Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Riepilogo

Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.

Abstract

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Introduzione

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protocollo

NOTA: MRL / Mp-Fas ^LPR (MRL / lpr) mice lupus inclini sono stati allevati e mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni conformemente ai requisiti del Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC) a Numero Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto IACUC protocollo # 12-062.

1. cellulare terreno di coltura e ordinamento Buffer

1. Preparare completa mezzo di coltura cellulare (C10) con RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale bovino, 1 mM di sodio piruvato, 1% 100 MEM aminoacidi non essenziali, 10 mM HEPES, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
2. Preparare tampone di smistamento (HBSS-pieno) utilizzando la soluzione di 1x Hank salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina,0.05 mM MgCl ₂ e 0,2 U / ml I. DNase

2. mouse Dissection

1. Preparare due piatti di diametro 6 cm contenente 4 ml C10. Porre le capsule in ghiaccio.
2. Eutanasia il mouse da CO ₂ inalazione.
3. Raccolto la milza e tenerlo in un piatto con C10 sul ghiaccio.
   1. Pin il mouse verso il basso con la pancia rivolta verso l'alto sulla piastra di dissezione. Sterilizzare il corpo a spruzzo 70% di etanolo.
   2. Tagliare la pelle e separare la pelle dalla parete muscolo sotto lungo la linea mediana ventrale dalla sinfisi pubica al collo.
   3. Tagliare la pelle lungo l'arto posteriore dalla prima incisione per la caviglia.
   4. Pin la pelle posteriore sui lati e tagliare la parete muscolare lungo i lati dal primo posto incisione per diaframma.
   5. Pin la parete muscolare posteriore sul lato destro della testa.
   6. Trova la milza sul lato destro del mouse sotto tenue e accanto stomaco. Pick up una estremità di The milza e separarlo dallo stomaco.
4. Tagliare entrambi gli arti posteriori fuori, compreso femore e tibia, e rimuovere tutti i muscoli il più possibile.
   1. Tagliare i muscoli lungo dell'arto posteriore dal bacino / anca giunto alla caviglia con una forbice tagliente, cercando di evitare i vasi sanguigni.
   2. Separare il arto posteriore fuori tagliando al bacino / anca e caviglia / piede senza l'esposizione dei contenuti del midollo osseo.
   3. Pulire muscoli rimanenti sulle ossa graffiando con una lametta ripetutamente e tagliando i muscoli nei punti comuni.
5. Mantenere le ossa in un piatto 6 centimetri contenente 4 ml C10 su ghiaccio. Procedere alla dissezione il mouse successivo.

Isolamento 3. splenocyte

1. Omogeneizzare la milza delicatamente con un pistone siringa contro un filtro cella 70 micron sulla parte superiore della capsula contenente 4 ml C10 fino a quando non pezzi rosso sono visibili.
2. Aggiungere ulteriore C10 6 ml nel piatto attraverso il filtro di unand poi trasferire la sospensione cellulare 10 ml totali di un tubo da 15 ml.
3. Centrifugare il tubo conico a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
4. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 ml 1 x globuli rossi (RBC) tampone di lisi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
5. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta conica a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
6. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml C10. Eliminare le grandi grumi (cellule morte) e mantenere la provetta in ghiaccio per più tardi.
   NOTA: Se ci sono molti piccoli ciuffi, usare un filtro cella di 70 micron per filtrare la sospensione cellulare una volta.
7. Contare il numero di cella con trypan blu utilizzando un contatore di cellule automatizzato.

L'isolamento delle cellule 4. midollo osseo

1. Trasferire le ossa con 4 ml C10 in un mortaio e aggiungere 6 ml C10 per fare un volume di 10 ml C10 in totale.
2. Crack le ossa dolcemente nel mortaio utilizzando apestle.
3. Mescolare delicatamente con il pestello per liberare il midollo osseo in C10.
4. Trasferire i ml C10 10 contenenti midollo osseo in un tubo conico da 50 ml su ghiaccio attraverso un colino cella di 70 micron. Aggiungere 10 ml C10 fresche nella malta contenente ancora le ossa.
   NOTA: Pipettare la soluzione contenente midollo osseo su e giù diverse volte prima di passare attraverso il filtro se ciuffi rossi sono visibili.
5. Ripetere i passaggi tra 4,2 e 4,4 volte. Dopo l'ultimo lavaggio, le ossa dovrebbero apparire bianco.
6. Centrifugare il tubo conico da 50 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C. Nel frattempo, preparare 5 ml di mezzo gradiente di densità ready-to-use in un 15 ml provetta da centrifuga conica a RT.
7. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml C10.
8. Lentamente strato sospensione 10 ml di cellule sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità 5 ml, mantenendo interfaccia netta tra le due fasi. Poi centrifugare la provetta conica da 15 ml a 1.363 g per 30 min aRT (20 ° C) con set accelerazione 9 e decelerazione impostato come 0 (o freno OFF).
9. Dopo la centrifugazione, rimuovere la parte superiore soluzione 8 ml attenzione e raccogliere il mantello 2 ml buffy all'interfaccia (uno strato di cellule mononucleate) in un nuovo tubo da 15 ml.
10. Aggiungere C10 12 ml di ghiaccio freddo al tubo da 15 ml contenenti cellule mononucleari del midollo osseo, tappo e capovolgere più volte per mescolare bene, poi centrifugare la provetta a 800 g per 10 min, 4 ° C.

5. cellulari di superficie di colorazione per FACS

1. colorazione del campione
   1. Preparare Topo anti-CD16 / 32 soluzione di anticorpi (1 a 100 diluizione in HBSS-pieno, 5 mg / ml concentrazione finale).
   2. Dopo la centrifugazione al punto 4.10, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 ml soluzione anti-topo CD16 / 32 anticorpi per bloccare il recettore Fc sulle cellule mononucleari. Incubare in ghiaccio per 10 min.
   3. Preparare miscela di anticorpi a fluorescenza coniugato (anti-topo CD11c-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione e anti-topo B220-V500 01:40 diluizione nel HBSS- pieno come consigliato dal produttore in 100 volume finale ml per campione).
      NOTA: E 'importante per titolare anticorpi prima dell'uso.
   4. Dopo 10 min di incubazione nel passo 5.1.2, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere non legato anti-topo CD16 / 32.
   5. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 100 miscela di anticorpi fluorescenza coniugato microlitri. Incubare in ghiaccio per 15 minuti al buio.
   6. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere gli anticorpi fluorescenza coniugato non legato.
   7. Preparare la soluzione di carico FACS (500 ng / ml DAPI in HBSS-pieno).
   8. Dopo la centrifugazione al punto 5.1.6, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μ; L FACS soluzione di carico. Trasferire la sospensione cellulare in un 12 x 75 mm tubo fondo rotondo (tubo FACS) e tenere il tubo in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento entro 1 ora.
2. La colorazione di risarcimento
   1. Etichetta 6 FACS tubi PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI o senza macchia. Splenociti aliquote a 1 x 10 ⁶ cellule / tubo nei tubi FACS, e lavare con 4 ml HBSS-pieno a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
      NOTA: Utilizzare DNA-binding colorante fluorescente, DAPI, di distinguere le cellule vive dalle cellule morte. DAPI può passare attraverso la membrana plasmatica delle cellule morte (ma non di cellule vive) e il DNA cromosomico legano.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri HBSS-pieno.
   3. In ogni tubo FACS corrispondente, aggiungere uno dei seguenti anticorpi: anti-topo CD19-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione o anti-topo B220-V500 01:40 diluizione come raccomandato dal manufacturer. Lasciare il 5 ^° (DAPI) e 6 ^° (senza macchia) FACS tubi così come sono. Mescolare bene agitando e incubare tutti i tubi FACS su ghiaccio al buio per 15 min.
   4. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno in ogni provetta e centrifugare i tubi FACS a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
   5. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di ghiaccio freddo HBSS-completo tranne per il pellet nella provetta etichettata DAPI, che viene risospeso in 500 microlitri soluzione tampone FACS. Mantenendo tutti i 6 tubi in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento.

6. Ordinamento sul cell sorter

NOTA: Il funzionamento di smistamento procedura sul citometro e il software è standardizzato con istruzioni dettagliate fornite dalla società. In breve, usiamo 100 ugelli micron a 20 psi, impostare la concentrazione cellulare bersaglio compresa fra 5 - 10 milioni per ml, e regolare l'efficienza al 70% o superiore (per esempio, i conflitti tenuti sotto 30%).

1. Preparare le provette FACS di raccolta con 500 ml FBS / provetta contenente 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
2. Regolare i parametri di compensazione del cell sorter utilizzando tubi di compensazione singola macchia dal punto 5.2.
   1. Registrare 10.000 cellule in provetta senza macchia per impostare cancello negativo per ogni intensità fluorescente.
   2. Registrare 10.000 cellule in altri tubi di compensazione singolo-macchia per impostare cancello positivo per ogni intensità fluorescente.
      NOTA: Il software calcola automaticamente i parametri di compensazione.
3. Utilizzare un campione dal punto 5.1 per impostare le porte di popolazioni cellulari ordinate registrando 3.000 cellule. Usando intensità fluorescente come parametri di X e grafico Y, popolazione di cellule bersaglio cancello manualmente come un gruppo di punti apparentemente separati dagli altri punti.
   NOTA: Questo insieme gating è flessibile e arbitraria in base alle esigenze dei ricercatori. Se i ricercatori si aspettano maggiore purezza sulla base di uno o più indicatori, muovere il cancellosuperiore basato sulla intensità di fluorescenza corrispondente.
4. Caricare un tubo di raccolta e iniziare a ordinare la popolazione di cellule bersaglio.
5. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio dopo la cernita fino a quando tutte le provette dei campioni sono fatti.
6. Aggiungere il ghiaccio freddo C10 al tubo di raccolta fino a 4 ml, tappo e miscelare.
7. Centrifugare il tubo di raccolta a 800 xg per 5 min, 4 ° C, e quindi aspirare il surnatante, lasciando circa 200 microlitri con pellet di cellule intatte.
8. Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo C10 per risospendere il pellet cellulare e trasferire tutto sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml centrifuga.
9. Centrifugare la provetta da 1,5 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C e aspirare il surnatante, lasciando 100 microlitri con il pellet di cellule intatte.
10. Conservare le popolazioni di cellule ordinati sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Risultati

Abbiamo puntato ad arricchire il midollo osseo pDC con elevata purezza, e senza l'influenza di altri tipi di cellule, da MRL / lpr topi lupus inclini di giovani e meno giovani di età per studiare i cambiamenti funzionali del pDC quanto riguarda la loro capacità di produrre IFNα. La prima strategia di purificazione usato era MCS, che, come mostra la figura 1, portato a solo 7,75% di purezza dopo l'arricchimento. Rispetto alla MCS, FACS arricchito PDC purezza al...

Discussione

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences