Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocit�des do rato de Medula Óssea

Resumo

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Resumo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Introdução

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protocolo

NOTA: MRL / Mp-Fas ^lpr (MRL / lpr) ratos com lúpus-propensa foram criados e mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos seguindo as exigências do Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) no número Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os experimentos com animais foram realizados sob IACUC protocolo número 12-062.

1. celular Meio de Cultura e Tampão Sorting

1. Prepare meio de cultura celular completo (C10), utilizando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, piruvato de sódio 1 mM, 1% 100 de MEM aminoácidos não essenciais, 10 mM de HEPES, 55 uM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
2. Preparar tampão de triagem (HBSS-cheia) usando Solução Salina Equilibrada de Hank 1x (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES, 2,5 mg / ml de albumina de soro bovino,0,05 mM de MgCl ₂ e 0,2 U / ml de ADNase I.

2. Rato Dissection

1. Preparar dois pratos diâmetro de 6 cm contendo 4 ml C10. Coloque os pratos em gelo.
2. Euthanize o mouse por inalação de CO _2.
3. Colheita do baço e mantê-lo em um prato com C10 em gelo.
   1. Pin o mouse para baixo com a barriga virada para cima na placa de dissecação. Esteriliza-se o corpo de pulverização 70% de etanol.
   2. Cortar a pele e separar a pele da parede muscular debaixo ao longo da linha mediana ventral a partir da sínfise púbica para o pescoço.
   3. Cortar a pele ao longo do membro posterior a partir da primeira incisão para o tornozelo.
   4. Pin a pele volta sobre os lados e cortar a parede muscular ao longo dos lados a partir do primeiro local de incisão do diafragma.
   5. Pin parede do músculo volta no lado direito da cabeça.
   6. Localize o baço do lado direito do rato debaixo do intestino delgado e ao lado do estômago. Pegue uma extremidade do the baço e separá-lo do estômago.
4. Cortar ambos os membros posteriores para fora, incluindo o fémur ea tíbia, e remover todos os músculos, tanto quanto possível.
   1. Corte os músculos ao longo do membro posterior do pélvica joint / quadril até o tornozelo com uma tesoura afiada, tentando evitar vasos sanguíneos.
   2. Separar o membro posterior pelo corte no pélvica / articulação do quadril e articulação do tornozelo / pé, sem a exposição do conteúdo da medula óssea.
   3. músculos restantes limpas nos ossos por riscar com uma lâmina de barbear repetidamente e cortando os músculos nos pontos comuns.
5. Manter os ossos em um prato de 6 cm, que inclua 4 ml C10 em gelo. Proceder para dissecar a próxima mouse.

Isolamento 3. esplen�ito

1. Homogeneizar o baço suavemente com um êmbolo de seringa de encontro a um filtro de células de 70 mícrons no topo do prato contendo 4 ml C10 até há peças vermelhos são visíveis.
2. Adicionar adicional C10 6 ml no prato através do filtro umaND depois transferir a suspensão de células total de 10 ml para um tubo de 15 ml.
3. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
4. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise de 1 x de glóbulos vermelhos (RBC). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Após a incubação, centrifugar o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
6. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de C10. Descartar qualquer grandes aglomerados (células mortas) e manter o tubo em gelo para mais tarde.
   NOTA: Se há muitas pequenas aglomerações, usar um filtro de células 70 mícrons para filtrar a suspensão de células uma vez.
7. Contar o número de células com azul de tripano utilizando um contador de células automatizado.

4. Isolamento de medula óssea celular

1. Transferir os ossos com 4 ml de C10 em um almofariz e ainda 6 ml C10 para perfazer um volume de 10 ml no total C10.
2. Quebrar os ossos delicadamente na argamassa usando apestle.
3. Agita-se suavemente com o pilão para libertar a medula óssea em C10.
4. Transferir as ml C10 10 contendo medula óssea em um tubo cônico de 50 ml no gelo através de um filtro de células 70 mícrons. Adicionar C10 10 ml fresco na argamassa ainda contendo os ossos.
   NOTA: Pipeta a solução contendo medula óssea cima e para baixo várias vezes antes de passar através do filtro se contiver pedaços vermelhos são visíveis.
5. Repita os passos de 4,2 a 4,4 vezes. Após a última lavagem, os ossos devem aparecer branco.
6. Centrifuga-se o tubo de 50 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C. Enquanto isso, preparar 5 ml de meio de gradiente de densidade de pronto-a-usar num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, à TA.
7. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de C10.
8. camada lentamente a suspensão a 10 ml de células no topo do meio de gradiente de densidade de 5 ml, mantendo clara interface entre as duas fases. Em seguida, centrifugar a 15 ml tubo cônico de 1.363 g por 30 min aRT (20 ° C) com o conjunto de aceleração como 9 e desaceleração definido como 0 (ou Brake OFF).
9. Após centrifugação, remover a parte superior 8 ml de solução cuidadosamente e recolher o revestimento 2 ml de Buffy na interface (uma camada de células mononucleares) para um novo tubo de 15 ml.
10. Adicionar C10 12 mL de gelo frio para as tubo de 15 ml contendo células mononucleares de medula óssea, tampa e gire várias vezes para misturar bem, em seguida, centrifugar o tubo a 800 xg durante 10 min, 4 ° C.

Manchas na superfície 5. celular para FACS

1. coloração amostra
   1. Prepare de murganho anti-CD16 / 32 solução de anticorpo (diluição 1 a 100 em HBSS-cheia, 5 ug / ml de concentração final).
   2. Após centrifugação no passo 4.10, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 ul de solução de anticorpo anti-ratinho CD16 / 32 para bloquear o receptor de Fc nas células mononucleares. Incubar em gelo durante 10 min.
   3. Prepare a mistura de anticorpo conjugado com fluorescência (formigadiluição i-rato CD11c-PE 01:40, anti-rato CD11b-APC-CY7 1:80 de diluição, diluição 1:40 anti-rato PDCA-1-FITC e anti-rato B220-V500 diluição 1:40 em HBSS- completo, tal como recomendado pelo fabricante em 100 ul de volume final por amostra).
      NOTA: É importante para titular anticorpos antes do uso.
   4. Após 10 minutos de incubação no passo 5.1.2, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover o material não ligado Anti-ratinho de CD16 / 32.
   5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mistura de anticorpo conjugado com fluorescência-ul. Incubar em gelo durante 15 min no escuro.
   6. Após 15 min de incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover os anticorpos não ligados fluorescência conjugado.
   7. Preparar a solução de carregamento de FACS (500 ng / ml de DAPI em HBSS-cheio).
   8. Após centrifugação no passo 5.1.6, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 μ; L FACS solução de carga. Transferir a suspensão de células em um 12 x 75 mm em volta do tubo inferior (tubo de FACS) e manter o tubo em gelo no escuro até triagem dentro de 1 h.
2. A coloração para compensação
   1. Etiqueta de 6 tubos de FACS como PE, a APC-CY7, FITC, V500, DAPI ou corados. Esplenócitos alíquota a 1 X 10 ⁶ células / tubo para os tubos de FACS, e lava-se com 4 mL de HBSS-completo a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
      NOTA: Use DNA de ligação de corante fluorescente, DAPI, distinguir células vivas a partir de células mortas. DAPI pode passar através da membrana plasmática de células mortas (mas não de células vivas) e ADN se ligam cromossoma.
   2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 uL de HBSS-cheia.
   3. Em cada tubo de FACS correspondente, adicionar um dos seguintes anticorpos: CD19-PE anti-ratinho de diluição 1:40, anti-ratinho de diluição 1:80 CD11b-APC-CY7, anti-ratinho PDCA-1-FITC ou diluição 1:40 anti-ratinho B220-V500 diluição 1:40 como recomendado pelo manufacturer. Deixar o ^5º (DAPI) e ^6º (sem manchas) FACS tubos como elas são. Misture bem, por agitação e incuba-se todos os tubos de FACS em gelo no escuro durante 15 min.
   4. Após a incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-completo a cada tubo e os tubos de centrífuga de FACS a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
   5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 uL de gelo frio HBSS completa excepto para o sedimento no tubo rotulado DAPI, que é ressuspenso em 500 ul de solução de FACS de carregamento. Manter todos os tubos de 6 em gelo no escuro até triagem.

6. Classificando no Sorter celular

NOTA: A operação de triagem procedimento no citômetro e software é padronizado com instruções detalhadas fornecidas pela empresa. Resumidamente, usamos 100 bocal micron a 20 psi, a concentração de células alvo definido entre 5-10.000.000 por ml, e ajustar a eficiência de 70% ou superior (ou seja, os conflitos mantida sob 30%).

1. Preparar tubos de recolha de FACS com 500 mL de FBS / tubo contendo 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
2. Ajustar os parâmetros de compensação do classificador de células utilizando tubos de compensação-mancha única a partir do passo 5.2.
   1. Grave 10.000 células em tubos sem mácula para definir porta negativo para cada intensidade de fluorescência.
   2. Grave 10.000 células em outros tubos de compensação mancha única para definir portão positivo para cada intensidade de fluorescência.
      NOTA: O software calcula automaticamente os parâmetros de compensação.
3. Use uma amostra a partir do passo 5.1 para definir as portas de populações de células classificadas segundo a gravação 3.000 células. Usando intensidade fluorescente como parâmetros de X e do eixo Y do gráfico, a população de células alvo porta manualmente como um grupo de pontos aparentemente separados dos outros pontos.
   NOTA: Este conjunto gating é flexível e arbitrária com base nos requisitos de pesquisadores. Se os pesquisadores esperam maior pureza com base em um ou mais marcadores, mover o portãomais elevada com base na intensidade de fluorescência correspondente.
4. Carregar um tubo de recolha e começar a separar a população de células alvo.
5. Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem até que todos os tubos de amostras são feitas.
6. Adicione gelo frio C10 ao tubo de recolha de até 4 ml, tampa e inverta para misturar.
7. Centrifuga-se o tubo de recolha a 800 xg durante 5 min, 4 ° C, e, em seguida, aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 200 ul com sedimento de células intactas.
8. Adicionar 1 mL de gelo frio C10 para ressuspender a pelete de células e transferir toda a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
9. Centrifugar o tubo de 1,5 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C e aspirar o sobrenadante, deixando 100? L com o sedimento de células intactas.
10. Armazenar as populações de células ordenadas em gelo até à sua utilização.

Resultados

Nosso objetivo para enriquecer medula óssea pDC com elevado grau de pureza, e sem a influência de outros tipos de células, a partir de ratos lúpus-propensa MRL / lpr de ambos tenra idade e de idade para estudar as mudanças funcionais do PDC em relação à sua capacidade de produzir IFN. A primeira estratégia de purificação usado foi de MCS, a qual, como mostra a Figura 1, conduziu apenas a 7,75% de pureza, após o enriquecimento. Comparado ao MCS, FACS enriqueci...

Discussão

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences