Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Resumo

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Resumo

O transportador da serotonina é um transportador de sódio e acoplado a cloreto de que "bombas" de serotonina extracelular em células. -citalopram S é um medicamento utilizado para tratar a depressão e ansiedade através da ligação ao transportador da serotonina com alta afinidade, bloqueando a recaptação de serotonina. Aqui nós relatamos um procedimento eficiente e um conjunto de ferramentas para estabilizar, expresso, purificar e cristalizar serotonina complexos transportadores de anticorpos ligados a S -citalopram e outros antidepressivos. Mutações que estabilizam o transportador da serotonina foram identificados utilizando um ensaio de ligação S -citalopram. Transportador de serotonina expressa em baculovírus transduzidas HEK293S GnTI ^- células, foi reconstituída em proteolipossomas e utilizados para produzir anticorpos de elevada afinidade. Nós desenvolvemos uma estratégia para descobrir anticorpos que são úteis para estudos estruturais. Uma abordagem simples para a expressão de fragmentos de anticorpo em células Sf9 também foi estabelecida.Complexos transportadores-anticorpo purificado usando este procedimento são bem-comportado e prontamente cristalizar, produzindo complexos com S -citalopram que difractam raios-X para 3-4 Å de resolução. As estratégias desenvolvidas aqui pode ser utilizado para determinar a estrutura de outras proteínas da membrana desafiantes.

Introdução

O transportador de serotonina (SERT) é uma proteína da membrana integral, que facilita o transporte de serotonina através das membranas celulares ^1. SERT pertence a uma família de Neurotransmissor SIMPORTADORES sódio (NSS), que também inclui a dopamina e norepinefrina transportadores ^2. SERT é o alvo molecular de medicamentos antidepressivos e anti-ansiedade amplamente prescritos que agem para inibir competitivamente o transporte da serotonina ^3. SERT explora o co-transporte energeticamente favorável de sódio para remover o neurotransmissor da fenda sináptica. Caracterização extensiva do sistema serotonérgico tem mostrado que mudanças no metabolismo da serotonina parecem influenciar praticamente todos os processos neurológicos, incluindo humor, sono, dor, cognição e agressão comportamentos ^4. SERT função pode ser modificado através da utilização de antidepressivos e de recaptação da serotonina (SSRIs) -citalopram como S, bem como por psychostimulants e drogas de vício tais como anfetaminas e -methylamphetamine N 3,4-metilenodioxi ou "ecstasy" ^1,2.

ISRSs são extremamente importante para o tratamento de transtornos de humor, no entanto, a base estrutural para a sua acção preciso não é bem compreendido. WT SERT é instável em micelas de detergentes, impedindo assim o progresso no sentido de uma estrutura tridimensional (3D) de SERT ^5,6. Recentemente, desenvolvemos variantes de SERT que são robustamente estável em uma ampla gama de detergentes e reter SSRI actividade ⁶ vinculativo. Estas variantes SERT termoestáveis ​​foram seleccionados usando um ensaio de estabilidade térmica à base de proximidade de cintilação. Aqui, descrevemos um procedimento para a geração de anticorpos de elevada afinidade que se podem ligar SERT, e a purificação e cristalização de SERT termoestável, em complexo com o anticorpo e S -citalopram.

Este protocolo assume que a SERT e 8B6 genes têm sido bem sucedidaY clonado nos vectores BacMam ⁷ e insectos de expressão, respectivamente. Para gerar anticorpos, de ADNc que codificam os resíduos 73-616 de WT SERT foi clonado no vector BacMam com um Strep II etiqueta C-terminal (SERT _IC). Para a tela de estabilidade térmica, foi usado resíduos SERT 73-616 com GFP C-terminal, Strep II e 10-his _(TC SERT). Mutações pontuais individuais foram gerados no fundo SERT _TC. Para o protocolo de cristalização, a proteína de fusão SERT-GFP foi usado com Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) ₂ GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys], e 10-his, transportando os mutantes termoestáveis, Y110A, I291A, e T439S e mutações de cisteínas superfície C554A, C580A , e C622A _(CC SERT). Sequências de clivagem de trombina (LVPRGS) também foram inseridos no _CC SERT após Q76 e T618 para permitir a remoção do N- e C-terminais. O plasmídeo que codifica para o Fab de 8B6 foi manipulada para expressar tanto o pesada e levecadeias do anticorpo com sequências de secreção de gp67 sob o controlo de dois promotores poliedrina separados. O C-terminal da cadeia pesada do anticorpo 8B6 foi marcado com um 8-His e um local de clivagem de trombina foi inserido entre a cadeia pesada e a etiqueta.

Protocolo

1. A transfecção de Aderente HEK293S GnTI ^- Pilhas para a tela termoestabilidade

1. Prepare poli-D-lisina (PDL) -Revestido placas de 96 poços. Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar estéril.
   1. Filtrar uma solução de 25 ug / mL de (PDL), o peso molecular 70,000-150,000 Da, utilizando um filtro estéril de 0,2 | im. Adicionar 50 uL de PDL para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (TC), assegurando o fundo é revestido uniformemente, e incubar à TA durante 30 min.
   2. Aspirar PDL solução e lava-se com 200 mL de água estéril.
   3. Permitir que a placa secar ao ar durante 2 h antes do armazenamento a 4 ° C. PDL placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.
2. A tripsinização de células aderentes HEK293S.
   1. Cresça HEK293S a 80% de confluência numa placa de 10 centímetros mantida a 37 ° C com 8% de CO _2. Uma única placa de 10 cm devem ter, aproximadamente 10 milhões de células HEK293S. Não utilize células após 30 passagens!
   2. meios Aspirar e lava-se com 5 mL de soluto salino tamponado com fosfato (PBS). Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02%) para as células e incuba-se durante 2 min a 37 ° C.
   3. Adicionar 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e ressuspender as células por pipetagens repetidas cima e para baixo com uma pipeta serológica.
   4. Pipetar 10 ul de células e misturar-se com 10 uL de azul Tripano solução (0,4%). Determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro e um microscópio de luz. Não conte as células que estão manchadas azul como eles estão mortos. Assegure-se que a viabilidade das células é superior a 90%.
3. Completamente ressuspender tripsinizadas HEK293S GnTI ^- células em DMEM suplementado com FBS a 10% a uma densidade de 0,5 X 10 ⁶ células / ml num reservatório pipeta descartável. Cerca de 5 milhões de células HEK293S serão necessários para cada placa. Um total de 24 construções podem ser transfectadas em cada placa utilizando este protocol.
4. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adiciona-se 100 uL de células para cada poço de uma placa revestida PDL. Ressuspender as células no reservatório de pipeta depois de encher cada placa para assegurar uma distribuição uniforme de células. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C com 8% de CO _2. Após 24 h, as células devem atingir cerca de 80% de confluência.
5. 1 h antes da transfecção substituir a mídia. Preparar complexos de reagente de transfecção de ADN para transfecção.
   1. Para cada construção no fundo SERT _TC a ser peneirado, mistura de 450 ng de ADN com 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se. Adicionar 1,6 mL do reagente de transfecção de 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se.
   2. Imediatamente adicionar solução de reagente de transfecção diluída a solução de ADN e misturar. Não misture soluções na ordem inversa. Esperar 10 - 15 min e adicionar 20? L de mistura de reagente / transfecção de ADN a 4 poços.
6. Uma vez que todos os poços foram transfectadas, misture placa por balançando suavemente de volta umND adiante e retornar à temperatura de 37 ° C incubadora.
7. Depois de 16 - 24 h substituí meios com DMEM contendo soro e butirato de sódio 10 mM.
8. Aproximadamente 48 h após a transfecção remover a mídia e quer prosseguir imediatamente com thermostability tela ou congelar as células a -80 ° C para ser usado mais tarde. As células podem ser armazenadas a -80 ° C durante várias semanas.

Tela de termoestabilidade com base em 2. Proximidade de Cintilação com S -citalopram

1. Incubar as células com 200 nM S -citalopram em 25 mL de TBS (Tris-Soro Fisiológico Tamponado com - Tris a 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) durante 5 min à TA.
2. Solubiliza-se as células por adição de 25 uL de mM de N-dodecil-β-D-maltopiranósido 8 (C12M), colesterilo hemmisuccinate 1 mM (CHS), cocktail inibidor de protease (fenilmetanossulfonil fluoreto de 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml de aprotinina, 4 g / mL de pepstatina a, e 4 ug / ml de leupeptina) em TBS, e incubação durante 1 h à TA.
3. Adicionar 50 ul de TBS with 20 nM de ^[3H] citalopram (81,7 Ci / mmole), 0,1% de albumina de soro de bovino, e 2 mg / mL de His-tag de afinidade de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) para grânulos de três poços para cada constructo. Para o último poço adicionar a mesma solução listada, mas complementar com 100 sertralina? M para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as contas His-tag de afinidade SPA são misturados ao adicionar a placa de 96 poços.
4. Medir ^[3 H] citalopram de ligação usando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente com um tempo de contagem de 1 min por po. Continue placas de contagem até que as contagens totais planalto (aproximadamente após 36 h).
5. placas de calor durante 15 min num bloco de aquecimento com uma tampa aquecida a 33 ° C. Medir a ligação ^{de [3H]} citalopram novamente após o aquecimento, tal como descrito em 2.4.
6. Repetir o passo 2,4-2,5 e alterar o passo de aquecimento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Ajuste as temperaturas de aquecimento, dependendo da temperatura aparente de fusão (Tm)da proteína alvo e a termoestabilidade da construção mais estável. Continuar a aquecer as placas até que todas as construções têm baixas contagens específicas.
7. Analisar os dados para determinar os valores de Tm.
   1. Determinar as contagens totais médias por minuto (cpm) de cada construção de poços que não contêm sertralina através da média das 3 réplicas de poços. Determinar o CPM não específica pela média das CPM de cada poço contendo sertralina numa única placa.
   2. Calcular CPM específica subtraindo a CPM não específica do CPM total.
   3. Calcular a Tm por um ajuste não linear para uma função sigmoidal de Boltzmann. Construções com baixo CPM específica à temperatura ambiente (<10% do WT) geralmente não têm valores precisos Tm. Mutações do mais construções termoestáveis ​​podem ser combinadas e rastreados para aumentos aditivos em thermostability.

3. A expressão do transportador da serotonina humana em HEK293S GnTI ^{- Células}

1. Transformar células competentes DH10Bac quimicamente com 1 ng de plasmídeo.
   1. Adicionar plasmídeo a 50 ul de células DH10Bac e incubar em gelo durante 30 min.
   2. células DH10Bac choque térmico a 42 ° C durante 30 seg. Adicionar 200 ul de meio SOC e incubar a 37 ° C durante 4 h, com agitação.
   3. Placa de todas as bactérias para uma placa de caldo de Luria (LB) contendo 50 ug / ml de canamicina, 7 pg / ml de gentamicina, 10 ug / ml de tetraciclina, 100 ug / ml de 5-bromo-3-indolil β-D-galactopiranósido, e 40 ug / ml de β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) isopropilo.
2. Isolar lacZ ^- colónias brancas (colónias) produzidas a 37 ° C durante 2 d em placas de LB-agar.
3. Cresça várias colónias O / N a 37 ° C em 5 mL de LB contendo antibióticos e isolar o ADN de bacmid.
   1. Spin down bactérias a 1.000 xg numa centrífuga durante 5 min. sobrenadante de descarte. Ressuspender as bactérias com 200 ul de r minipreptampão esuspension.
   2. Lisar as bactérias por adição de 200 uL de tampão de miniprep de lise e invertendo o tubo suavemente 10 vezes. Adicionar 200 ul de tampão de neutralização.
   3. Remover fracção insolúvel por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min numa centrífuga. Adicionar 1 mL de isopropanol frio para o sobrenadante e à temperatura de -20 ° C durante 20 minutos para precipitar o ADN.
   4. Girar a 14.000 xg durante 15 min numa centrífuga e descartar o sobrenadante.
   5. Lave o peletizado de ADN com 70% de EtOH e girar novamente a 14000 xg durante 15 min. sobrenadante de descarte. Ar ADN seco até que todos EtOH foi evaporado e ressuspender em 50 mL de água.
      NOTA: ADN bacmid deve ser transfectado em células Sf9 imediatamente para obter os melhores resultados, mas podem também ser armazenados a -20 ° C durante várias semanas.
4. Transfectar ADN bacmid em 1x10 ⁶ células de Sf9 aderentes cultivadas numa câmara humidificada a 27 ° C num prato de 6 poços. Executar todas as manipulações de cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril.
   1. Remova a mídia a partir de células e adicionar 2 mL de meio Sf 9 frescos. Adicionam-se 5 ug de ADN bacmeo de 100 uL de meios de Sf9 (solução A).
   2. Adicionar 8 mL de um reagente de transfecção catiónico Sf9-lípido para 100 ul de meios de Sf9 (Solução B). Incubar tubo contendo solução B durante 5 min.
   3. Misture tubo contendo solução A com a solução B e incubar à TA durante 30 min e adicionar toda a solução para as células Sf9.
   4. Após 96 h, o sobrenadante da colheita (vírus P1) por passagem através de um filtro de 0,2 um. O vírus P1 podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C no escuro e reutilizado para fazer vírus P2, conforme necessário.
5. Adicionar 100 uL de vírus P1 a 1 L de células Sf9, a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células / ml em meios Sf9. Infectar as células durante 96 h, a crescer a 27 ° C num agitador a 100 rpm.
6. Girar as células numa centrífuga a 4000 xg durante 15 min e o sobrenadante contendo partículas virais filtro através de um filtro de 0,2 um. Descartar sedimento celular. determdensidade viral ine utilizando um ensaio de placa virai ou um contador de vírus. A densidade de partículas de vírus deve ser> 1 x 10 ⁸ de vírus por mililitro. vírus P2 pode ser armazenado a 4 ° C no escuro e utilizada para vários meses.
7. Infect 10 L de HEK293S GnTI ^- células ⁷ que crescem em suspensão, a 37 ° C com CO ₂ e 85% de humidade 8% num agitador a 130 rpm, em 293 meios de expressão suplementado com 2% de FBS a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 e uma densidade de 3 X 10 ⁶ células / ml, tipicamente 30 - 50 ml de vírus P2 por 800 ml de células num frasco de 2 L confundido.
   NOTA: não é recomendado o uso de mais do que 80 ml de vírus P2 desde o HEK293S GnTI ^- células vão crescer lentamente e pode tornar-se inviável devido a uma alteração no pH. media Sf9 é mais ácida do que a mídia 293 expressão.
8. 12 - 16 h pós-infecção, adicionar butirato de sódio para uma concentração de 10 mM a partir de um estoque 1 M. 48 - 60 h pós-infecção, as células por centrifugação a colheita4000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante.
9. Ressuspender as células em 150 ml de TBS, 2 uM S -citalopram ou outros inibidores da SERT e armazenar a -80 ° C até estar pronta para purificação.

4. A purificação por afinidade do transportador de serotonina para Imunização e cristalização

1. Descongelar as células a partir de 10 L de cultura em água quente (aproximadamente 30 ° C) e ressuspender fazendo passar rapidamente através de uma pipeta de 10 mL, até ficar homogénea.
2. Preparar a solução de detergente para a solubilização (150 mL): 80 mM Tris, pH 8, NaCl 150 mM contendo 40 mM de C12M, CHS 5 mM, e cocktail inibidor de protease.
3. Adicionar todas as células para uma proveta com uma barra de agitação e adicionar toda a solução de detergente para as células, enquanto se agitava. Solubiliza-se a 4 ° C durante 1 h com agitação.
4. Girar lisado a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar pelete e o sobrenadante decantado para tubos de ultracentrífuga limpas. Girar a 100.000 xg durante 1 h em uma ultracentrifuge. Descartar o sobrenadante e sedimento do filtro através de um filtro de 0,2 um.
5. Passa lisado sobre resina de afinidade com 10 mL de Strep empacotada numa coluna utilizando uma bomba peristáltica, equilibrada em tampão de lavagem: C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, glicerol a 5%, 25 fiM de lípido (1-palmitoil-2-sn-glicero-oleoyl- 3-fosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina, e 1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoglicerol numa razão molar de 1: 1: 1), e 1 S ^ M -citalopram ou SSRI em TBS.
6. Conectar Strep coluna de afinidade a um sistema de Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida (FPLC) e lavagem da coluna a 2 mL / min com 66 mL (6,6 volumes de coluna) de tampão de lavagem. Eluir a proteína purificada no mesmo tampão suplementado com 5 mM de destiobiotina em 0.5 ml / min, utilizando 33 mL (3,3 volumes de coluna) de tampão. Recolher fracções de 1 ml; as fracções de pico será ~ 10 mL. A proteína purificada pode ser armazenada a 4 ° C durante 2-3 d se desejado.
   NOTA: O rendimento total será de 3 -4 mg de SERT _CC e 1 mg de SERT _IC. Uma absorvância de 2 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL de SERT.

5. Transportador de reconstituição em lipossomas para imunização

1. Preparar lipossomas contendo asolectin: colesterol: lípido A: cérebro de lípidos polares (razão molar 60: 17: 3: 20). Dissolve-se os lípidos em 1 mL de clorofórmio e adicionar 40 mg de lípido total de 100 ml de vidro frasco de fundo redondo à razão molar indicada.
   1. Evapora-se o clorofórmio, durante pelo menos 1 h sob vácuo com o balão de fundo redondo de rotação em água quente, a cerca de 30 ° C.
   2. Reidratar lípidos pela adição de 10 mL de TBS. Incubar em tampão durante 10 minutos.
   3. Congelar o lípido, colocando o frasco em _N2 líquido.
   4. Descongelamento. Imergir fundo esférico do frasco num copo cheio com água quente, a cerca de 30 ° C. Sonicar num sonicador de banho durante 5 min.
   5. Vortex e repita os passos 5.1.3 - 5.1.4 10 vezes ou até que a lipídicoé completamente ressuspenso a partir do fundo e forma uma suspensão turva.
   6. Extrusão da mistura de lípidos toda duas vezes através de filtros 200 nm. O lípido irá aparecer como uma suspensão leitosa antes da extrusão; depois ele irá ser translúcido. Não adicione a mistura de lípidos inteiro para a extrusora de uma só vez, pois ele pode ficar obstruídos, resultando em perda de amostra.
   7. Lípidos girar a 100.000 xg durante 20 min e ressuspender em 0,5-1 ml de TBS com uma concentração de 40 mg / mL.
2. Concentrado purificado SERT _IC 250 - 500 mL utilizando um concentrador de proteína de 100 kDa MWCO centrífuga para 2-4 mg / mL e saturar com lipossomas C12M 5 mM. Adicionar SERT purificada para o detergente: mistura de lípidos em 1 ml de volume final.
3. Remover C12M 3 por adições sucessivas de 80 mg / ml de resina hidrofóbica de absorção. Durante os primeiros 2 adições, incubar com resina com rotação durante 2 h a 4 ° C. Remover a resina por passagem através de lã de vidro. Realizar a incubação final com resinadurante a noite.
4. Concentrar proteolipossomas por centrifugação a 100000 xg durante 20 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 250-500 ul de TBS.
5. Adiciona-se 10 uM de concentração final -citalopram S à proteína reconstituída a seguir à remoção final da resina.
6. Solubiliza-se 2,5 ul da proteolipossomas em tampão de SDS-PAGE de carga (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 0,01% de azul de bromofenol, DTT 100 mM) e corrido num gel de SDS-PAGE a 200 V durante 1 h para assegurar que a SERT foi reconstituída com sucesso. Proteolipossomas pode ser armazenado a -80 ° C em alíquotas para armazenamento a longo prazo e descongelado em gelo antes de cada imunização.

6. Rastreio de anticorpos que reconhecem epitopos 3D

1. linhas celulares de hibridoma da tela por Western Blot. Os anticorpos que reconhecem SERT por western blot provavelmente se ligam epítopos lineares e provavelmente não serão úteis para estudos estruturais.
   1. Misturar 1 ug de purifiEd SERT _IC ou _CC SERT e executado em um 4 - em gel de SDS-PAGE a 15% a 200 V durante 1 h.
   2. Transfira para uma membrana de nitrocelulose a 200 mA durante 30 minutos usando tampão Towbin (25 mM de Tris, 192 mM glicina, 20% (v / v) de metanol, 0,1% de SDS). A membrana pode ser seco e armazenado indefinidamente à temperatura ambiente.
   3. re-humedecimento da membrana com 10% de metanol, e lava-se com PBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).
   4. Bloco com 5% de leite em pó em PBS durante 30 min à TA.
   5. Lavar com PBS e incuba-se com 1 ug / ml de anticorpo em PBS com leite a 0,1%.
   6. Lavar exaustivamente com PBS contendo 0,1% de Tween-20.
   7. Incubar com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com um corante IV diluída 1: 10000 em PBS com 0,1% de Tween 20 e 0,1% de leite.
   8. Lavar extensivamente e digitalizar utilizando um sistema de imagem.
2. Misture sobrenadante de hibridoma contendo anticorpos negativos ocidentais com 100 nM de proteína SERT _CC utilizando uma razão molar de 1: 2 (SERT: mAb) em 200 uL de TBS com C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, e 1 ^ M S -citalopram. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Analisar o sobrenadante contendo os complexos SERT-mAb e analisar por detecção de fluorescência Cromatografia de Exclusão de Tamanho (FSEC) ^8. Descartar o sedimento.
   1. Executar 100 ul de sobrenadante numa coluna de exclusão por tamanho em 0.5 ml / min, utilizando um sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) equipado com um detector de fluorescência (excitação: 480 nm, Emissão: 510 nm) utilizando um tampão de corrida contendo TBS, 0,4 mM lauril neopentilglicol maltose, e 1 uM S -citalopram. Os anticorpos que formam complexos fará com que a proteína de fusão GFP-a eluir mais cedo do que o transportador livre a partir da coluna de exclusão de tamanho.
   2. Dilui-se a complexos de 10, 1, 0,1 nM em 200 uL de TBS com C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, e 1 ^ M S -citalopram e de reprise FSEC. Os anticorpos que ainda pode deslocar o pico transportador em baixas concentrações nanomolares sãoligantes de alta afinidade e bons candidatos para estudos estruturais.
3. Retestar ligação por FSEC na presença de serotonina 1 mM. Anticorpos que reconhecem especificamente a conformação SSRI ligado não irá ligar-se na presença do substrato. Os anticorpos que reconhecem um epitopo em 3D que não se altera como resultado de conformação irão ligar-se independentemente do ligando presente.
4. Misturar diferentes combinações de pares de anticorpos e testar a ligação por FSEC. Os anticorpos que reconhecem epítopos distintos vai causar SERT para eluir antes, quando combinados em conjunto em comparação com a ligação de um único anticorpo.
5. Para estudos estruturais iniciais, selecione os anticorpos de afinidade mais elevados que reconhecem epítopos 3D.

7. Expressão de um fragmento de anticorpo em células Sf9

1. domínios variáveis ​​e constantes clone Fab por PCR no sistema de expressão de insecto para a expressão em células Sf9 usando protocolos padrão.
2. Transfectar 1 x 10 ⁶ células Sf9 com 5 ug de ADN bacmeo que codificam as cadeias leves e pesadas do Fab 8B6 8-His, com uma sequência de secreção de GP67 (conforme a secção 3.4).
3. Colheita P1 vírus 96 h após transfecção e adicionar 500 mL de vírus de P1 a 1 L de células Sf9, a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células / ml em um balão de 2 L para fazer vírus P2. Infectar as células durante 96 h a 27 ° C.
4. Colheita vírus P2 (conforme a secção 3.6).
5. Infect 6 L de células Sf9, a uma densidade de 2-3 x 10 ⁶ células / ml com uma MOI de 2 com vírus P2, tipicamente 40 - 50 ml por frasco com 1 L de células Sf9 em cada balão de 2 L.
6. Células colheita aproximadamente 96 h após a infecção. Adicionar 50 ml de tampão de fosfato, pH 8, numa concentração final de 50 mM para as células e centrifugação a 4000 xg durante 20 min. Desprezar o pelete de células e o sobrenadante do filtro através de uma célula de fluxo tangencial de 0,2 um filtro. Recolher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C durante 2 - 3 dias, se desejado.

8. A purificação do anticorpo Os fragmentos de Sf9 sobrenadante

1. Concentre Sf9 sobrenadante usando um 30 kDa de peso molecular Cut Off (MWCO) de célula de fluxo tangencial para cerca de 400-800 mL.
2. Adicionar imidazole, pH 8 a uma concentração final de 10 mM e 10 ml de resina de afinidade de His-tag. Agita-se numa proveta de 1 h a 4 ° C.
3. Recolhe His resina de afinidade por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. sobrenadante de descarte.
4. Pacote de resina de afinidade His-tag em uma coluna e se conectar a um FPLC.
5. Lava-His-tag de afinidade em resina de 2 ml / min com 66 mL (6,6 volumes de coluna) de fosfato 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 25 mM.
6. Eluir 8B6 Fab em 33 mL de 50 mM de fosfato de pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 250 mM. Recolher fracções de 1 ml.
7. Diluir Fab purificado por afinidade com um volume de 10 vezes de acetato 20 mM gelado, pH 5.
8. Fab se ligam a uma coluna de 1 ml de permuta catiónica, utilizando uma bomba peristáltica a 1 mL / min.
9. Fab separada usando um mL lin 30gradiente de NaCl de orelha (0-500 mM) em 20 mM de acetato, pH 5,5 utilizando um FPLC. Fab irá eluir como um único pico a ~ NaCl 300 mM.
10. Analisar num gel de SDS-PAGE a 12,5%, utilizando tampão de amostra contendo DTT 100 mM. As cadeias pesada e leve de 8B6 do Fab será executado a 27 e 25 kDa, respectivamente, sobre um gel de SDS-PAGE redutor.
11. Piscina fracções contendo Fab e concentra-se para, pelo menos, 10 - 15 mg / ml usando um concentrador kDa MWCO de proteína numa centrífuga de 30 basculante a 3.000 x g.
12. Ajustar a pH 8 por adição de Tris 1 M pH 8 para uma concentração final de 50 mM e armazenamento de Fab purificado por longo prazo, a 4 ° C. O rendimento total será de 25 - 30 mg. Uma absorvância de 1,4 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL de Fab 8B6.

9. A formação de complexos transportadores-anticorpo e separação por cromatografia de exclusão de tamanho

1. Para cristalização, purificar o _CC SERT por cromatografia de afinidade Strep em C12M como descrito anteriormente (secção 4).
2. Digest com trombina para remover as etiquetas (1: 100 w / w) e EndoH (1:10 w / w) O / N à temperatura ambiente. Concentra-se para 250-300 uL utilizando uma kDa MWCO de proteína concentrador de centrífuga de 100 a uma concentração de proteína de 10 mg / mL.
3. Misture SERT concentrado com Fab a uma razão molar de 1: 1,2, num volume inferior a 500 uL. Centrifuga-se a 100.000 x g a 4 ° C durante 20 min. Recolher o sobrenadante contendo o complexo de SERT-Fab. pellet de descarte.
4. Separado por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) usando um FPLC numa coluna de exclusão de tamanho equilibrada em TBS suplementado com 40 mM de N-octil-β-D-maltósido (C8M), CHS 0,5 mM, glicerol a 5%, 25 fiM de lípido (o mesmo que no passo 4.5), e 1 uM S -citalopram a 0,5 mL / min.
5. Recolha 0,5 frações mL e analisar em 4-15% de gel SDS-PAGE, bem como por fluorescência de triptofano pela SEC. GFP com etiquetas SERT será executado em cerca de 80 kDa num gel de SDS-PAGE. Após a remoção dos terminais e açúcares ligados a N que será executado como uma proteína de 45 kDa.
6. Determine quais as fracções a combinar juntando apenas as fracções que são monodispersas, tal como avaliado por análise das fracções por fluorescência de triptofano SEC (excitação: 280, Emissão: 335 nm).
7. Loja purificado complexo SERT-8B6 a 4 ° C por até 1 semana.

10. A cristalização de complexos transportadores-anticorpo por enforcamento Gota

1. Antes da cristalização, concentrar as fracções do pico a partir da separação do complexo SEC do SERT-8B6 a 2 mg / ml usando um concentrador kDa MWCO de proteína centrífuga 100. Uma absorvância de 2 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL.
2. Adicionar Fab adicional a uma razão de 1: 0,05 complexo: Fab livre. Adicionar 10 mM livre S -citalopram.
3. Centrifuga-se a 100.000 x g a 4 ° C durante 20 min. Recolher o sobrenadante contendo o complexo SERT-Fab. pellet de descarte.
4. Configurar um ecrã de 24 poços gota suspensa a 4 ° C de acordo com a Tabela 1. Crescer cristais de qualidade de difração em relação às soluções de reservatóriocontendo Tris 100 mM-NaOH, pH 8,5, 25 - de KCl 125 mM, 32,5 - 34% de PEG 400 e 0,5% de ácido 6-amino-hexanóico.
   NOTA: O uso de Tris ajustado com NaOH para um pH de 8,5 como tampão. Não use base Tris ajustado com HCl. A tela pode ser preparado de 2 mL e tubos utilizados até terminar. Tome cuidado para pipetar com precisão PEG 400, utilizando uma pipeta de deslocamento positivo, pois é extremamente viscosa!
   1. Pipetar 500 L de cada solução de reservatório num baixo perfil placa de 24 poços com selante aplicado a cada poço. Pipeta de 1,5, 1,75 e 2 mL do complexo SERT-8B6 para um 18 milímetros lamela de vidro siliconizada. Pipete 1 mL de solução reservatório no topo da amostra de proteína.
      NOTA: A placa foi comprado com selante já aplicada à borda dos poços.
   2. Aplicar a cobertura deslizante para a de 24 poços com as gotas de frente para a solução de reservatório e selar imediatamente pressionando tampa de deslizamento para selante pré-aplicado a cada poço.
   3. Continue até que todos os 24 poços foram criadas.
   4. Deixe a placa acabada em um quarto bem isolado a 4 ° C. Não perturbe placas durante pelo menos 3 dias
      NOTA: Monocristais aparecerão dentro de aproximadamente 3 dias e crescer para 100-175 mm após 14 dias.
5. Cristais da colheita no cryoloops e directamente pisca-legal no _N2 líquido antes de raios-X de coleta de dados de difração.
6. Se necessário, encontrar condições de cristalização adicionais por triagem ampla com gotas de suspensão. Utilizar três gotas com proteína: precipitantes proporções de 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Se um robô está disponível, em seguida, ajustado até 100-150 nL gotas mais de 70 ul de solução de reserva numa placa de 96 poços. Cristais maiores 3D podem ser cultivadas em 24 poços.
7. Pontuação baseada na aparência da queda: 0, claro; 1, poeira; 2, precipitado granular; 3, a separação de fases; 4, microcristalina; 5, agulhas; 6, as placas; 7, cristais 3D.
8. Configurar a cristalização por enforcamento métodos gota em 24 poços como descrito acima em torno cond recém-identificadoitions.

Resultados

Uma biblioteca de mutantes de um único ponto no fundo SERT _TC foi criado para a tela para thermostabilizing mutações. mutantes individuais foram geradas utilizando a mutagénese padrão. O protocolo de selecção utiliza células HEK293S e uma tela de termoestabilidade com base em proximidade de cintilação transientemente transfectada para rapidamente identidade mutações úteis para a cristalização, conforme descrito na Figura 1A. Valores Trama Tm contra ligado ^{de [3H]} citalopram à TA revela construções com elevada termoestabilidade e de expressão de níveis adequados para a purificação de proteínas (Figura 1B). Três mutantes (Y110A, I291A, e T439S) foram combinadas para gerar uma construção altamente estável (Figura 1C). A termoestabilidade está também correlacionada com o aumento da estabilidade em detergentes de cadeia curta necessárias para a cristalização do complexo Fab-SERT.

A expressão em larga escala de SERT humano utilizando baculovírus-transduced HEK293S GnTI ^- células pode levar menos de 2 semanas e podem produzir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 2A. Utilização da proteína SERT _CC GFP permite a SERT ser convenientemente seguido durante a expressão e a purificação por fluorescência (Figura 2B). A nossa estratégia de purificação envolveu 1) solubilização de SERT ligado a S -citalopram a partir de GnTI HEK293S ^- células em C12M na presença de CHS como um lípido de estabilização; 2) ligação do SERT a uma matriz de afinidade Strep; 3) a remoção de proteínas contaminantes por lavagem exaustiva; e 4) eluição da SERT funcional com tampão contendo destiobiotina (Figura 2C). A proteína eluída é em grande parte isenta de outras proteínas detectáveis por coloração com azul de Coomassie e monodisperso como julgado por FSEC (Figura 2D, E).

Uma estratégia semelhante foi feita para purificar SERT com uma etiqueta Strep II que foi usada para reconstitution e imunização (Figura 3A, B). Incorporação de SERT em proteolipossomas aumenta a meia-vida no soro e a estabilidade da SERT e aumenta a probabilidade de isolamento de anticorpos de elevada afinidade. Além disso, a inclusão de lípido A, um componente da parede celular bacteriana, serve como um potente adjuvante ^9. Os lipossomas multilamelares foram preparados pela adição de tampão para uma mistura de lípidos secos em tubos de vidro e ressuspensas em tampão. A extrusão de lipossomas através de filtros de tamanho de poro de 200 nm produz monodispersas suspensões lipossómicas unilamelares. Os lipossomas são, em seguida, saturado com um detergente, seguida pela adição de SERT purificada em detergente. Finalmente, o detergente é removido por adição de resina hidrofóbica de absorção para o lípido: mistura detergente. ligando adicional deve ser adicionado à amostra reconstituída para seleccionar anticorpos que reconhecem a conformação ligada antidepressivo. A presença de SERT nas proteolipossomos deve ser confirmado porsolubilização de uma pequena amostra com tintura SDS-PAGE carga ou C12M e em execução no SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D).

linhas celulares de hibridoma que expressam anticorpos SERT pode ser rastreada para ligantes de afinidade elevada que reconhecem epítopos em 3D. Estas propriedades são cruciais para o eventual sucesso de cristalização, como o anticorpo deve manter-se firmemente ligada a uma região estruturada para promover empacotamento cristalino de homogéneos, domínios bem ordenadas. No primeiro passo, os anticorpos que reconhecem regiões não estruturados são identificados. SERT é desnaturado e transferido para uma membrana de nitrocelulose; anticorpos que se ligam SERT desnaturado será ocidental-positiva e provavelmente reconhecem epítopos lineares. Na Figura 4A, que mostram exemplos de 2 anticorpos que são ocidental-positiva e, provavelmente, não é útil para promover crystallogenesis. Na Figura 4B, os restantes anticorpos ocidental-negativos são incubadas com 100 nM de SERT-GFP e separados porFSEC. Os anticorpos que se ligam SERT irá deslocar o pico de GFP-positiva para uma posição anterior. Os complexos SERT-anticorpo pode ser diluída adicionalmente em detergente para determinar se eles podem ligar-se com afinidade nanomolar, seguido de análise por FSEC. A adição de resultados de serotonina em alterações conformacionais no transportador e, portanto, os anticorpos podem ser novamente pesquisadas para determinar se são capazes de reconhecer especificamente a conformação SSRI-ligado. Na Figura 4C, os anticorpos são mostrados para ligar SERT na presença de serotonina, que mostra que o epitopo (s) não mudam do SSRI ao substrato estado ligado. Finalmente, na Figura 4D combinações de anticorpos são testados quanto à sua capacidade para se ligar epitopos distintos, o que resulta em mais um desvio para a esquerda. Aqui, o 15B8 ou 8A11 anticorpos reconhecem um epitopo que é diferente do 8B6.

O anticorpo 8B6 foi escolhido para posterior análise estrutural com base na triagem de cristal preliminar com trea papaínated Fab. Os genes de 8B6 do Fab foram clonados num vector de expressão de células de insecto. Fab podem ser expressas e segregadas a partir de células Sf9 em crescimento em suspensão. O 8B6 Fab pode ser purificado a partir do sobrenadante de células Sf9 por His-tag de afinidade (Figura 5A, B) e cromatografia de permuta catiónica (Figura 5C, D) resultando em proteína que aparece livre de contaminantes em geles de SDS-PAGE. Na Figura 5E, o recombinante 8B6 Fab é mostrado ligar SERT e é usado em experiências bioquímicas e biofísicas subsequentes.

A afinidade purificado SERT _CC é digerida com trombina e a EndoH e misturado com 8B6 Fab de modo a formar um complexo na presença de S -citalopram. O complexo transportador-anticorpo é então separado por SEC em C8M (Figura 6A) e as fracções de pico conter tanto SERT e Fab como mostrado por SDS-PAGE (Figura 6B). Uso de C8M é crucial para a formação de cristais, provavelmente porqueo detergente de cadeia curta permite uma melhor embalagem entre as moléculas na rede cristalina. FSEC é empregada para determinar quais as fracções devem ser recolhidas para cristalização (Figura 6C); As fracções que não são monodispersas e / ou contêm grandes quantidades de SERT livre ou Fab não devem ser combinados.

Prisma cristais SERT-anticorpo em forma podem ser cultivadas na presença de S -citalopram usando este protocolo por enforcamento difusão de vapor de queda (Figura 7A). Os cristais resultantes difratar raios-X para uma resolução de 3,15 Å ¹⁰ (Figura 7B).

Figura 1: proximidade de cintilação à base de termoestabilidade Ensaio A.. Visão geral do protocolo para o rastreio de termoestabilidade na presença de ^[3H] citalopram. B. Máxima ligado ^[3 H] citalopram versus a temperatura de fusão aparente (Tm). As linhas pontilhadas representam os valores para o transportador WT. Os 3 mutantes mais termoestáveis ​​são rotulados. Área cinzenta representa mutantes que têm menos de 10% de ^[3H] citalopram em relação ao WT e valores de Tm de ligação, portanto, imprecisas devido a uma baixa relação sinal-ruído. C. Curvas termoestabilidade para WT SERT _TC e os 3 primeiros mutantes. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão de mamíferos heterólogos Protein Expression A.. Visão geral esquematizado de geração de vírus BacMam e expressão de SERT em HEK293S GnTI ^-. Células B. ELEK293S GnTI ^- células que expressam o _CC SERT (fluorescência da GFP) C.. Perfil de eluição de _CC SERT em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Análise de afinidade purificado _CC SERT numa 4 - gel de 15% SDS-PAGE E.. FSEC de afinidade _CC SERT purificada detectado pelo GFP fluorescência (excitação: 480 nm; emissão: 510 nm). O pico de eluição de 15 mL é SERT (#) e 18 mL é GFP livre (*). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Representante Affinity Purificação e Reconstituição da SERT _IC A.. Visão esquemática da geração de anticorpos. B. Perfil de eluição observado a 280 nm de a purificação por afinidade de SERT _IC em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Análise de afinidade purificados e reconstituídos num SERT 4 - gel de 15% SDS-PAGE D.. FSEC de SERT solubilizado após a reconstituição. A fluorescência dos resíduos de triptofano foi usado para detectar SERT (Excitação: 280 nm; emissão: 335 nm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Análise do representante SERT Antibodies A. O rastreio de anticorpos por Western blot. Aproximadamente 1 ug de _CC SERT com ou sem GFP foi aplicado a 4 - 15% de SDS-gel de PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A ligação foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com corante IV. 2G4 e 10F2 são western positivo. B. A ligação de anticorpos a 100 nM SERT GFP e detecção por FSEC detectada utilizando GFP fluorescência. C. A ligação de Fab seleccionados a 100 nM SERT GFP na presença de 1 mM de serotonina. D. A ligação de 8A11 ou 15B8 Fabs para Sert-8B6 Fab. Picos menores de eluição de 18 ml são GFP livre. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A purificação representativas do 8B6 de Fab a partir de células Sf9 Um.. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por His-tag de afinidade chromatograp HY. Vestígio verde representa a concentração de imidazole, 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Não-redutoras e redutoras em gel de SDS-PAGE depois de purificação por afinidade de His-tag. Proteína que corre perto de 50 kDa é Fab não reduzido (#) e as espécies menores de 25 kDa é reduzido Fab (*). C. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por permuta catiónica exibindo um único pico simétrico que elui sob um gradiente linear de cloreto de sódio. Vestígio verde representa a concentração de NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Análise do 8B6 Fab num gel de SDS-PAGE a 12,5%, após purificação por permuta catiónica. E. Ligação do 8B6 Fab a 10 nM SERT GFP, detectada usando fluorescência da GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

e 6 "src =" / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Figura 6: Cromatograf ia de Filtração em Gel representativas do Complexo SERT-8B6 na presença de S Uma -citalopram.. Gel perfil de eluição da filtração purificado complexo SERT-8B6. pico principal que elui a 11,5 mL é o complexo SERT-8B6. Pico em 15-17 mL contém GFP e Fab B.. Análise do complexo SERT-8B6 purificado numa 4 - em gel de SDS-PAGE a 15%. As posições de SERT e as cadeias pesada e leve do Fab são mostrados por uma barra. C. FSEC das fracções separadas por tamanho. complexos SERT-8B6 foram detectados utilizando a fluorescência do triptofano. Fracção 17 contém uma quantidade maior de SERT que não fez complexo com Fab. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Cristalização do Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. A microscopia de luz em forma de paralelepípedo de cristais do complexo SERT-8B6 após 2 semanas de crescimento. A barra de escala é igual a 200 um. B. cristais SERT-8B6 difratar raios-X a 3,15 Å. anel azul representa 3,15 Å. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1:. A tela cristalização para o Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram Por favor clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Determinação de estrutura de proteína de membrana por técnicas biofísicas permanece uma tarefa difícil para muitos transportadores clinicamente significativos, receptores e canais ^11. Aqui temos conhecimentos partilhar detalhada desenvolvido para a determinação da estrutura do transportador de serotonina humano ligado a S -citalopram. Prevemos que estes métodos irão ser úteis para determinar estruturas de SERT em outros estados conformacionais, bem como estruturas de outras proteínas de membrana difíceis. Além disso, as técnicas bioquímicas descritos aqui também podem ser usadas para estudar a função de SERT purificada em detergente e um ambiente quase nativo lípido.

SERT cristalização articulada sobre o desenvolvimento de várias técnicas e ferramentas. Em primeiro lugar, as melhorias na estabilidade térmica transportador produzidos variantes SERT que foram bem-comportado em várias micelas de detergentes seguintes extração do transportador a partir de membranas ^6. Em segundo lugar, o uso-citalopram do ligando de afinidade elevada ao longo S purificação e cristalização adicional estabilidade melhorada e reduzida heterogeneidade conformacional. Em terceiro lugar, o desenvolvimento do sistema de expressão BacMam ⁷ permitido para a produção de grandes quantidades de SERT em um curto período de 2 semanas, o que facilita tanto a imunização e cristalização. Finalmente, o desenvolvimento de estratégias para seleccionar anticorpos de afinidade elevada que reconhecem epitopos 3D permitiu a descoberta de que o anticorpo 8B6 que promove a embalagem bem ordenada de complexos anticorpo-SERT em cristais.

Há uma série de passos e reagentes críticos, bem como problemas comuns que ocorrem frequentemente ao longo do protocolo. Em primeiro lugar, a geração de elevado título de vírus SERT P2 pode ser problemático. A adição de concentrações baixas de vírus P1 para gerar vírus P2, como descrito neste protocolo normalmente mitiga este problema, e nos casos em que o título do vírus P2 é baixo, vírus P3 podem ser feitos Utilizang vírus a uma MOI de 0,0001. Os vírus com um título inferior a 1 x 10 ⁸ partículas de vírus / ml não devem ser utilizados e quase sempre resultar em rendimentos baixos da proteína. Para a expressão, HEK293S GnTI ^- células foram escolhidos uma vez que falta N -acetylglucosaminyltransferase eu actividade e, assim, não pode sintetizar-glicanos complexos n, em vez produzindo apenas N-glicanos de manose elevada. Cliva EndoH N -ligada glicosilação de altas glicanos de manose em dois locais na alça extracelular 2 (EL2), deixando uma acetilglicosamina N ligado a asparagina. A digestão de N -linked açúcares reduz entropia superfície de EL2 que é provável importante para a cristalização. Para a geração de anticorpos, o SERT _IC deve ser utilizada para a imunização. GFP é altamente imunogénica e ¹² não deve ser usada como uma etiqueta de fusão para gerar anticorpos uma vez que é difícil de remover completamente por SEC. A N- flexível e C-terminal da SERT também não eramincluída na construção, a fim de evitar os anticorpos contra estas regiões. Os ratos podem ser imunizados com 30 ug de proteína reconstituída; continuar ratinhos imunizantes até concentrações elevadas no soro de anticorpos pode ser detectada e produzir células de hibridoma, tal como descrito ^13. Uma construção thermostabilized é geralmente a melhor escolha para a imunização; se o transportador é bem comportado e mantém a actividade biológica após purificação, esta é muitas vezes suficiente para produzir anticorpos. O anticorpo 8B6 foi levantada contra WT SERT. Para a cristalização, apenas as fracções de pico contendo de Sec complexo monodisperso como julgado por FSEC devem ser combinadas e concentradas. cristais SERT-8B6 crescer em uma estreita faixa de condições e há uma série de passos que devem ser tomadas para solucionar problemas especificamente relacionados ao crescimento SERT cristal. Tris base ajustado com HCl, não deve ser usado na solução de reservatório, uma vez que este tampão não suporta o crescimento de cristais; é, assim, CRIticos em vez disso, use Tris ajustado com NaOH. cristais SERT crescer numa estreita faixa de concentrações de PEG 400, de modo que se cristais não crescem ou se se observarem cristais muitos pequenos, mesmo um pequeno aumento ou diminuição da concentração de PEG 400 seria aconselhável. Além disso, o aditivo de ácido 6-amino-hexanóico também foi utilizado no ecrã optimizado para melhorar a nucleação. A proporção gota de proteína: solução bem é também uma chave determinante para o crescimento de cristais. Gota rácios de 1,5-2: 1 são recomendados, com proporções mais estreitas gota a 2: 1, tipicamente de suporte do crescimento de cristais de 3-dimensionais maiores. Finalmente, o uso de baixo perfil placas de 24 poços também é crucial para o crescimento de cristais, presumivelmente devido à alteração da taxa de difusão de vapor.

Uma abordagem alternativa para o método SPA foi desenvolvido para o rastreio de mutantes que estabilizam o transportador de serotonina rato numa conformação ligado a cocaína utilizando um filtro de ensaio de ligação ^5. Em contrapartida, o ba SPAensaio sed permite passos de aquecimento sequenciais seguintes por determinação da fração de SERT, que permanece ligada ao ligando. Assim, isto permite a determinação rápida da temperatura de fusão a partir de um pequeno número de amostras. O método SPA baseia-se na disponibilidade de um ligando de alta afinidade marcado radioactivamente e, se não se conhecem os ligandos que se ligam com afinidade submicromolar, em seguida, uma abordagem alternativa será necessário. Muitos outros métodos são geralmente usados para medir a estabilidade da proteína tais como a ligação de corantes fluorescentes e de calorimetria ¹⁴ mas são de baixo rendimento e são incapazes de medir directamente a função ou requerem grandes quantidades de proteína. Se o método SPA não pode ser utilizado, uma abordagem alternativa de elevado rendimento é uma termoestabilidade Ensaio Baseado em FSEC ¹⁵ (FSEC-TS), em que a amostra é aquecida seguido pela separação da fracção de permanecer transportador. FSEC-TS é uma abordagem útil para aceder comportamento cromatográfica e estado oligomérico e é apferramenta complementar owerful que pode ser usado juntamente com o método SPA.

Uma comparação de vários sistemas de expressão de proteína comum, também foi encontrada para favorecer a utilização de células de mamífero para expressão e sem surpresa SERT ¹⁶ esta é provavelmente o caso para muitas proteínas de origem mamífera. Os métodos que usamos para a expressão foram adaptados para SERT, mas é provável facilmente adaptável. As condições que favorecem elevados níveis de expressão deve ser cuidadosamente identificados através da variação do tempo de expressão, temperatura, concentração de vírus, e a presença de inibidores de histona-desacetilase, tais como o butirato de sódio.

Em geral, favorecem a purificação por afinidade de um detergente de cadeia longa, tais como C12M leve juntamente com CHS antes da reconstituição para manter o ligando de alta afinidade de ligação. Reconstituição utilizando absorção hidrofóbica é uma técnica suave que se descobriram ser eficaz para vários outros transportadores e receptores. Se estenão é bem sucedida, a remoção de detergentes com altas concentrações de micelas críticas por diálise, de diluição, ou SEC pode ser empregue ^17, desde que o antigénio seja suficientemente estável em tais detergentes. Nos casos em que não há anticorpos adequados são encontrados, nós quase sempre encontrar o problema é devido à perda de função ou desnaturação do antígeno e, nesses casos, foi realizada com sucesso novas imunizações prestando especial atenção à bioquímica de proteínas. Finalmente, os ligandos e anticorpos que se ligam com afinidade elevada deve formar a base para um experimento de cristalização racionalmente planeada, e tirando partido de uma variante termoestável, pode-se o despiste de uma gama mais ampla de condições, fazendo variar as propriedades de diferentes detergentes. Além disso, a cristalização de uma mesofase lipídica ¹⁸ ou usando bicelles ¹⁹ deve ser sempre considerada como uma alternativa à cristalização em micelas.

Estes princípios e métodos podem ser usados ​​com algum modificação para muitas outras proteínas transmembranares que são difíceis de expressar e purificar a partir de outros hospedeiros de expressão, e será particularmente útil para a determinação da estrutura de alvos de drogas de alta afinidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Gentamicin	Fisher	BP918-1
Tetracycline	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside	Anatrace	I1003	IPTG
Miniprep kit	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Sf9 transfection reagent
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Sodium butyrate	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310
Cholesteryl hemmisuccinate	Sigma	C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Brain polar lipid	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonin	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Available from authors
Imidazole	Sigma	56749
n-Octyl β-D-maltoside	Anatrace	O310	Anagrade
Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400	Sigma	91893
6-aminohexanoic acid	Sigma	7260
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	heating block for thermostability assay
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates	Eppendorf	5306000006
0.2 µm syringe filter	Olympus Plastics	25-243
1 L filter system	Corning	430517
2 L flat bottom tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000B
CO2 incubator	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Strep-Tactin resin	Iba Life Sciences	2-1208-025	Strep affinity resin
Extruder	Northern Lipids
Li-Cor imaging system	Odyssey		western blot imaging system
XK16 column	GE Healthcare	28-9889-37	column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC903024
Äkta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) column	GE Healthcare	17-5172-01	Used for FSEC
Tangential flow apparatus	Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator	Pall Filtron	OS030T12
Talon resin	Clonetech	635504	His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101	Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17-5175-01	Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate	Hampton Research	HR3-306
18 mm coverslips	Hampton Research	HR3-239
Virocyt virus counter	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-well scintillation counter
HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101
Sertraline	Sigma	S6319