influenciam hemostático (sub) processos, incluindo os perfis de matriz adesiva, reologia e fluxo, composição celular, presença de toxinas ou drogas, força iônica e muitos mais. Nas últimas duas décadas, o baixo rendimento experimentos câmara de fluxo que exigem grandes volumes de amostras (10-100 ml) evoluíram para câmaras microfluídicos, muitas vezes consistem em câmaras de placas paralelas pequenas e incluindo a tecnologia moderna para perfusão de sangue total em condições de cisalhamento controladas ^5. Microscaling aumentou significativamente ensaio de rendimento principalmente porque a configuração de hardware tem simplificado e menos volume (sangue) é necessário, tornando a experiência mais acessível e Versatile. Por exemplo, o sangue a partir de pequenos animais de laboratório pode agora ser utilizado sem a necessidade de sacrificar os animais. As amostras de sangue de ratos geneticamente modificados têm, portanto, auxiliado na identificação de moléculas-chave promover ou inibir a hemostasia e em novos conhecimentos básicos ^6.

Laboratórios de pesquisa especializados, muitas vezes ainda usam câmaras de fluxo personalizado feito por exemplo, de polidimetilsiloxano (PDMS) ^7, que polimeriza em moldes litografadas que pode ser blueprinted por software. A câmara resultante é barato e descartável e pode ser facilmente desmontado para análise post hoc. Além disso, basicamente, qualquer construção de embarcações, incluindo bifurcações ou curvas fechadas podem ser construídas no comando. Esta vantagem é também a sua desvantagem desde normalização já era o principal problema com experimentos câmara de fluxo, e PDMS personalizado feito câmaras não têm ajudado isso. No topo desta questão em particular, revestimento (condições), sondas fluorescentes, anticoagulante, temperaturaratura e tempo entre a amostragem e análise são todos mal padronizado ^8. Padronização dessas variáveis ​​é um desafio, mas, no entanto, necessário para permitir a comparação de resultados entre laboratórios. Este tópico é o assunto principal da Sociedade Internacional sobre Trombose e Hemostasia na subcomissão Científico e Normalização em Biorheology ^9,10.

Os concentrados de plaquetas (PC) são transfundidas em pacientes que sofrem de várias doenças que provocam trombocitopenia e / ou sangramento. Mas plaquetas no PC são conhecidos para dessensibilizar, especialmente em função do tempo de armazenamento ^11, um processo de deterioração associada ao envelhecimento e vulgarmente referidos como lesão de armazenagem de plaquetas. Às vezes é alegado que essas plaquetas restaurar em circulação, uma vez transfundido ^12, mas as evidências para isso é escasso. Além disso, a funcionalidade de plaquetas que formam um PC não é rotineiramente testadas porque a relação entre tais ensaios eeficácia terapêutica ou profilática não está claro ^13. câmaras de fluxo microfluídicos oferecem um meio para investigar a função plaquetária no PC para otimizar a cadeia de manipulações entre a recolha ea emissora. É uma ferramenta de pesquisa poderosa para (pareados) comparações diretas de PC como já anteriormente publicados ^14,15 e é descrito aqui.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes éticas institucionais para a pesquisa em amostras humanas e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores envolvidos. Aprovação para as experiências descritas aqui foi obtido do conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Antuérpia.

Nota: as indicações de temperatura são sempre temperatura ambiente, a menos que especificado.

Configuração 1. Preparação Fluxo Câmara

1. Lanes preparando, Tubing and Pins
   1. Vortex a suspensão de colagénio vigorosamente e diluir 20/01 na solução de glucose isotónica fornecido pelo fornecedor para uma concentração final de 50 ug / ml.
      Nota: Nós usamos colágeno de tendão equino, composta principalmente de tipo fibrilas I. O tipo I de colagénio equino é muitas vezes referida como "Horm" colagénio e é o padrão de ouro para este tipo de ensaio ^9, tanto por razões históricas, bem como biológicos. Tipo de colagénio III humano também pode ser utilizado, mas the fibrilas revestimento e menos bem a resposta de plaquetas não é tão forte. Outras superfícies de revestimento também pode ser utilizado, por exemplo Factor de von Willebrand (vWF), fibrinogénio, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 ou combinações destes ^16.
   2. Tome um novo biochip descartável de recipiente do provedor. As dimensões dos biochips utilizados aqui são 0.4W x 0,1H x 20L em mm ^3.
   3. Pipeta de 0,8 ul para a pista (s) do biochip microfluídico em uma extremidade do chip e marcar como saída. Certifique-se que a pista está cheia 5 / 6º com o colágeno contendo solução de revestimento preparada no ponto 1.1.1. Certifique-se de que não existem bolhas de ar.
      NOTA: Os canais são parcialmente revestido para evitar a acumulação de fibras de colagénio na entrada do canal (ver discussão).
   4. Incubar a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite num recipiente fechado e humidificada.
   5. Bloquear os canais revestidos por pipetagem de tampão de bloqueio (1,0% (w v) de soro / albumina bovina umd 0,1% (w / v) de glucose em 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) solução salina tamponada (HBS; 0,9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) na outra extremidade e Mark como entrada. Certifique-se de que a faixa está completamente cheia com o tampão de bloqueio evitando bolhas de ar.
   6. Cortar tubos em igual comprimento (12 cm). Use um por pista e se conectar cada tubo com um alfinete. Por exemplo, um experimento comparando duas condições, realizados em duplicado exigirá quatro trechos de tubulação e quatro pinos para ser preparado.
   7. Lavar a tubagem com água destilada, utilizando uma seringa e uma agulha G 26 ou os conectores de acompanhamento.
   8. Saturar o tubo com tampão de bloqueio. Armazenar em um recipiente fechado e humidif içado, durante um mínimo de 1 hora.
2. Preparando Bomba e Manifold
   1. Lavar a bomba e manifold com água destilada, remover bolhas de ar.
   2. Aspirar o tampão de bloqueio para fora da pista (s) biochip usando a ponta 10 ul fixo na saída. Limpe a superfície doo biochip com um pó de precisão livre limpeza e álcool desnaturado para remover impressões e poeira.
   3. Fixar o biochip em um estágio do microscópio automatizado. Se mais de uma faixa é usada simultaneamente em uma corrida, conectar o divisor colector de oito pistas para a saída biochip.
      Nota: O divisor colector de oito pistas é uma peça de hardware (Figura S1) ligado à bomba e ao biochip. Ele permite a operação de todas as pistas (oito) disponíveis no biochip um ou uma combinação de pistas que podem ser no software que acompanha definidos pelo operador.
   4. Use os pinos na tubulação para corrigi-los na entrada biochip. Colocar a outra extremidade da tubagem (sem pinos) num tubo de ensaio cónico de 1,5 ml cheio com HBS. Lavar todos os tubos e as suas faixas ligadas com 1 ml de HBS de usar a bomba, de modo a remover o restante tampão de bloqueio e fracamente aderente colagénio.

2. Preparação de amostras de sangue

1. Coleta e separação desangue total fresco de um voluntário saudável. ¹⁷
   1. Recolher os primeiros mililitros de sangue em tubos evacuados contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante e exclusivamente utilizar esta amostra para contagem de sangue completo (CBC) com um analisador hematológico automático.
   2. Recolher um volume de sangue de um anticoagulante adequado, utilizando tubos de vácuo. anticoagulantes padrão para experimentos câmara de fluxo são heparina ou hirudina quando fibrina formação não faz parte do protocolo de estudo e citrato de sódio quando é.
      Nota: a heparina foi utilizada como anticoagulante para todas as experiências descritas nos resultados.
      Nota: A quantidade de sangue depende do número de experiências para ser executado. Cerca de um tubo (7 ml) por 3 vias.
   3. Colocar os tubos num rotor pendente reconstituição sangue.
      Nota: O ensaio deve ser concluído no prazo de 3 horas de flebotomia.
   4. Centrifuga-se durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico em plaquetas (PRP). Não use a pausa centrífuga para não perturbar o pellet ligeiramente comprimido.
      1. Quando mais do que um tubo foi recolhida, reunir o sangue num tubo de centrifugação cónico.
         Nota: A centrifugação pode ser feito mais lentamente ou menos longo, dependendo do rendimento de PRP e "contaminação" diferencial de células preferidos.
   5. Retirar e descartar o PRP e creme leucocitário produzindo concentrado de hemácias com poucas plaquetas.
      Nota: A contagem das plaquetas na fracção de glóbulos vermelhos embalados é de 13 ± 5 x 10 ³ por ul (média ± DP, n = 12) em média nas nossas mãos.
2. Reconstituição de sangue
   1. Descongelar grupo sanguíneo AB (Rhesus D negativo) o plasma a 37 ° C durante 5 min e 20 seg por 4 ml.
   2. Determinar o hematócrito dos glóbulos vermelhos empacotados em 2.1.5 preparados usando um analisador hematológico automático.
   3. Determinar a concentração de plaquetas no banco de sangue preparadas plaquetas concentrado thaT vai ser utilizado para reconstituir a fracção de glóbulos vermelhos acima.
   4. Calcule o volume de concentrado de hemácias e concentrado de plaquetas que irão produzir 40% de hematócrito e 250 x 10³ plaquetas / ul em uma amostra de 1 ml.
      Nota: Outros títulos de células alvo pode ser definido arbitrariamente, dependendo do protocolo do estudo.
   5. Transferência embalado células vermelhas do sangue e de plasma para um tubo fresco, utilizando uma ponta de pipeta cortada e adicionar concentrado de plaquetas até um volume de amostra de 1 ml é atingida.
      Nota: Dependendo das variáveis ​​estudadas, a fração de plasma deve ser igual em todas as amostras reconstituídas porque plasma tem uma influência significativa sobre a taxa de formação de trombos. Por exemplo, repetido de congelação-descongelação ou plasma retirado de doadores diferentes ou em diferentes anticoagulantes podem influenciar o resultado.
   6. Misture o sangue reconstituído suavemente por inversão e realizar um CBC.
   7. Prepara-se uma amostra de controlo "em branco", na qual o volume da fracção de plaquetas é substituídopelo mesmo volume de 0,9% (m / v) de cloreto de sódio em água para determinar a concentração de plaquetas endógenas (isto é, não-bancárias de sangue plaquetas) no sangue reconstituído usando um CBC.
3. Marcação
   1. Pipeta de 1 ml reconstituído sangue num tubo de ensaio contendo 1 ul de 5 mM de calceína AM (5 uM de concentração final).
      Nota: Outros corantes celulares podem ser usados ^​​14.
   2. Misture delicadamente por inversão.
   3. Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de usar.

3. Perfusão Assay

1. Concentre o objectivo de as fibras de colagénio aderiram ao fundo das pistas. O ideal é usar as configurações de contraste de interferência diferencial (DIC) de contraste de fase ou para esta estratégia de focalização. Selecione 'Z atual definido para as regiões telha selecionados' no software experimento para corrigir digitalmente os Z-posições selecionadas.
2. Seleccionar uma região de interesse (ROI) na pista (XY) no software do experimento microscope que será gravado durante o experimento.
   Nota: O ROI pode ser de qualquer área de superfície escolhido arbitrariamente dentro de uma pista de perfusão. É aconselhável não para analisar a formação de trombos perto da entrada e saída de uma pista de modo a evitar efeitos laterais do perfil de fluxo variável nessa região, mesmo que esta seja relativamente pequena. A área de superfície ROI deve conter um número significativo de plaquetas ou de trombos para permitir o nivelamento do sinal. Neste protocolo do ROI é um agregado digitalmente costurado de três tamanhos iguais imagens lado-a-lado, resultando em 0,62 milímetros ² no meio da pista de 2 cm de comprimento.
3. Misturar suavemente as amostras por inversão e posicionar estes junto ao biochip na fase automatizado.
4. Colocar o tubo que está ligado com a entrada do biochip nos tubos de ensaio contendo as amostras de sangue reconstituído.
5. Lançar a bomba a 50 dyne / cm ² (ou outras tensões de cisalhamento como desejado) para esses canais ligados a tubos de ensaiocontendo as amostras de sangue reconstituídos utilizando o software da bomba.
   Nota: Outros tensões de corte pode ser utilizado.
6. gravar imagens a cada 15 segundos durante 5 minutos em tempo real usando o software de aquisição e experiência do microscópio.
   Nota: Outra série temporal pode ser utilizado, dependendo do set-up experimental.
   Nota: Em geral, utilizar uma ampliação de 100X (objectiva 10X e 10X lentes), mas superior (ou inferior) de ampliação pode ser facilmente utilizado como uma alternativa.

4. Lave Fora

1. Lavar todos os tubos ligados à tomada e ligado ao colector ou multicanal bomba usando água destilada, seguido de hipoclorito de sódio (lixívia) 0,5% (v / v) e, finalmente, NaOH a 0,1 M em água. Descartar o tubo preso à entrada biochip como resíduos perigosos.

Análise 5. Os dados

1. Determinar a cinética de crescimento do trombo com o software de análise de imagem. Os comandos a seguir são específicos para ZEN2012.
   1. Abra a Análise plugin de imagem para determinar a cobertura da superfície das plaquetas.
   2. Defina o limite de fluorescência na guia Analisar interactivo para definir a intensidade dos pixels que se correlaciona com um sinal positivo, ou seja, uma das plaquetas aderiram ou plaquetas aderentes.
   3. Use Criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha que conterá as áreas de superfície separadas (em mm ²⁾ desses "objetos" que contêm pixels com um sinal entre os limiares selecionados. Isto é realizado para cada ponto de tempo.
      Nota: Uma vez que os limiares de fluorescência ter sido escolhido, o software de análise detecta automaticamente 'objetos' no campo de visão que preenchem os critérios. Esses objetos são trombos, pequenos agregados de plaquetas ou plaquetas individuais e abranger uma série de pixels. Cada objeto é listado na planilha separadamente.
   4. Guarde estas planilhas no formato XML e abri-los em um programa de planilhapara outros cálculos.
   5. Total de áreas da superfície dos objectos seleccionados por soma e dividir o resultado pela área total do campo de medição (uM ^2). Isto vai produzir a cobertura de superfície relativa (%). Fazê-lo para cada ponto de tempo.
   6. Traçar estas coberturas de superfície em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear, obtendo-se a cinética de crescimento de trombos que condição particular.

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Resultados

Para demonstrar a variação intra-ensaio, três amostras de sangue total reconstituído idênticos foram perfundidos simultaneamente sobre as superfícies de colagénio revestido (Figura 1). Isto resultou em um coeficiente de variação de 8,7%. Esta estatística sugere intra-ensaio aceitável e variação intralaboratorial permitindo comparação fiável entre amostras relacionadas.

A entrada da câmara de f...

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Discussão

Experimentos câmara de fluxo microfluidicos são uma excelente ferramenta para investigar a função das plaquetas no fluxo sanguíneo e são usados ​​para avaliar a hemostasia in vitro em vários contextos experimentais. Apesar de pobre normalização interlaboratory ^9, demonstra-se que dentro do nosso laboratório a variação experimental é aceitável. Isto permite comparar de forma confiável amostras (pareados) dentro de um determinado estudo. Este foi validado utilizando o fenômeno bem d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121