JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы сообщаем протокол с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток, чтобы изолировать плазмоцитов дендритные клетки (PDC) с высокой степенью чистоты из костного мозга волчаночного склонной мышей для функциональных исследований Pdc.

Аннотация

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Введение

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. 1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota 8 and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. 9 Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. 10 However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. 11 Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). 12 Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. 13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), 15 we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. 16 However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.16 Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. 11

протокол

Примечание: MRL / Мр-Fas LPR (MRL / LPR) волчанка склонной мышей разводили и поддерживали в определенном патогена объекта следующим требованиям институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) под номером Virginia Tech (обеспечение защиты животных: A3208-01). Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколом IACUC # 12-062.

1. среда для культивирования клеток и сортировка буфера

  1. Подготовить всю среду для культивирования клеток (С10) с использованием среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 1% 100 MEM заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина.
  2. Подготовка сортировки буфера (HBSS-полный) с помощью 1x Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением 10 мМ HEPES, 2,5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина,0,05 мМ MgCl 2 и 0,2 Ед / мл ДНКазы I.

2. Мышь Вскрытие

  1. Приготовьте два блюда диаметром 6 см, содержащих 4 мл С10. Поместите посуду на лед.
  2. Эвтаназии мыши по CO 2 ингаляции.
  3. Урожай селезенку и держать его в блюдо с С10 на льду.
    1. Pin мышь вниз с животом вверх на вскрытии пластины. Стерилизацию тело путем распыления 70% этанола.
    2. Разрежьте кожу и отделить кожу от мышечной стенки внизу вдоль вентральной средней линии от лобкового симфиза до шеи.
    3. Разрежьте кожу вдоль задней конечности от первого разреза до лодыжки.
    4. Зафиксируйте кожу обратно по бокам и сократить мышечную стенку по бокам от первого места разреза к диафрагме.
    5. Pin мышечной стенки назад на правой стороне головы.
    6. Расположить селезенке на правой стороне мыши под тонкой кишки и рядом с желудком. Возьмите один конец йе селезенке и отделить его от желудка.
  4. Обрежьте обе задние конечности из, в том числе бедренной и большеберцовой костей, а также удалить все мышцы в максимально возможной степени.
    1. Нарезать мышцы вдоль задней конечности от тазовой / тазобедренного сустава до лодыжки с острым ножницами, пытаясь избежать кровеносных сосудов.
    2. Отделите заднюю конечность путем разрезания на тазовой / тазобедренного сустава и лодыжки / ног сустава без воздействия содержимого костного мозга.
    3. Чистые оставшиеся мышцы на кости, царапая с лезвием бритвы и несколько раз сокращая мышцы на совместных пунктах.
  5. Держите кости в 6 см чашку, содержащую 4 мл С10 на льду. Перейдите к рассечения следующей мыши.

3. Выделение спленоцитов

  1. Однородный селезенку осторожно плунжерный шприц с сетчатым фильтром клетки 70 мкм на верхней части тарелки, содержащей 4 мл С10, пока не красные части не видны.
  2. Добавить дополнительные 6 мл С10 в чашку через ситечко ае затем передать общую клеточную суспензию 10 мл до 15 мл коническую пробирку.
  3. Центрифуга коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
  4. После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл 1 х красных кровяных телец (эритроцитов) буфера для лизиса. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  5. После инкубации в течение центрифугировать коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
  6. После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл С10. Откажитесь от любых больших комков (мертвые клетки) и держать трубку на льду для последующего использования.
    Примечание: Если есть много мелких комков, используют клеточный фильтр 70 мкм для фильтрации суспензии клеток один раз.
  7. Подсчитайте число клеток с трипановым синим с использованием автоматического счетчика клеток.

4. костного мозга Выделение клеток

  1. Перенесите кости с С10 по 4 мл в ступке и добавить 6 мл С10, чтобы сделать объем 10 мл С10 в общей сложности.
  2. Трещина кости аккуратно в ступке с помощью арestle.
  3. Слегка помешивая с пестиком, чтобы освободить костный мозг в С10.
  4. Передача С10 по 10 мл, содержащих костный мозг в коническую пробирку емкостью 50 мл, на льду через клеточный фильтр 70 мкм. Добавьте 10 мл свежего С10 в раствор, содержащий все еще кости.
    Примечание: Пипетка раствор, содержащий костного мозга вверх и вниз несколько раз до прохождения через сито, если красные сгустки видны.
  5. Повторите шаги от 4,2 до 4,4 раза. После последней промывки, кости должны казаться белым.
  6. Центрифуга 50 мл коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С. В то же время, подготовить 5 мл готовой к использованию в градиенте плотности среды, в 15 мл коническую центрифужную пробирку при комнатной температуре.
  7. После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл С10.
  8. Медленно слой приостановку 10 мл клеток на верхней части 5 мл в градиенте плотности среды, поддерживая четкий интерфейс между двумя фазами. Затем центрифугировать 15 мл коническую трубку в 1363 г в течение 30 мин приRT (20 ° C) с множеством ускорения, как 9 и замедления, установленного в 0 (или OFF) тормоза.
  9. После центрифугирования, удалить верхний 8 мл этого раствора осторожно и собирают 2 мл поглощающее покрытие на границе раздела (слой мононуклеарных клеток) в новый 15 мл коническую трубку.
  10. Добавить 12 мл охлажденной на льду С10 в 15 мл коническую пробирку, содержащую мононуклеарных клеток костного мозга, колпачок и инвертировать несколько раз, чтобы хорошо перемешать, а затем отцентрифугировать пробирку при 800 х г в течение 10 мин, 4 ° С.

5. поверхности клеток Окрашивание для FACS

  1. Пример окрашивания
    1. Подготовка анти-мыши CD16 / 32 раствор антитела (от 1 до 100 разбавления в HBSS-полной, 5 мкг / мл, конечная концентрация).
    2. После центрифугирования в шаге 4.10, аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл раствора антител против мышиного CD16 / 32, чтобы блокировать рецептор Fc на мононуклеарных клетках. Инкубируют на льду в течение 10 мин.
    3. Приготовьте смесь флуоресцентной-конъюгированного антитела (муравейя-мышь CD11c-PE 1:40 разбавление, анти-мышь CD11b-APC-CY7 1:80 разбавление, анти-мышь PDCA-1-FITC 1:40 разбавление и анти-мышиного В220-В500 1:40 разведение в HBSS- полный, как рекомендовано производителем в количестве 100 мкл конечного объема на образец).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно титрование антител перед использованием.
    4. После 10-минутной инкубации на стадии 5.1.2, добавляют 4 мл охлажденного льдом HBSS, набитый и центрифуге при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С для удаления несвязанного против мышиного CD16 / 32.
    5. После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл смеси флуоресцентно-конъюгированных антител. Инкубируют на льду в течение 15 мин в темноте.
    6. После 15-минутной инкубации, добавляют 4 мл охлажденного льдом HBSS, набитый и центрифуге при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С для удаления несвязанных флуоресцентно-конъюгированные антитела.
    7. Приготовьте раствор загрузки FACS (500 нг / мл DAPI в HBSS-полной).
    8. После центрифугирования на этапе 5.1.6, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 ц; Л FACS загрузки раствора. Передача клеточной суспензии в 12 х 75 мм с круглым дном трубки (FACS трубки) а и не держать трубку на льду в темноте до сортировки в течение 1 часа.
  2. Окрашивание для компенсации
    1. Этикетка 6 FACS труб, как PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI или неокрашенными. Алиготе спленоцитов на 1 × 10 6 клеток / пробирку в пробирки FACS и промывают 4 мл HBSS набитый при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
      Примечание: Использование ДНК-связывающим флуоресценции красителя, DAPI, чтобы отличить живые клетки от мертвых клеток. DAPI, может проходить через плазматическую мембрану мертвых клеток (но не живые клетки), и связывают хромосомной ДНК.
    2. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл HBSS-полной.
    3. В каждой соответствующей FACS трубки, добавьте один из следующих антител: анти-мышиного CD19-PE разбавлении 1:40, анти-CD11b-мышь-АРС-CY7 1:80 разведение, анти-мышь ПВПД-1-FITC, 1:40 разбавление или анти-мышиного В220-В500 1:40 разбавления в соответствии с рекомендациями производcturer. Оставьте 5 - й (DAPI) и 6 - е (FACS) безупречной трубки , как они. Хорошо перемешать встряхиванием и инкубировать все FACS пробирки на лед в темноте в течение 15 мин.
    4. После инкубации добавляют 4 мл охлажденного на льду HBSS, набитый в каждую пробирку и центрифугировать пробирки FACS при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С.
    5. После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл охлажденного льдом HBSS-полной для гранул в трубе с надписью DAPI, который ресуспендировали в 500 мкл FACS загрузки раствора исключением. держа все 6 трубок на льду в темноте до сортировки.

6. Сортировка по Клеточный сортер

Примечание: Операция сортировки процедуры на цитометр и программного обеспечения стандартизирована с подробной инструкцией, предоставленной компанией. Если коротко, то мы используем 100 мкм сопла при 20 фунтов на квадратный дюйм, установить концентрацию клеток - мишеней между 5 - 10 миллионов на мл, и регулировать КПД до 70% или выше (то есть, конфликты держали до 30 лет%).

  1. Приготовьте сбор FACS труб с 500 мкл FBS / пробирку, содержащую 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина.
  2. Настройка параметров компенсации из ячейки сортировщик с использованием компенсации трубок одной пятен с шага 5.2.
    1. Запись 10000 клеток в неокрашенной трубе, чтобы установить отрицательную ворота для каждой интенсивности флуоресценции.
    2. Запись 10000 клеток в других трубах компенсации одного пятна, чтобы установить положительные ворота для каждой интенсивности флуоресценции.
      Примечание: Программа автоматически рассчитывает параметры компенсации.
  3. Используйте один образец с шага 5.1, чтобы установить ворота популяций отсортированных клеток путем записи 3000 клеток. Использование интенсивности флуоресценции в качестве параметров X и Y-оси графика, целевой популяции клеток ворот вручную, как группа точек, по-видимому, отделенных от других точек.
    Примечание: Этот набор стробирования является гибким и произвольно на основе требований исследователей. Если исследователи ожидают более высокой чистоты на основе одного или более маркеров, перемещать воротавыше, на основании соответствующей интенсивности флуоресценции.
  4. Загрузите пробирку для сбора и начинают сортировать популяцию клеток-мишеней.
  5. Держите пробирку для сбора на льду после сортировки, пока все пробирки с образцами не выполняются.
  6. Добавьте ледяную С10 в пробирку до 4 мл, кепке и инвертировать перемешать.
  7. Центрифуга отборная труба при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С, а затем аспирата супернатант, в результате чего около 200 мкл с помощью клеточного осадка нетронутым.
  8. Добавляют 1 мл охлажденного льдом С10 ресуспендируют осадок клеток и передать всю клеточную суспензию в 1,5 мл центрифужную пробирку.
  9. Центрифуга 1,5 мл трубки при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С и аспирата супернатант, оставляя по 100 мкл с клеточному осадку нетронутым.
  10. Храните отсортированных клеточных популяций на льду до использования.

Результаты

Мы стремились обогатить костного мозга Pdc с высокой степенью чистоты, и без влияния других типов клеток, из MRL / LPR волчанка склонными мышей обоих молодых и старости для изучения функциональных изменений Pdc относительно их способности производить IFN &. Первая стратеги?...

Обсуждение

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Раскрытие информации

The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this paper.

Благодарности

We thank Flow Cytometry Laboratory at Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine for the use of flow cytometry core facility. This work was supported by XML's startup funds. XL is a Stamps Fellow in the Biomedical and Veterinary Sciences graduate program.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetal bovine serumHyCloneSH30396.03
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutamine gibco by life technologies25030-164
Penicillin-Streptomycingibco by life technologies15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution gibco by life technologies14175-079
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer eBioscience00-4300-54
Density gradient mediumGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
anti-mouse CD19-PEBD Pharmingen553786
anti-mouse CD11c-PEeBioscience12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
anti-mouse PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
anti-mouse B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer BD Biosciences643178
BD FACS Diva version 6BD Biosciences

Ссылки

  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

117FACSPDCIFN alpha

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены