Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Resumo

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Resumo

Espécies de Brucella são facultativos patógenos intracelulares que infectam os animais como seus hospedeiros naturais. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados e pode levar a infecções crónicas graves.

Brucella podem invadir células fagocíticas profissionais e não profissionais e replica dentro do retículo endoplasmático (ER) vacúolos -derived. Os fatores do hospedeiro necessárias para a entrada Brucella em células hospedeiras, evitar a degradação lisossomal, e replicação no compartimento de ER-like permanecem largamente desconhecidos. Aqui nós descrevemos dois ensaios para identificar fatores do hospedeiro envolvidos na entrada de Brucella e replicação em células HeLa. Os protocolos descrevem a utilização de interferência de ARN, enquanto que os métodos de rastreio alternativos podia ser aplicado. Os ensaios baseiam-se na detecção de bactérias marcadas com fluorescência em células hospedeiras marcados fluorescentemente utilizando automatizadomicroscopia de campo amplo. As imagens fluorescentes são analisados ​​por meio de uma tubagem de análise de imagem normalizado em CellProfiler único que permite marcar a infecção com base em células.

No ensaio de ponto final, a replicação intracelular é medido dois dias após a infecção. Isso permite que as bactérias tráfego para o seu nicho de replicação, onde a proliferação é iniciada cerca de 12 horas após a entrada bacteriana. Brucella que estabeleceram com sucesso um nicho intracelular terá assim fortemente proliferaram dentro das células hospedeiras. Uma vez que as bactérias intracelulares irão em muito ultrapassam as bactérias não-replicativos intracelulares ou extracelulares individuais, uma estirpe que expressa constitutivamente a GFP pode ser utilizado. O sinal de GFP forte é então utilizado para identificar as células infectadas.

Em contraste, para o ensaio de entrada é essencial para diferenciar entre intracelular e bactérias extracelulares. Aqui, uma estirpe que codifica para uma GFP tetraciclina indutível é utilizado. Induçãode GFP com inactivação simultânea de bactérias extracelulares por gentamicina permite a diferenciação entre as bactérias extracelulares e intracelulares com base no sinal de GFP, com apenas bactérias intracelulares ser capaz de expressar GFP. Isto permite a detecção de bactérias intracelulares robusta simples antes proliferação intracelular é iniciada.

Introdução

Espécies de Brucella são gram-negativas, agentes patogénicos intracelulares facultativos que pertencem à classe de α-Proteobacteria. Eles causar abortos e infertilidade em seus hospedeiros naturais, tais como gado, cabras, ou ovelhas, resultando em graves perdas económicas em áreas endêmicas. A brucelose é uma das doenças zoonóticas mais importantes do mundo, causando mais de meio milhão de novas infecções humanas por ano ^1. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados, como leite não pasteurizado. Os sintomas da doença são febril inespecífica, o que provoca dificuldades no diagnóstico de brucelose. Se não forem tratados, os pacientes podem desenvolver uma infecção crónica com sintomas mais graves, tais como a artrite, endocardite, e neuropatia ^2.

No nível celular Brucella é capaz de invadir células fagocíticas e não fagocíticas e replica no interior de uma intracelularcompartimento conhecido como o Brucella molecular contendo vacúolo (BCV). Internalização de bactérias requer rearranjos do citoesqueleto de actina por Rac, Rho, e ativação direta de Cdc42 ^3. Dentro da célula hospedeira eucariótica, o BCV transita ao longo da via endocítica e apesar da interacção com os lisossomas, bactérias conseguem evitar a degradação ^4. A acidificação do BCV pelo vesicular ATPase é necessária para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo IV bacteriana (T4SS) ^5. Acredita-se que efectores bacterianas secretadas pela T4SS são essenciais para Brucella a estabelecer o seu nicho replicativa, uma vez que a deleção de ⁶ T4SS ou inibição da ATPase de chumbo vesicular a defeitos no estabelecimento do nicho intracelular ^7. As bactérias não replicar durante a fase de tráfico até que eles alcançar um compartimento vacuolar derivada de ^ER-8. Uma vez que a proliferação ocorre intracelular, o BCV é encontrado em CLose associação com marcadores, tais como ER calnexina e glucose-6-fosfatase ^6.

Os mecanismos moleculares pelos quais Brucella entra nas células, evita a degradação lisossomal, e, finalmente, se replica em um compartimento do ER semelhante permanecer em grande parte desconhecida. Fatores do hospedeiro envolvidos em diferentes etapas de infecção foram principalmente identificado por abordagens específicas ou uma interferência tela pequena escala pequena RNA (siRNA), realizado em células de Drosophila ^9. Estes têm lançar luz sobre a contribuição de fatores do hospedeiro individuais durante a infecção Brucella mas ainda estamos longe de uma compreensão abrangente de todo o processo.

Aqui, os protocolos que permitem a identificação de factores do hospedeiro humano com RNA de interferência de rastreio em larga escala (RNAi) em combinação com a microscopia de fluorescência de campo amplo automatizado e de análise de imagem automatizada são apresentados. Reverso transfecção siRNA de células HeLa é realizada como describEd anteriormente com modificações menores ^10,11. O ensaio endpoint abrange uma grande parte do ciclo de vida intracelular Brucella, exceto a saída e a infecção das células vizinhas. Para caracterizar ainda mais os hits identificadas no ensaio de ponto final, um protocolo modificado para identificar factores envolvidos nos passos iniciais da infecção é utilizado.

Uma estirpe de Brucella abortus, que expressa constitutivamente GFP é utilizado para o ensaio de ponto final em que as bactérias são permitidos para infectar as células durante dois dias. Durante este tempo, as bactérias entram nas células, o tráfego para o nicho de replicação derivada de ER, e replicam no espaço peri-nuclear. Os altos níveis de sinal de GFP podem então ser usadas para detectar com fiabilidade as células individuais que contêm bactérias replicantes.

Para estudar a entrada de Brucella num ensaio de elevado rendimento, é importante ser capaz de distinguir entre as bactérias intracelulares e extracelulares. O método aqui apresentado circumventos coloração de anticorpos diferencial de bactérias intracelulares e extracelulares. Ele baseia-se numa estirpe que expressa uma GFP Brucella induzível por tetraciclina em combinação com a expressão constitutiva de dsRed. A presença de um marcador dsRed constitutivo permite a identificação de todas as bactérias que estão presentes na amostra. expressão da GFP é induzida através da adição de tetraciclina anidrotetraciclina o análogo não-tóxico (ATC), simultaneamente com a inactivação de bactérias extracelulares por gentamicina (Gm). Enquanto o antibiótico Gm célula impermeável mata as bactérias extracelulares, atc pode entrar na célula hospedeira e induzir a expressão da GFP selectivamente em bactérias intracelulares. Esta dupla repórter permite a separação robusto de bactérias intracelulares individuais (GFP e de sinal dsRed) de bactérias extracelulares (somente sinal dsRed) por microscopia de campo amplo. De modo a alcançar a expressão da GFP intracelular detectável por Brucella verificou-se que 4 horas de indução por ATC resulta em um relisinal de poder. Esquemas de indução similares para expressar seletivamente GFP em bactérias intracelulares tem sido usado anteriormente para estudar Shigella intracelular ^12.

Protocolo

Nota: Todo o trabalho com cepas Brucella abortus vivos deve ser realizada dentro de um laboratório de nível de biossegurança 3 (BSL3), considerando todos os regulamentos necessários e precauções de segurança.

1. Preparação das placas de triagem e Cultivo de bactérias e células

1. Preparação de culturas de arranque Brucella abortus
   1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) do estoque de leite C -80 ° em uma placa Tryptic Soy Agar (TSA) contendo 50 ug / ml de canamicina (TSA / Km). Incubar a placa durante 3-4 dias a 37 ° C. Use estirpe Brucella abortus 2308 pJC43 (aphT :: GFP) ¹³ para o ensaio de endpoint e tensão Brucella abortus pAC042.08 (aphT :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) para o ensaio de entrada.
      Nota: O lipopolissacarídeo (LPS) liso de Brucella abortus é um importante determinante de virulência, mas mutantes ásperas pode ocorrer em frequências relativamente elevadas ^14. We recomendado, assim, testar o estado da estirpe de cultura antes de começar com esta experiência.
   2. bactérias Restreak sobre quatro placas de TSA / Km cobrir a placa completa e incubar durante 2-3 dias a 37 ° C.
   3. Usando um loop de plástico descartável, transferência e bactérias ressuspender das placas TSA / km em 10 ml de 10% de leite desnatado autoclavado. Certifique-se de que as bactérias são bem suspensão para assegurar que as concentrações bacterianas consistentes em todas as culturas de arranque.
   4. Alíquota de 250 ul da suspensão bacteriana em tubos de 2 ml do parafuso de fixação e congelamento a -80 ° C.
   5. Descongelar uma alíquota da cultura de arranque e transferir 25 ul, 50 ul, e 100 uL da cultura fermento de bactérias para separar 250 ml parafuso garrafas tampão com 50 ml de Tryptic Soy Broth (TSB) contendo 50 ug / ml de canamicina (TSB / km) . Selar os frascos com Parafilm.
   6. Incubar as garrafas durante a noite num agitador orbital a 100 rpm e 37 ° C.
   7. Medir a densidade óptica a 600 Nm (OD ₆₀₀₎ para determinar o volume de cultura de arranque necessária para atingir uma OD ₆₀₀ = 0,8-1,1 após cultura durante a noite.
2. Preparação de células HeLa
   1. Crescer as células HeLa em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (DMEM / 10% FCS) num incubador húmido 37 ° C com 5% de CO _2. células a 80% de confluência crescer.
3. Prepare as placas de triagem com siRNAs.
   1. Dilui-se ARNic em água isenta de RNase para uma concentração final de 0,32 uM. Transferência de 5 ul / poço para placas de 384-poços pretas clara poços de fundo plano.
      1. Use colunas 1, 2, 23 e 24 para controles padrão. Para controlos negativos, utilizar não-alvo siRNA (mexidos) e simulações de poços sem siRNAs (somente reagente de transfecção). Para os controlos de transfecção, usar um siRNA que induz a morte celular (KIF11), bem como os controlos positivos de factores do hospedeiro conhecidos envolvidos na infecção por Brucella (por exemplo, ARPC3,um componente do complexo Arp2 / 3 envolvida na polimerização de actina). Transferir disponíveis comercialmente bibliotecas siRNA ou siRNAs personalizados aos poços restantes.
      2. placas de vedação com folhas de alumínio destacáveis. placas armazenar a -20 ° C.
         Nota: As placas podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 6 meses e se a anos, dependendo as recomendações do fabricante.

2. reverso Transfection siRNA

1. Descongelar uma placa de 384 poços preta por centrifugação a 300 xg durante 20 min à temperatura ambiente.
   Nota: Isto irá trazer para baixo todo o líquido que pode aderir à tampa ou do lado dos poços.
2. Prepara-se o meio de transfecção por diluição do reagente de transfecção 1: 200 em DMEM sem FCS, à temperatura ambiente. Prepara-se o meio de transfecção não mais do que 20 minutos antes da utilização. Misturar cuidadosamente a solução antes de usar.
3. Adicionar 25 ul transfecção média a cada cavidade utilizando um dispensador de reagentee misturar as soluções movendo a placa e para trás.
4. Incubar a placa durante 1 hora à temperatura ambiente para permitir siRNA / transfecção formação do complexo reagente.
5. No entanto, preparar células HeLa por lavagem das células sub-confluentes de um frasco de 75 ^cm2, uma vez com 2,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS (tripsina).
6. Adicionar 1,5 ml de tripsina fresca e transferir o balão a 37 ° C durante 2-3 min, até que as células arredondar para cima.
7. Ressuspender as células em 10 ml pré-aquecido de DMEM / 16% FCS.
8. Contagem de células utilizando um contador de células automatizado e preparar uma suspensão de células de 10.000 células / ml em DMEM / FCS a 16%.
9. Adicionar 50 ul de suspensão de células para cada poço utilizando um dispensador de reagente resultante em 500 células / poço.
10. Mover a placa para trás e para conseguir uma distribuição uniforme das células. Deixar a placa à temperatura ambiente durante 5-10 minutos para permitir que as células se assentar.
11. Selar a placa com Parafilm e incubar-lo por 72 horas em uma de alumínio pré-aquecidoplaca numa incubadora a 37 ° C húmida com 5% de CO _2.
    Nota: A placa de alumínio pré-aquecido permite uma distribuição igual de temperatura ao longo de toda a placa de 384 poços.

3. Infecção e Fixação

1. Um dia antes da infecção, inocular o montante determinado em 1.1.7 do B. abortus cultura de arranque em 50 ml de TSB / Km médio de 250 ml parafuso garrafa cap. Fecha-se o frasco com Parafilm e as bactérias crescem durante a noite a 37 ° C e 100 rpm num agitador orbital a _DO600 = 0,8-1,1.
2. Medida _OD600 da cultura bacteriana e preparar o meio de infecção por diluição da cultura bacteriana em DMEM / FCS a 10% para atingir o desejado multiplicidade de infecção (MOI).
   Nota: Para obter uma taxa de infecção de 5-10% em células HeLa, uma MOI de 10 mil é usado. Uma curva de titulação MOI devem ser realizados para cada tipo de célula para obter taxas de infecção óptimas.
3. Trocar o meio de transfecção da placa de 384 poçoscom 50 ul do meio de infecção usando um lavador de placas automatizado.
4. Centrifugar a placa de 384 poços a 400 xg e 4 ° C durante 20 min.
   Nota: Isto ajuda a sincronizar o processo de infecção.
5. Selar a placa com parafilme e incubar num prato de alumínio pré-aquecido numa incubadora húmida a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 4 horas.
6. Lavam-se as células com DMEM / FCS a 10% contendo 100 ug / mL de GM para inactivar bactérias extracelulares utilizando o lavador de placas automático (use 200 ul / poço de lavagem de transbordo).
   Nota: Durante uma lavagem de transbordamento, o lavador de placas automático dispensa e aspira médio simultaneamente.
7. Para o ensaio de entrada, lave as células uma segunda vez com DMEM / FCS a 10% contendo 100 ug / mL de GM e 100 ng / ml ATC utilizando o lavador de placas automático (use 200 ul / poço de lavagem de transbordo).
8. Selar a placa com parafilme e devolvê-la para um prato de alumínio pré-aquecido na incubadora húmida a 37 ° C com _CO2 a 5% para outra40 h ou 4 h, para o ensaio de ponto final e o ensaio de entrada, respectivamente.
9. Para a fixação, lavar os poços com PBS usando o lavador de placas automático (usar 200 l / lavagem bem overflow).
10. Troca PBS com 50 ul de 3,7% de paraformaldeído em 0,2 M de HEPES a pH 7,4 (PFA) utilizando o lavador de placas automatizado.
    Nota: Cuidado: PFA é tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão.
11. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
12. Trocar o meio de fixação com 50 ul de PBS utilizando o lavador de placas automatizado. Nota: As amostras estão agora prontas para ser retirado do BSL3 se necessário.
    Atenção: A remoção de qualquer amostra de uma instalação BSL3 está sujeita a avaliação de riscos ea validação do processo e depende dos regulamentos aplicáveis ​​de biossegurança.

4. coloração

1. Lavar as células duas vezes com 50 ul de PBS.
2. Permeabilizar as células em 50 ul de 0,1% de Triton-X-100 em PBS durante 10 min.
3. Wcélulas de cinzas três vezes com PBS. Adicionar 20 ul de PBS contendo 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Lave as células três vezes em PBS e proteger a coloração da luz com uma folha de alumínio.

5. Imagiologia

1. Configure o microscópio de campo amplo automatizado para aquisição de imagem.
   Nota: As configurações para um microscópio ImageXpress Molecular Device usando software MetaXpress são descritos abaixo. dispositivos de microscopia alternativas 2D wide-campo com especificações de hardware apropriado e software de imagem pode ser usado (ver Tabela de Materiais / Equipamentos para detalhes).
   1. Selecione objetiva de 10X, câmera binning = 1, ganho = 1.
   2. Seleccionar o formato de placa que corresponde à placa de 384 poços.
   3. Adquirir 9 sítios por bem.
   4. Use "Ativar o foco do laser com base" e "Concentre-se em placa e bem inferior".
   5. Defina "First bem", como o bem inicial paraencontrar a amostra e "Todos os sites" para o site de focagem automática.
   6. Use o canal DAPI para definir manualmente o foco offset-Z.
   7. selecionar manualmente o Z-Offset do DAPI para todos os outros canais.
   8. corrigir manualmente o tempo de exposição para todos os canais para garantir uma ampla faixa dinâmica com baixa exposição excessiva.
      1. Adquirir uma imagem de um local representativa, utilizando a função de auto-exposição. Use este tempo de exposição de imagem 3-5 locais em toda a placa e ajustar o tempo de exposição manualmente até que os pixels brilhantes alcançar ~ 80% do brilho máximo ao longo de todos os sítios.
   9. Imagem do prato cheio usando os canais de DAPI e GFP para o ensaio de ponto final. Para o ensaio de entrada, selecione o canal de RFP, além disso.

6. Automated Análise de Imagem

Nota: CellProfiler 2 ¹⁵ é utilizado como software de análise de imagem para o segmento celular e objetos bacterianas e executar MEASUR automatizadoements dentro dos objectos identificados. O software fornece algoritmos de análise de imagem em módulos individuais, que podem ser combinadas numa tubagem que vai executar os módulos consecutivamente em todas as imagens, para executar automaticamente uma tarefa específica de análise de imagem. Para seguir o protocolo, instale CellProfiler 2.1.1 ou uma versão mais recente. Em seguida, carregar o gasoduto fornecido e siga as instruções abaixo para ajustar os parâmetros necessários dentro dos módulos. Uma descrição dos módulos individuais de todas as tubagens podem ser encontradas nos arquivos suplementar.

Nota: Duas condutas separadas são usadas para cada ensaio. A primeira tubagem calcula um modelo de sombreamento, o qual é utilizado pelo segundo gasoduto para corrigir imagens antes da análise. correcção de sombreado é aplicado às imagens para reduzir os efeitos de um trajecto de luz não homogénea do microscópio. Calcular o modelo de sombreamento no primeiro gasoduto é um processo demorado, mas os resultados serão de maior precisão.

Endpoint
1. Calcular o modelo de sombreamento
   1. Vá para o menu "Arquivo", selecione "Importar" → "Pipeline de arquivo ..." e selecione o pipeline fornecido "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Quando perguntado se deseja converter o gasoduto legado, responda "Não converter".
   2. Ir para → "Ver definições de saída", "Saída" e selecione uma pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para os modelos de sombreamento resultantes.
   3. No Módulo (1) "LoadImages", ajustar o nome do "Texto que essas imagens têm em comum" para coincidir com os nomes de imagem.
   4. Certifique-se de que nenhum dos módulos de mostrar sua exibição antes de executar a análise completa, desmarcando todos os símbolos de olho ao lado dos módulos. Nota: Isto diminui significativamente necessários recursos computacionais durante o processamento do pipeline.
   5. Pressione o botão "Analisar Imagens" para iniciar o cálculo do modelo de sombreamento.
2. Análise de Imagem executar
   1. Vá para o menu "Arquivo", selecione "Importar" → "Pipeline de arquivo ..." e selecione o pipeline fornecido "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Quando perguntado se deseja converter o gasoduto legado, responda "Não converter".
   2. Ir para → "Ver definições de saída", "Saída" e selecione uma pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para a planilha resultante.
   3. No módulo (1) "LoadImages", ajustar o nome do "Texto que essas imagens têm em comum" para coincidir com os nomes de imagem.
   4. No módulo (2) "LoadSingleImage", carregar os modelos de sombreamento calculados de acordo com 6.1.1, seleccionando a localização e nomes dos dois modelos de sombreamento.
   5. Em módulos (4) - (5) "ImageMath", ajustar o parâmetro "Multiply a primeira imagem por" correspondentes a profundidade da câmara microscópio bits. Para 8 e 16 bitimagens definir o parâmetro para "1.0", por 12 imagens bit definir o parâmetro para "16.0".
   6. No módulo (9) "ImageMath" ajustar o parâmetro "Multiplicar a segunda imagem por" a um valor (começar com 0,25) que irá suprimir o sinal de Brucella na coloração DAPI sem suprimir a Núcleos.
      1. Clique em "Modo de teste Iniciar", depois ativar o símbolo de pausa e a função de exibição para o módulo (9), clicando nos ícones correspondentes do módulo.
         Nota: O símbolo de pausa aparece em amarelo, enquanto o símbolo do olho vai mostrar um olho aberto, se for ativado.
      2. Clique em "Executar" para executar a análise até módulo (9) com o símbolo de pausa ativa. Para testar os valores para o módulo, prima "Passo".
      3. Direito do mouse na imagem recém-inaugurado e definir "contraste de imagem" para "Log normalizado". Repetidamente um passo atrás para o módulo (9), ajuste o parâmetro "Multiplicar a segunda imagem de" e passar por cima tele módulo novamente, até que o sinal Brucella é totalmente suprimida enquanto ao mesmo tempo áreas pretas que indicam excesso de subtração são minimizados na imagem resultante.
   7. No módulo (10) "IdentifyPrimaryObjects", defina o parâmetro "limite inferior limite" alta o suficiente (começar com zero) para que os núcleos são segmentadas e do fundo é ignorada.
      1. Para identificar um bom valor para o módulo (10), passo sobre o módulo e exibir a imagem de entrada como explicado nos passos 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
      2. Direito do mouse na imagem de entrada e exibir o histograma.
         Nota: O pico do histograma indica tipicamente fundo.
      3. A partir da intensidade de fundo aumentar o parâmetro até uma boa segmentação dos núcleos é obtida como apresentado na imagem de saída.
         Nota: Definir o limite mais elevado do que a intensidade de fundo é especialmente importante para sites vazios.
   8. No módulo (15)4; FilterObjects ", ajustar o parâmetro" valor mínimo ", de modo que as células com Brucella claramente visível no núcleo são mantidos, e todos os outros são filtrados afastado Nesta etapa, ignorar Brucella fora do núcleo..
      1. Para identificar um bom valor, passo sobre o módulo e exibir a imagem de saída, tal como explicado nos passos 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2. Iniciar a partir de zero, que identifica todas as células como infectado e aumentar o valor em pequenos passos até que apenas as células com Brucella claramente visível no núcleo são mantidos.
   9. No módulo (16) "FilterObjects", ajustar o parâmetro "valor mínimo", de modo que as células com Brucella claramente visível nas perinucleus são mantidos, e todas as outras células são filtrados de distância. Usar uma abordagem semelhante à do módulo anterior.
   10. No módulo (17) "FilterObjects", ajustar o parâmetro "valor mínimo", de modo que as células com Brucella claramente visível na Vorcorpo celular onoi são mantidos, e todas as outras células são filtrados de distância. Usar uma abordagem semelhante à do módulo anterior.
       Nota: O corpo da célula de Voronoi é uma extensão radial do núcleo por 25 pixels sem sobreposição aos corpos celulares Voronoi vizinho.
   11. Saia do modo de teste e certifique-se que nenhum dos módulos de mostrar sua exibição antes de executar a análise completa, desmarcando todos os símbolos de olho ao lado dos módulos.
       Nota: Isto diminui significativamente necessários recursos computacionais durante o processamento do pipeline.
   12. Pressione o botão "Analisar Imagens" para iniciar a análise.
   13. Quando da análise ter terminado, inspeccionar as imagens PNG resultantes, bem como a folha de CSV para assegurar que a análise trabalhou de forma fiável ao longo da placa.
1. Ensaio de entrada
   1. Calcular o modelo de sombreamento
      1. Vá para o menu "Arquivo", selecione "Importar" → "Pipeline de arquivo ..." e selecione a fornecerd pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Quando perguntado se deseja converter o gasoduto legado, responda "Não converter".
      2. Ir para → "Ver definições de saída", "Saída" e selecione uma pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para os modelos de sombreamento resultantes.
      3. No módulo (1) "LoadImages", ajustar o nome do "Texto que essas imagens têm em comum" para coincidir com os nomes de imagem.
      4. Certifique-se de que nenhum dos módulos de mostrar sua exibição antes de executar a análise completa, desmarcando todos os símbolos de olho ao lado dos módulos.
         Nota: Isto diminui significativamente necessários recursos computacionais durante o processamento do pipeline.
      5. Pressione o botão "Analisar Imagens" para iniciar o cálculo do modelo de sombreamento.
   2. Análise de Imagem executar
      1. Vá para o menu "Arquivo", selecione "Importar" → "Pipeline de arquivo ..." e selecione o providgasoduto ed "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Quando perguntado se deseja converter o gasoduto legado, responda "Não converter".
      2. Ir para → "Ver definições de saída", "Saída" e selecione uma pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para a planilha resultante.
      3. No módulo (1) "LoadImages", ajustar o nome do "Texto que essas imagens têm em comum" para coincidir com os nomes de imagem.
      4. No módulo (2) "LoadSingleImage", carregar os modelos de sombreamento calculados de acordo com 6.2.1, seleccionando a localização e nomes dos dois modelos de sombreamento.
      5. Em módulos (4) - (5) "ImageMath", ajustar o parâmetro "Multiply a primeira imagem por" correspondentes a profundidade da câmara microscópio bits. Para 8 e 16 bit imagens definir o parâmetro para "1.0", por 12 imagens bit definir o parâmetro para "16.0".
      6. No módulo (6) "IdentifyPrimaryObjects", defina o parâmetro "Lower ligado na limiar "alta o suficiente para que apenas os núcleos são segmentadas e do fundo é ignorada.
         1. Para identificar um bom valor para o módulo (6), o passo sobre o módulo e exibir a imagem de entrada como explicado nos passos 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
         2. Direito do mouse na imagem de entrada e exibir o histograma.
            Nota: O pico do histograma indica tipicamente fundo.
         3. A partir da intensidade de fundo aumentar o parâmetro até uma boa segmentação dos núcleos é obtida como apresentado na imagem de saída.
            Nota: Definir o limiar acima do fundo é importante para sites vazios.
      7. No módulo (8) "IdentifyPrimaryObjects", defina o parâmetro "limite inferior limite" alta o suficiente que apenas Brucella são segmentadas e do fundo é ignorada.
         1. Para identificar um bom valor para o módulo (8), o passo sobre o módulo e exibir a imagem de entrada como explicado nos passos 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
         2. Direito do mouse na imagem de entrada e exibir o histograma.
            Nota: O pico do histograma indica tipicamente fundo.
         3. A partir de intensidade plano aumentam o parâmetro até boa segmentação de Brucella como exibido na imagem de saída é alcançado.
            Nota: Definir o limiar acima do fundo é importante para sites vazios.
      8. No módulo (11) "FilterObjects", ajustar o parâmetro "valor mínimo" para que de fundo e artefatos são filtrados de distância, e apenas colônias Brucella são mantidos.
         1. Para identificar um bom valor, passo sobre o módulo e exibir a imagem de saída, tal como explicado nos passos 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2. Comece com o valor selecionado no 6.2.2.7 e gradual aumentá-la até que apenas objetos Brucella são mantidos.
      9. Saia do modo de teste e certifique-se que nenhum dos módulos de mostrar sua exibição antes de executar a análise completa por unchecking todos os símbolos de olho ao lado dos módulos.
         Nota: Isto diminui significativamente necessários recursos computacionais durante o processamento do pipeline.
      10. Pressione o botão "Analisar Imagens" para iniciar a análise.
      11. Quando da análise ter terminado, inspeccionar as imagens PNG resultantes, bem como a folha de CSV para assegurar que a análise funcionou bem em toda a placa.

7. Infecção Scoring

Nota: siRNAs que têm um impacto significativo sobre a viabilidade das células têm que ser considerados com cautela, uma vez que este pode promover descobertas falsos positivos. Um número de celular alterada afeta o MOI real e segmentação de genes essenciais podem ter efeitos pleiotrópicos sobre a infecção do patógeno. Enquanto o esgotamento incompleta por siRNAs permite o estudo dos genes essenciais, tais metas têm de ser validadas por métodos alternativos (por exemplo, a interferência farmacêutica) para corroborar o seu papel como factores do hospedeirodurante a infecção.

1. Ensaio Endpoint
   1. Abrir a folha CSV gerado no passo 6.1.2.12 e calcular uma taxa de infecção por poço através da divisão do número de células infectadas (CellProfiler leitura: "Count_InfectedCells") pelo número total de células (CellProfiler leitura: "CountNuclei"). Se vários locais por poço foram fotografadas, em primeiro lugar resumem todos os sítios para cada cavidade, para construir um número por poços de células infectadas e um número total por poço de células.
   2. Execute normalização de pontuação Z para explicar variações placa-a-placa se as placas contêm suficientes não atingiu siRNAs. Suponha que um número suficiente de siRNAs não-vida por placa se bibliotecas completas são rastreados.
      
2. Ensaio de entrada
   1. Abra a folha de CSV gerado no passo 6.2.2.10 e calcular a taxa de infecção por bem dividindo-se o número de células infectadas (CellProfiler leitura: "Count_InfectedCeLLS ") pelo número total de células (CellProfiler leitura:". CountNuclei ") Se vários locais por poço foram fotografadas, em primeiro lugar resumem todos os sítios para cada cavidade, para construir um número por poços de células infectadas e um per-bem número total de células.
   2. Para quantificar a carga bacteriana de células infectadas, estimar a área total ocupada pela bactéria intracelular por célula infectada. Para este fim, divide a área integrada de todas as bactérias intracelulares que se sobrepõem com as células (CellProfiler leitura: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") pelo número de células infectadas neste local. Para ter em conta artefactos, utilizar a mediana de todos os locais desta leitura como a leitura bem.
      Nota: Se este ensaio é utilizado como um ensaio de seguimento que contém um grande número de genes envolvidos na infecção por Brucella, não se aplicam Z pontuação normalização. Em vez disso, execute a normalização usando poços simulados como referência para explicar a variação placa-a-placa.

Resultados

A Figura 1A mostra um exemplo de análise de imagem usado para identificar automaticamente as células infectadas no ensaio de ponto final. Núcleos de células HeLa coradas com DAPI foram identificados, um peri-núcleo de largura 8 pixels em torno do núcleo, e um corpo da célula de Voronoi por extensão do núcleo por 25 pixels foram calculados. Uma vez que as bactérias proliferam principalmente no espaço peri-nuclear, a intensidade de GFP nesta área da célula é ...

Discussão

Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Agar (TSA)	BD	236950
Tryptic Soy Broth (TSB)	Fluka	22092
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270	Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15400-054	10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter	Merck Milipore	PHCC20060	Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate	Sigma-Aldrich	M2062
Peelable aluminum foil	Costar	6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser"	Thermo Scientific	5840150	Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16"	BioTek	ELX5016	This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Scrambled siRNA	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)			Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP)			Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090	Sigma-Aldrich		TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092	Sigma-Aldrich		TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices	IXM IMAGING MSCOPE	Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus	Molecular Devices	1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective	Nikon	MRF00100	N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera	Molecular Devices	1-2300-1060	1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software	Molecular Devices	9500-0100
LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI	Semrock	FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI	Semrock	FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI	Semrock	FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP	Semrock	FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP	Semrock	FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP	Semrock	FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP	Semrock	FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP	Semrock	FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP	Semrock	FF593-Di03-25x36