Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Riepilogo

Questo manoscritto descrive come schermo per thermostabilizing mutazioni, purificare il trasportatore della serotonina umano, generare anticorpi ad alta affinità, e cristallizzare il complesso trasportatore della serotonina-anticorpo legato alla antidepressivo della droga S -citalopram. Questo protocollo può essere adattato allo studio di altri trasportatori di membrana impegnativi, recettori e canali.

Abstract

Il trasportatore della serotonina è un trasportatore di sodio e cloruro-coupled che "pompe" serotonina extracellulare in cellule. S -citalopram è un farmaco usato per trattare la depressione e l'ansia legandosi al trasportatore della serotonina con alta affinità, il blocco della ricaptazione della serotonina. Qui riportiamo una procedura efficace e una serie di strumenti per stabilizzare, espresso, purificare, e cristallizzare serotonina complessi trasportatore-anticorpo legato a S -citalopram e altri antidepressivi. Le mutazioni che stabilizzano il trasportatore della serotonina sono stati identificati usando un saggio di legame -citalopram S. Trasportatore della serotonina espressa in baculovirus-trasdotte HEK293S GnTI ^- cellule, è stata ricostituita in proteoliposomi e utilizzato per aumentare gli anticorpi ad alta affinità. Abbiamo sviluppato una strategia per scoprire anticorpi che sono utili per studi strutturali. è stato anche istituito un approccio diretto per l'espressione di frammenti di anticorpi nelle cellule Sf9.Complessi Transporter-anticorpo purificato mediante questa procedura sono ben educati e facilmente cristallizzano, la produzione di complessi con S -citalopram che diffract raggi X per 3-4 risoluzione A. Le strategie sviluppate qui possono essere utilizzati per determinare la struttura di altre proteine ​​di membrana impegnativi.

Introduzione

Il trasportatore della serotonina (SERT) è una proteina di membrana integrale che facilita il trasporto della serotonina attraverso le membrane cellulari ^1. SERT appartiene ad una famiglia di neurotrasmettitori sodio Symporters (SSN), che comprende anche la dopamina e noradrenalina trasportatori ^2. SERT è il bersaglio molecolare di antidepressivi e anti-ansia farmaci ampiamente prescritti che agiscono per inibire in modo competitivo il trasporto della serotonina ^3. SERT sfrutta il cotrasporto energeticamente favorevole di sodio per rimuovere neurotrasmettitore dalla fessura sinaptica. Caratterizzazione estesa del sistema serotoninergico ha dimostrato che i cambiamenti nel metabolismo della serotonina sembrano influenzare praticamente tutti i processi neurologici, tra cui umore, il sonno, il dolore, la cognizione, e l'aggressione comportamenti ^4. Funzione SERT può essere modificato attraverso l'uso di antidepressivi e selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI), come S -citalopram, nonché da psychostimulanti e farmaci di dipendenza come l'anfetamina e -methylamphetamine N 3,4-methylenedioxy- o "ecstasy" ^1,2.

SSRI sono estremamente importanti per il trattamento di disturbi dell'umore, ma la base strutturale preciso per la loro azione non è ben compreso. WT SERT è instabile in micelle detergenti, impedendo in tal modo il progresso verso una (3D) struttura tridimensionale del SERT ^5,6. Recentemente, abbiamo sviluppato varianti di SERT, che sono robusta stabile in una vasta gamma di detergenti e mantenere l'attività SSRI ⁶ vincolante. Queste varianti SERT termostabili sono stati selezionati usando un test stabilità termica a base di prossimità scintillazione. Qui si descrive un procedimento per la generazione di anticorpi ad alta affinità che possono legarsi SERT e la purificazione e cristallizzazione di SERT termostabile, in complesso con l'anticorpo e S -citalopram.

Questo protocollo presuppone che il SERT e 8B6 geni sono stati successoy clonato in vettori BacMam ⁷ e insetti di espressione, rispettivamente. Per generare anticorpi, cDNA codificante residui 73-616 di WT SERT è stato clonato in vettore BacMam con un Strep II tag C-terminale (SERT _IC). Per la schermata termostabilità, residui SERT 73-616 con GFP C-terminale, Strep II, e 10-His tag (SERT _TC) è stato utilizzato. Mutazioni puntiformi individuali sono stati generati in background SERT _TC. Per il protocollo di cristallizzazione, la proteina di fusione SERT-GFP è stato utilizzato con TWIN-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) ₂ GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] e 10-Le sue etichette, portando i mutanti termostabili, Y110A, I291A, e T439S e le mutazioni di cisteine superficie C554A, C580A e C622A (SERT _CC). Sequenze trombina scissione (LVPRGS) sono stati anche inseriti nel SERT _CC dopo Q76 e T618 per consentire la rimozione della N- e C-termini. Il plasmide codificante la 8B6 Fab è stato progettato per esprimere sia il pesante e leggeracatene dell'anticorpo con GP67 sequenze secrezione sotto il controllo di due promotori poliedrina separati. Il C-terminale della catena pesante dell'anticorpo 8B6 è stato etichettato con un 8-His tag e un sito di trombina scissione è stato inserito tra la catena pesante e il tag.

Protocollo

1. Trasfezione di Adherent HEK293S GnTI ^- Celle per termostabilità schermo

1. Preparare Poly-D-lisina (PDL) Rivestiti piastre da 96 pozzetti. Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare sterile.
   1. Filtrare una soluzione 25 mg / mL di (PDL), peso molecolare 70,000-150,000 Da, utilizzando un filtro sterile da 0,2 micron. Aggiungere 50 ml di PDL a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti Tissue Culture (TC), assicurando il fondo è uniformemente rivestita, ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   2. Aspirare soluzione PDL e lavare con 200 ml di acqua sterile.
   3. Lasciare asciugare la piastra all'aria per 2 ore prima di conservazione a 4 ° C. piastre rivestite PDL possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.
2. Tripsinizzazione delle cellule HEK293S aderenti.
   1. Grow HEK293S al 80% di confluenza in 10 cm piatto mantenuta a 37 ° C con 8% di CO _2. Un piatto unico 10 centimetri dovrebbe avere circa 10 milioni di cellule HEK293S. Non utilizzare le cellule dopo 30 passaggi!
   2. mezzi Aspirare e lavare con 5 ml di Phosphate-Buffered Saline (PBS). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0,02% EDTA) alle cellule e incubare per 2 minuti a 37 ° C.
   3. Aggiungere 10 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e risospendere le cellule ripetutamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica.
   4. Pipettare 10 ml di cellule e mescolare con 10 ml di soluzione Trypan blu (0,4%). Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro e un microscopio ottico. Non contare le cellule che sono di colore blu come sono morti. Assicurarsi che la vitalità delle cellule è al di sopra del 90%.
3. Accuratamente risospendere tripsinizzati HEK293S GnTI ^- cellule in DMEM supplementato con 10% FBS ad una densità di 0,5 x 10 ⁶ cellule / ml in un serbatoio pipetta monouso. Circa 5 milioni di cellule HEK293S saranno necessari per ogni piatto. Un totale di 24 costrutti può essere trasfettato su ciascuna piastra usando questo protocol.
4. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto di una piastra rivestita PDL. Risospendere le cellule in serbatoio della pipetta dopo riempiendo ogni piatto per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° con l'8% di CO _2. Dopo 24 ore, le cellule devono raggiungere circa l'80% di confluenza.
5. 1 h prima di trasfezione sostituire i media. Preparare DNA-trasfezione complessi reagenti per la trasfezione.
   1. Per ogni costrutto in background SERT _TC ad essere proiettato, mescolare 450 DNA ng con 45 ml di DMEM senza siero e mescolare. Aggiungere 1,6 ml di reagente di trasfezione per 45 ml di DMEM privo di siero e mescolare.
   2. Immediatamente aggiungere la soluzione di trasfezione reagente diluita di soluzione di DNA e mescolare. Non mescolare soluzioni in ordine inverso. Attendere 10 - 15 minuti e aggiungere 20 ml di trasfezione miscela reagente / DNA a 4 pozzi.
6. Una volta che tutti i pozzetti sono state trasfettate, mescolare piatto agitandola lentamente indietro di unnd avanti e tornare alla incubatore a 37 °.
7. Dopo 16 - 24 ore sostituire il supporto con DMEM contenente siero e 10 mm butirrato di sodio.
8. Circa 48 ore dopo la trasfezione rimuovere il supporto e sia procedere immediatamente con termostabilità schermo o congelare le cellule a -80 ° C per essere utilizzato in seguito. Le celle possono essere conservati a -80 ° C per diverse settimane.

Schermo termostabilità 2. scintillazione di prossimità-based con S -citalopram

1. Incubare le cellule con 200 nM S -citalopram in 25 ml di TBS (Tris-Buffered Saline - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Solubilizzare le cellule con l'aggiunta di 25 ml di 8 mm n-dodecil-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM colesterolo hemmisuccinate (CHS), cocktail di inibitori della proteasi (2 mm phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinina, 4 g / mL pepstatina a, e 4 mg / ml leupeptina) in TBS, e incubando per 1 ora a RT.
3. Aggiungere 50 ml di TBS wiesimo 20 nM ^[3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% di albumina sierica bovina, e 2 mg / mL His-tag saggio di affinità scintillazione di prossimità (SPA) perle a tre pozzetti per ciascuno costrutto. Per l'ultimo anche aggiungere la stessa soluzione elencato ma integrare con 100 micron sertralina per determinare legami non specifici. Assicurarsi che le microsfere His-tag di affinità SPA sono accuratamente miscelati quando si aggiunge alla piastra a 96 pozzetti.
4. Provvedimento vincolante ^[3 H] citalopram utilizzando un contatore a scintillazione 96 pozzetti a temperatura ambiente con un tempo di conteggio 1 min per bene. Continuare piastre conteggio fino conteggi totali plateau (dopo circa 36 h).
5. piastre di calore per 15 minuti in un blocco di riscaldamento con un coperchio riscaldato a 33 ° C. Misurare ^[3 H] citalopram vincolante dopo riscaldamento come descritto al punto 2.4.
6. Ripetere il passaggio 2,4-2,5 e cambiare la fase di riscaldamento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Regolare temperature di riscaldamento in funzione della temperatura apparente di fusione (Tm)della proteina bersaglio e la termostabilità del costrutto più stabile. Continuare a riscaldare piatti fino a quando tutti i costrutti hanno bassi conteggi specifici.
7. Analizzare i dati per determinare i valori Tm.
   1. Determinare i conteggi totali medi per minuto (CPM) di ogni costruzione di pozzi che non contengono sertralina facendo la media dei 3 pozzi replicati. Determinare il CPM non specifica la media della CPM di ogni sertralina pozzetto contenente in un unico piatto.
   2. Calcolare il CPM specifica sottraendo il CPM non specifico dal CPM totale.
   3. Calcolare la Tm da un accesso non lineare ad una funzione sigmoidale Boltzmann. Costruisce con un basso CPM specifico a temperatura ambiente (<10% del WT) generalmente non hanno valori precisi Tm. Le mutazioni dei maggior parte dei costrutti termostabili possono essere combinati insieme e sottoposti a screening per additivi aumenti di termostabilità.

3. L'espressione del trasportatore della serotonina umano in HEK293S GnTI ^{- Celle}

1. Trasformare cellule DH10Bac chimicamente competenti con 1 ng di plasmide.
   1. Aggiungere plasmide a 50 microlitri di cellule DH10Bac e incubare su ghiaccio per 30 min.
   2. cellule DH10Bac shock termico a 42 ° C per 30 sec. Aggiungere 200 microlitri di terreno SOC e incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione.
   3. Piatto tutti i batteri su una piastra Luria Broth (LB) contenente 50 mg / ml kanamicina, 7 mg / ml gentamicina, 10 ug / ml di tetraciclina, 100 ug / ml 5-bromo-3-indolil β-D-galattopiranoside, e 40 mg / ml isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
2. Isolare lacZ ^- colonie (colonie bianche) derivate a 37 ° C per 2 d su piastre di LB agar.
3. Grow diverse colonie O / N a 37 ° C in 5 ml di LB contenenti antibiotici e isolare il DNA bacmid.
   1. Spin down batteri a 1000 xg in una centrifuga per 5 min. surnatante degli scarti. batteri Risospendere con 200 ml di miniprep rBuffer esuspension.
   2. batteri Lyse con l'aggiunta di 200 ml di miniprep tampone di lisi e invertendo il tubo dolcemente per 10 volte. Aggiungere 200 ml di tampone di neutralizzazione.
   3. Rimuovere frazione insolubile mediante centrifugazione a 14.000 xg per 10 min in una centrifuga. Aggiungere 1 ml di isopropanolo al surnatante e raffreddare a -20 ° C per 20 minuti per precipitare il DNA.
   4. Spin a 14.000 xg per 15 min in una centrifuga e scartare il surnatante.
   5. Lavare DNA pellet con il 70% EtOH e girare nuovamente a 14000 xg per 15 min. surnatante degli scarti. Aria DNA a secco fino a quando tutti EtOH è evaporato e risospendere in 50 ml di acqua.
      NOTA: Bacmid DNA dovrebbe essere trasfettato in cellule Sf9 subito per i migliori risultati, ma può anche essere conservato a -20 ° C per diverse settimane.
4. Trasfezione bacmid DNA in 1x10 ⁶ cellule aderenti Sf9 coltivati in una camera umidificata a 27 ° C in un piatto da 6 pozzetti. Eseguire tutte le manipolazioni di coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile.
   1. Rimuovere supporti dalle cellule e aggiungere 2 ml di mezzi freschi Sf9. Aggiungere 5 mg di DNA bacmid a 100 l di Sf9 supporti (soluzione A).
   2. Aggiungere 8 ml di una Sf9 reagente di trasfezione cationico-lipidi a 100 ml di Sf9 supporti (soluzione B). Incubare provetta contenente Soluzione B per 5 min.
   3. Mescolare provetta contenente soluzione A con soluzione B e incubare a temperatura ambiente per 30 min e aggiungere tutta la soluzione alle cellule Sf9.
   4. Dopo 96 h, raccolto surnatante (virus P1) facendo passare attraverso un filtro da 0,2 micron. Il virus P1 può essere conservato per diversi mesi a 4 ° C al buio e riutilizzato per rendere virus P2 come necessario.
5. Aggiungere 100 ml di virus P1 a 1 L di cellule Sf9 ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule / ml in mezzi Sf9. Infettare le cellule per 96 h, crescendo a 27 ° C su un agitatore a 100 rpm.
6. Spin le cellule in una centrifuga a 4000 xg per 15 minuti e il surnatante filtro contenente particelle virali attraverso un filtro da 0,2 micron. Scartare pellet cellulare. determdensità virale ine utilizzando un saggio di placca virale o un contatore virus. La densità virus dovrebbe essere particelle> 1 x 10 ⁸ virali per millilitro. virus P2 può essere conservato a 4 ° C al buio e utilizzato per diversi mesi.
7. Infect 10 L di HEK293S GnTI ^- cellule ⁷ crescono in sospensione a 37 ° C con 8% di CO ₂ e 85% di umidità su un agitatore a 130 rpm in 293 mezzi di espressione addizionato con 2% FBS ad una molteplicità di infezione (MOI) di 2 e una densità di 3 x 10 ⁶ cellule / ml, tipicamente 30 - 50 mL di P2 virus per 800 ml di cellule in un 2 L sconcertato pallone.
   NOTA: Non è consigliabile usare più di 80 ml di virus P2 poiché il HEK293S GnTI ^- le cellule crescono lentamente e può diventare impraticabile a causa di un cambiamento di pH. SF9 media è più acida rispetto al supporto 293 espressione.
8. 12 - 16 h post-infezione, aggiungere butirrato di sodio ad una concentrazione di 10 mM da uno stock 1 M. 48 - 60 ore dopo l'infezione, Celle di raccolta per centrifugazione a4.000 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante.
9. Risospendere le cellule in 150 ml di TBS, 2 mM S -citalopram o altri inibitori SERT e conservare a -80 ° C fino al momento della purificazione.

4. affinità purificazione del trasportatore della serotonina per le vaccinazioni e cristallizzazione

1. Scongelare cellule da 10 L di coltura in acqua calda (circa 30 ° C) e risospendere da rapidamente passando attraverso un mL pipetta 10 fino ad omogeneità.
2. Preparare una soluzione detergente per la solubilizzazione (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl contenente 40 mM C12M, 5 mM CHS, e inibitore della proteasi cocktail.
3. Aggiungere tutte le celle in un becher di ancoretta e aggiungere tutta la soluzione detergente cellule agitando. Solubilizzare a 4 ° C per 1 h sotto agitazione.
4. Spin lisato a 8000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare pellet e supernatante decantare in provette ultracentrifuga pulite. Spin a 100.000 xg per 1 h in un ultracentrifuge. Scartare pellet e filtro surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron.
5. Passare lisato oltre 10 ml di Strep resina di affinità imballato in una colonna utilizzando una pompa peristaltica equilibrata in tampone di lavaggio: 1 mm C12M, 0,2 mM CHS, 5% glicerolo, 25 mM lipidi (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero- 3-phosphocholine, 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina, e 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoglycerol in un rapporto molare di 1: 1: 1), e 1 mM S -citalopram o SSRI in TBS.
6. Collegare l'affinità delle colonne Strep ad un sistema veloce di proteine ​​cromatografia liquida (FPLC) e lavare colonna a 2 mL / min con 66 ml (volumi 6,6 colonna) di tampone di lavaggio. Eluire proteina purificata in stesso tampone integrato con 5 mM desthiobiotin a 0.5 mL / min con 33 mL (volumi 3,3 colonna) di tampone. Raccogliere 1 frazioni mL; le frazioni di picco sarà ~ 10 mL. proteina purificata può essere conservato a 4 ° C per 2 - 3 d se desiderato.
   NOTA: Resa totale sarà di 3 -4 mg di SERT _CC e 1 mg di SERT _IC. Un'assorbanza di 2 AU a 280 nm è pari a 1 mg / mL SERT.

5. Ricostituzione del trasportatore in liposomi per l'immunizzazione

1. Preparare liposomi contenenti asolectin: colesterolo: lipide A: cervello polare lipidi (rapporto molare 60: 17: 3: 20). Sciogliere lipidi in 1 mL di cloroformio e aggiungere 40 mg di lipide totale in un pallone a fondo tondo vetro da 100 mL con un rapporto molare indicato.
   1. Evaporare cloroformio per almeno 1 h sotto vuoto con il pallone a fondo tondo rotante in acqua calda a 30 ° C.
   2. Reidratare lipidi con l'aggiunta di 10 ml di TBS. Incubare in tampone per 10 min.
   3. Blocca il lipide mettendo il pallone in liquido N _2.
   4. Scongelare. Immergere fondo sferica del pallone in un bicchiere pieno d'acqua calda, circa 30 ° C. Sonicare in un bagno sonicatore per 5 min.
   5. Vortex e ripetere i punti 5.1.3 - 5.1.4 10 volte o fino a quando il lipideè completamente risospeso dal basso e forma una sospensione torbida.
   6. Estrudere la miscela lipidica due volte attraverso 200 filtri nm. I lipidi apparirà come una sospensione lattiginosa prima dell'estrusione; in seguito sarà traslucido. Non aggiungere l'intera miscela lipidica all'estrusore contemporaneamente come può intasarsi, con conseguente perdita di campione.
   7. Spin lipidi a 100.000 xg per 20 min e risospendere in 0,5 - 1 ml della TBS ad una concentrazione di 40 mg / mL.
2. Concentrato purificato SERT _IC a 250 - 500 ml utilizzando una proteina concentratore 100 kDa MWCO centrifuga a 2-4 mg / mL e saturare liposomi con 5 mM C12M. Aggiungere SERT purificato al detersivo: miscela lipidica in 1 ml di volume finale.
3. Rimuovere C12M da 3 successive aggiunte di 80 mg / ml di resina idrofoba assorbimento. Per i primi 2 aggiunte, incubare con resina con rotazione per 2 ore a 4 ° C. Rimuovere resina passando attraverso lana di vetro. Eseguire l'incubazione finale con resinadurante la notte.
4. Concentrato proteoliposomi per centrifugazione a 100.000 xg per 20 min. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 250-500 ml di TBS.
5. Aggiungere 10 mM concentrazione finale di S -citalopram alla proteina ricostituito a seguito della rimozione finale di resina.
6. Solubilizzare 2,5 ml di proteoliposomi nel buffer SDS-PAGE di carico (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glicerolo, 2% SDS, 0,01% blu di bromofenolo, 100 mM DTT) ed eseguire su un gel SDS-PAGE a 200 V per 1 h per garantire che SERT è stato ricostituito con successo. Proteoliposomi possono essere conservati a -80 ° C in aliquote per la conservazione a lungo termine e scongelati in ghiaccio prima di ogni immunizzazione.

6. Screening per anticorpi Riconoscere epitopi 3D

1. linee cellulari derivate da ibridomi schermo Western Blot. Gli anticorpi che riconoscono SERT mediante western blot probabilmente si legano epitopi lineari e probabilmente non essere utile per studi strutturali.
   1. Mescolare 1 mg di purifiEd SERT _IC o SERT _CC ed eseguire su un 4 - gel SDS-PAGE 15% a 200 V per 1 ora.
   2. Trasferire una membrana di nitrocellulosa a 200 mA per 30 minuti utilizzando tampone Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% (v / v) di metanolo, 0,1% SDS). La membrana può essere essiccati e conservati indefinitamente a temperatura ambiente.
   3. Membrana rewet con il 10% di metanolo, e lavare con PBS (10 mM fosfato, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
   4. Blocco con 5% di latte in polvere in PBS per 30 minuti a RT.
   5. Lavare con PBS e incubare con 1 mg / mL di anticorpi in PBS con 0,1% di latte.
   6. Lavare a lungo con PBS contenente 0,1% di Tween-20.
   7. Incubare con anticorpo di capra anti-topo coniugato con un colorante IR diluito 1: 10.000 in PBS con 0,1% Tween 20 e latte 0,1%.
   8. Lavare ampiamente e eseguire la scansione utilizzando un sistema di imaging.
2. Mescolare ibridoma surnatante contenente anticorpi negativi occidentali con 100 nM proteina SERT _CC utilizzando un rapporto molare di 1: 2 (SERT: mAb) in 200 ml TBS con 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, e 1 micron S -citalopram. Centrifugare a 100.000 xg per 20 min. Analizzare surnatante contenente complessi SERT-mAb e analizzare da fluorescenza di rilevamento Size Exclusion Chromatography (FSEC) ^8. Eliminare il pellet.
   1. Eseguire 100 ml di surnatante su una colonna di esclusione sterica a 0.5 mL / min utilizzando un sistema High Performance Liquid Chromatography (HPLC) equipaggiato con un rivelatore a fluorescenza (eccitazione: 480 nm, emissione: 510 nm) usando un tampone di corsa contenente TBS, 0,4 mM lauril glicole neopentilico maltosio, e 1 micron S -citalopram. Gli anticorpi che formano complessi causerà la proteina GFP-fusion per eluire prima di quanto il trasportatore libera dalla colonna dimensione-esclusione.
   2. Diluire complessi a 10, 1, 0,1 nM a 200 microlitri TBS con 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, e 1 micron S -citalopram ed eseguire nuovamente FSEC. Anticorpi che può ancora spostare il picco trasportatore a basse concentrazioni nanomolari sonoleganti affinità alti e buoni candidati per studi strutturali.
3. Ritestare impegnativa FSEC in presenza di 1 mM serotonina. Anticorpi che riconoscono specificamente la conformazione SSRI vincolato non si legano in presenza del substrato. Anticorpi che riconoscono un epitopo 3D che non cambia a causa della conformazione legheranno indipendentemente ligando presente.
4. Mescolare due a due diverse combinazioni di anticorpi e testare vincolante per FSEC. Gli anticorpi che riconoscono epitopi distinti causerà SERT per eluire prima, quando combinati insieme, rispetto al legame di un singolo anticorpo.
5. Per gli studi strutturali iniziali, selezionare i più elevati anticorpi affinità che riconoscono epitopi 3D.

7. L'espressione di anticorpi Frammento in cellule Sf9

1. Clone domini variabili e costanti di Fab mediante PCR nel sistema di espressione degli insetti per l'espressione in cellule Sf9 utilizzando protocolli standard.
2. Trasfezione 1 x 10 ⁶ celle Sf9 con 5 mg di Bacmid DNA che codificano per le catene leggere e pesanti della 8-His tag 8B6 Fab con una sequenza di secrezione GP67 (di cui al punto 3.4).
3. Harvest P1 virus 96 h posttransfection e aggiungere 500 ml di virus P1 a 1 L di cellule Sf9 ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule / ml in un pallone da 2 L di rendere virus P2. Infettare le cellule per 96 ore a 27 ° C.
4. Harvest virus P2 (di cui al punto 3.6).
5. Infect 6 L di cellule Sf9 ad una densità di 2 - 3 x 10 ⁶ cellule / ml con una MOI di 2 con virus P2, tipicamente 40 - 50 ml per beuta con 1 L di cellule Sf9 a ciascun pallone da 2 L.
6. Celle di raccolta di circa 96 h postinfection. Aggiungere 50 mL di tampone fosfato, pH 8 ad una concentrazione finale di 50 mM alle cellule e centrifugare a 4000 xg per 20 min. Eliminare il pellet di cellule e filtro surnatante con una cella di flusso tangenziale 0,2 micron filtro. Raccogliere il surnatante e conservare a 4 ° C per 2 - 3 giorni se lo si desidera.

8. Purificazione di anticorpi Frammenti da Sf9 Surnatante

1. Concentrato surnatante Sf9 utilizzando un 30 kDa peso molecolare Cut Off (MWCO) cella di flusso tangenziale a circa 400-800 ml.
2. Aggiungere imidazolo, pH 8 ad una concentrazione finale di 10 mM e 10 mL di resina di affinità His-tag. Mescolare in un bicchiere per 1 ora a 4 ° C.
3. Raccogliere His-tag resina affinità per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min. surnatante degli scarti.
4. Confezione His-tag resina di affinità in una colonna e connettersi a un FPLC.
5. Lavare His-tag resina di affinità a 2 mL / min con 66 ml (volumi 6,6 colonna) di 50 mm di fosfato pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolo.
6. Eluire 8B6 Fab in 33 ml di 50 mM di fosfato pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazolo. Raccogliere 1 ml frazioni.
7. Diluire affinità purificato Fab con un volume 10 volte di acetato 20 mM ghiacciato, pH 5.
8. Associare Fab ad una colonna di scambio cationico 1 mL utilizzando una pompa peristaltica a 1 mL / min.
9. Separata Fab utilizzando un mL lin 30gradiente orecchio di NaCl (0 - 500 mm) 20 mM acetato pH 5,5 utilizzando un FPLC. Fab sarà eluire come un singolo picco a ~ 300 mM NaCl.
10. Analizzare su un gel SDS-PAGE 12,5% utilizzando tampone contenente 100 mM DTT. Le catene pesanti e leggere di 8B6 Fab verrà eseguito a 27 e 25 kDa, rispettivamente, su un gel SDS-PAGE riducente.
11. frazioni Pool contenenti Fab e concentrarsi per almeno 10 - 15 mg / mL con un kDa MWCO concentratore 30 proteine ​​in un secchio centrifuga oscillante a 3.000 x g.
12. Aggiustare il pH a 8 con l'aggiunta di 1 M Tris pH 8 ad una concentrazione finale di 50 mM e conservare purificato Fab per lungo a + 4 ° C. Resa totale sarà di 25 - 30 mg. Un'assorbanza di 1,4 AU a 280 nm è pari a 1 mg / ml di 8B6 Fab.

9. formazione di complessi Transporter-anticorpo e la separazione da Size Exclusion Chromatography

1. Per la cristallizzazione, purificare il SERT _CC da Strep cromatografia di affinità in C12M come descritto in precedenza (sezione 4).
2. Digest con trombina per rimuovere i tag (1: 100 w / w) e Endoh (1:10 w / w) O / N a RT. Concentrato a 250 - 300 ml utilizzando un kDa MWCO proteine ​​centrifuga concentratore 100 ad una concentrazione proteica di 10 mg / mL.
3. Mescolare SERT concentrato con Fab ad un rapporto molare di 1: 1,2 in un volume inferiore a 500 microlitri. Centrifugare a 100.000 xg a 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante contenente complesso SERT-Fab. pellet di scarto.
4. Separato da Size Exclusion Chromatography (SEC) utilizzando un FPLC su una colonna di esclusione dimensionale equilibrata in TBS completato con 40 mM n-ottil-β-D-maltoside (C8M), 0.5 mM CHS, 5% glicerolo, 25 mM lipidi (come nel passo 4.5) e 1 mM S -citalopram a 0,5 mL / min.
5. Raccogliere 0,5 ml frazioni e analizzare il 4 - 15% gel SDS-PAGE, così come con la fluorescenza del triptofano da SEC. GFP tagged SERT verrà eseguito a circa 80 kDa su un gel SDS-PAGE. Dopo la rimozione dei capolinea e gli zuccheri N-linked sarà eseguito come una proteina di 45 kDa.
6. Determine che le frazioni di combinare mettendo in comune solo le frazioni che sono monodisperse come giudicato da analisi delle frazioni da triptofano fluorescenza SEC (Eccitazione: 280, emissione: 335 nm).
7. Conservare purificato complesso SERT-8B6 a 4 ° C per un massimo di 1 settimana.

10. La cristallizzazione di complessi Transporter-anticorpo per impiccagione di goccia

1. Prima della cristallizzazione, concentrare frazioni di picco dalla separazione SEC del complesso SERT-8B6 a 2 mg / ml usando un kDa MWCO proteine ​​centrifuga concentratore 100. Un'assorbanza di 2 AU a 280 nm è pari a 1 mg / mL.
2. Aggiungere ulteriore Fab con un rapporto di 1: 0.05 complesso: gratuito Fab. Aggiungere 10 micron libera S -citalopram.
3. Centrifugare a 100.000 xg a 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante contenente il complesso SERT-Fab. pellet di scarto.
4. Impostare uno schermo da 24 pozzetti goccia pendente a 4 ° C in base alla tabella 1. Grow cristalli di qualità diffrazione rispetto alle soluzioni serbatoiocontenente 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, a 25 - 125mM KCl 32,5 - 34% PEG 400, e 0,5% di acido 6-amminoesanoico.
   NOTA: Utilizzare Tris regolato con NaOH a pH 8,5 come un buffer. Non utilizzare Tris base regolare con HCl. Lo schermo può essere preparato in 2 mL e utilizzato fino al termine. Fare attenzione a pipetta accuratamente PEG 400 con una pipetta a spostamento positivo in quanto è estremamente viscoso!
   1. Pipettare 500 ml di ciascuna soluzione serbatoio in un basso profilo 24 pozzetti con sigillante applicato a ciascun pozzetto. Pipetta 1.5, 1,75, e 2 ml del complesso SERT-8B6 su un 18 millimetri di vetro siliconato di copertura antiscivolo. Pipettare 1 ml di soluzione serbatoio sopra il campione proteico.
      NOTA: La piastra è stata acquistata con sigillante già applicato al bordo dei pozzetti.
   2. Applicare vetrino di copertura al 24 pozzetti con le gocce di fronte alla soluzione di serbatoio e sigillare immediatamente premendo copertura antiscivolo sul sigillante pre-applicato ad ogni bene.
   3. Continuare fino a quando tutti i 24 pozzi sono stati istituiti.
   4. Lasciare il piatto finito in una stanza ben isolata a 4 ° C. Non disturbare le piastre per almeno 3 giorni
      NOTA: cristalli singoli appariranno entro circa 3 giorni e crescere per 100-175 micron dopo 14 giorni.
5. Cristalli Harvest in cryoloops e direttamente flash-cool in N liquido ₂ prima di raggi X la raccolta dei dati di diffrazione.
6. Se necessario, trovare condizioni di cristallizzazione supplementari di ampia proiezione con gocce sospese. Utilizzare tre gocce con proteine: rapporti precipitanti di 2: 1, 1.5: 1, 1: 1. Se un robot è disponibile, quindi impostare 100-150 nL gocce più di 70 ml di soluzione di riserva in una piastra da 96 pozzetti. cristalli 3D più grandi possono essere coltivate in 24 pozzi.
7. Punteggio in base alla comparsa della goccia: 0, chiaro; 1, della polvere; 2, precipitato granulare; 3, separazione di fase; 4, microcristallina; 5, aghi; 6, piatti; 7, cristalli 3D.
8. Impostare la cristallizzazione per impiccagione metodi goccia in 24 pozzi come sopra descritto intorno cond recentemente identificatiizioni.

Risultati

Una libreria di mutanti puntiformi nei precedenti SERT _TC è stato creato allo schermo per thermostabilizing mutazioni. mutanti individuali sono stati generati utilizzando mutagenesi standard. Il protocollo di screening utilizza trasfettate cellule HEK293S e uno schermo stabilità termica a base di vicinanza scintillazione all'identità rapidamente mutazioni utili per la cristallizzazione come illustrato nella figura 1A. I valori di tracciato Tm rispetto al limite ^[3 H] citalopram a temperatura ambiente rivela costruzioni con elevati livelli di termostabilità e di espressione adatti per la purificazione della proteina (Figura 1B). Tre mutanti (Y110A, I291A, e T439S) sono stati combinati per generare una costruzione altamente stabile (Figura 1C). Termostabilità è anche correlata con una maggiore stabilità in brevi detergenti catena necessari per la cristallizzazione del complesso SERT-Fab.

L'espressione su larga scala di SERT umano per mezzo di baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI ^- cellule può richiedere meno di 2 settimane e può produrre quantità milligrammo, come illustrato nella Figura 2A. Uso della proteina SERT _CC GFP-tagged permette SERT essere convenientemente seguita durante espressione e purificazione mediante fluorescenza (Figura 2B). La nostra strategia di purificazione coinvolto 1) solubilizzazione del SERT legato a S -citalopram da HEK293S GnTI ^- cellule in C12M in presenza di CHS come un lipide di stabilizzazione; 2) legame di SERT ad una matrice di affinità Strep; 3) la rimozione delle proteine ​​contaminanti da ampi lavaggio; e 4) eluizione del SERT funzionale con tampone contenente desthiobiotin (Figura 2C). La proteina eluita è in gran parte privo di altre proteine rilevabili di Coomassie blu colorazione e monodisperse come giudicato da FSEC (Figura 2D, E).

Una strategia simile è stata presa per purificare SERT con un tag Strep II che è stato utilizzato per reconstitution e l'immunizzazione (Figura 3A, B). L'incorporazione di SERT nel proteoliposomi aumenta la emivita plasmatica e la stabilità del SERT e migliora la probabilità di isolamento di anticorpi ad alta affinità. Inoltre, l'inclusione di lipide A, un componente della parete cellulare batterica, serve come un potente adiuvante ^9. liposomi multilamellari sono stati preparati con l'aggiunta di tampone ad una miscela di lipidi essiccati in tubi di vetro e risospese in tampone. Estrusione dei liposomi attraverso filtri di dimensione dei pori 200 nm produce monodisperse sospensioni liposomiali unilamellari. I liposomi vengono poi saturati con detergente seguita dall'aggiunta di SERT purificato detergente. Infine, il detersivo viene rimosso mediante aggiunta di resina di assorbimento idrofoba al lipide: miscela detergente. Ulteriori ligando deve essere aggiunto al campione ricostituito per selezionare gli anticorpi che riconoscono la conformazione legato antidepressivo. La presenza dei SERT nelle proteoliposomi deve essere confermata dasolubilizzare un piccolo campione con SDS-PAGE carico dye o C12M e in esecuzione su SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D).

linee cellulari derivate da ibridomi che esprimono anticorpi SERT possono essere sottoposti a screening per leganti ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D. Queste proprietà sono cruciali per il successo finale di cristallizzazione, come l'anticorpo deve rimanere saldamente legato a una regione strutturato per promuovere imballaggio di cristallo di omogenei, domini ben ordinate. Nella prima fase, vengono identificati anticorpi che riconoscono regioni non strutturati. SERT è denaturato e cancellato su una membrana di nitrocellulosa; anticorpi che si fissano SERT denaturato saranno occidentale-positivi e probabilmente riconoscere epitopi lineari. Nella Figura 4A, mostriamo 2 esempi di anticorpi che sono occidentali-positivi e probabilmente non utile a promuovere crystallogenesis. Nella Figura 4B, i restanti anticorpi occidentale-negativi vengono incubate con 100 nM SERT-GFP e separati daFSEC. Gli anticorpi che si legano SERT si sposterà il picco GFP-positivi ad una posizione precedente. I complessi SERT-anticorpo può essere diluito ulteriormente in un detergente per determinare se essi possono legarsi con affinità nanomolari seguita da analisi da FSEC. Aggiunta di risultati serotonina a cambiamenti conformazionali il trasportatore e quindi gli anticorpi possono essere nuovo controllo per determinare se possono riconosce specificamente la conformazione SSRI-bound. In Figura 4C, gli anticorpi sono mostrati di impegnare SERT in presenza di serotonina, dimostrando che l'epitopo (s) non cambiano dal SSRI al substrato stato legato. Infine, nella Figura 4D combinazioni di anticorpi sono testati per la loro capacità di legare epitopi distinti, determinando un ulteriore spostamento verso sinistra. Qui il 15B8 o 8A11 anticorpi riconoscono un epitopo che è diverso da 8B6.

L'anticorpo 8B6 è stato scelto per ulteriori analisi strutturale basato sullo screening di cristallo preliminare con papaina treaTed Fab. I geni della 8B6 Fab sono stati clonati in un insetto vettore di espressione cellulare. Fab può essere espresso e secreto dalle cellule Sf9 crescono in sospensione. Il 8B6 Fab può essere purificato dal surnatante delle cellule Sf9 da His-tag affinità (Figura 5A, B) e la cromatografia a scambio cationico (Figura 5C, D) con conseguente proteina che appare privo di contaminanti su gel SDS-PAGE. Nella Figura 5E, ricombinante 8B6 Fab è mostrato di legarsi SERT e viene utilizzato in successivi esperimenti biochimici e biofisici.

L'affinità purificato SERT _CC viene digerito con trombina e Endoh e miscelato con 8B6 Fab per formare un complesso in presenza di S -citalopram. Il complesso transporter-anticorpo viene quindi separato dalla SEC in C8M (Figura 6A) e le frazioni di picco contiene sia SERT e Fab come mostrato mediante SDS-PAGE (Figura 6B). Uso di C8M è cruciale per la formazione di cristalli probabilmente perchéil detersivo catena corta permette una migliore imballaggio tra le molecole nel reticolo cristallino. FSEC è impiegato per determinare quale frazioni devono essere aggregate per la cristallizzazione (figura 6C); frazioni che non sono monodisperse e / o contengono grandi quantità di SERT libero o Fab non dovrebbero essere combinati.

Prism cristalli SERT-anticorpo forma possono essere coltivate in presenza di S -citalopram utilizzare questo protocollo per impiccagione diffusione del vapore goccia (Figura 7A). I cristalli risultanti diffrangono i raggi X per una risoluzione di 3,15 Å ¹⁰ (Figura 7B).

Figura 1: scintillazione di prossimità basati termostabilità Assay A.. Sommario del protocollo per lo screening termostabilità in presenza di ^[3 H] citalopram. B. Massima bound ^[3 H] citalopram in funzione della temperatura di fusione apparente (Tm). Le linee tratteggiate rappresentano i valori per il trasportatore WT. I 3 mutanti più termostabili sono etichettati. Zona grigia rappresenta mutanti che hanno meno del 10% di ^[3 H] citalopram rispetto al WT e valori Tm così imprecise vincolante causa di un basso. C segnale-rumore. Curve termostabilità per WT SERT _TC e le prime 3 mutanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica dei mammiferi eterologa espressione della proteina A.. Panoramica schematizzato della generazione di virus BacMam ed espressione di SERT in HEK293S GnTI ^-. Le cellule B. HEK293S GnTI ^- cellule che esprimono il SERT _CC (fluorescenza GFP) C.. Profilo di eluizione del SERT _CC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 mm) D.. Analisi di affinità purificato SERT _CC su 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC di affinità purificato SERT _CC rilevato da GFP fluorescenza (eccitazione: 480 nm; emissione: 510 nm). Il picco eluizione a 15 mL è SERT (#) e 18 ml è GFP gratuita (*). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rappresentante affinità purificazione e Ricostituzione del SERT _IC.. Schema di generazione di anticorpi. B. Profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione per affinità di SERT _IC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 mm) C. Analisi di affinità purificato e ricostituito SERT su un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC di SERT solubilizzato dopo la ricostituzione. La fluorescenza dei residui di triptofano è stato utilizzato per rilevare SERT (Eccitazione: 280 nm; emissione: 335 nm). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Analisi dei rappresentanti SERT anticorpi A. Lo screening di anticorpi da Western Blot. Circa 1 mg di SERT _CC con o senza GFP è stato applicato ad un 4 - 15% SDSgel PAGE e cancellato su una membrana di nitrocellulosa. Binding è stato rilevato utilizzando un anticorpo di capra anti-topo coniugata con IR Dye. 2G4 e 10F2 sono occidentali positivo. B. Il legame di anticorpi a 100 nM SERT GFP-tagged e l'individuazione da FSEC rilevato utilizzando GFP fluorescenza. C. Il legame di Fabs selezionati e 100 nm SERT GFP-tagged in presenza di 1 mm serotonina. D. Il legame di 8A11 o 15B8 Fabs al Sert-8B6 Fab. Picchi minori eluizione a 18 mL sono GFP gratuito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Purificazione Rappresentante del 8B6 Fab da cellule Sf9 A.. profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab da His-tag affinità chromatograp hy. Verde traccia rappresenta la concentrazione di imidazolo, 0 - 50% (0 - 250 mm) B.. Non riducente e riducendo gel SDS-PAGE dopo His-tag purificazione di affinità. Proteine che corre vicino a 50 kDa non è ridotta Fab (#) e specie minori a 25 kDa è ridotta Fab (*). C. profilo Elution osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab mediante scambio cationico visualizzando un singolo picco simmetrico che eluisce con un gradiente di cloruro di sodio lineare. Verde traccia rappresenta la concentrazione di NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mm) D. Analisi della 8B6 Fab su un gel SDS-PAGE 12,5% dopo purificazione mediante scambio cationico. E. Binding della 8B6 Fab 10 Nm SERT GFP-tagged, rilevato utilizzando la fluorescenza della GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Rappresentante del gel filtrazione Cromatografia del Complesso SERT-8B6 in presenza di S -citalopram A.. Gel profilo filtrazione eluizione di purificato complesso SERT-8B6. cima principale eluizione a 11,5 mL è il complesso SERT-8B6. Picco a 15 - 17 ml contiene GFP e Fab B.. Analisi del purificato complesso SERT-8B6 su un 4 - gel SDS-PAGE 15%. Le posizioni dei SERT e le catene pesanti e leggere dei Fab sono indicati da un trattino. C. FSEC delle frazioni di dimensioni separate. complessi SERT-8B6 sono stati rilevati utilizzando la fluorescenza del triptofano. Frazione 17 contiene una quantità maggiore di SERT che non ha complesso con Fab. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7: La cristallizzazione del Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. La microscopia ottica di parallelepipedo cristalli a forma del complesso SERT-8B6 dopo 2 settimane di crescita. Barra della scala è uguale a 200 micron. B. cristalli SERT-8B6 diffrangono i raggi X per 3.15 Å. anello blu rappresenta 3.15 Å. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1:. Una schermata di cristallizzazione per il Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram Cliccate qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Determinazione della struttura delle proteine di membrana con tecniche biofisiche rimane un'impresa scoraggiante per molti trasportatori clinicamente significativi, recettori e canali ^11. Qui condividiamo esperienza dettagliata sviluppato per la determinazione della struttura del trasportatore della serotonina umano legato a S -citalopram. Prevediamo che questi metodi saranno utili per determinare strutture di SERT in altri stati conformazionale, nonché strutture di altre proteine ​​di membrana difficili. Inoltre, le tecniche biochimiche descritte qui possono essere utilizzati anche per la funzione di SERT purificata detersivo e un ambiente lipidico quasi native studiare.

SERT cristallizzazione incernierato sullo sviluppo di diversi strumenti e tecniche. In primo luogo, i miglioramenti nel trasportatore stabilità termica prodotte varianti SERT che sono stati ben educati in varie micelle detergenti Dopo l'estrazione del trasportatore dalle membrane ^6. In secondo luogo, l'usodel -citalopram ad alta affinità ligando S in tutta la purificazione e cristallizzazione ulteriormente migliorato la stabilità e ridurre l'eterogeneità conformazionale. In terzo luogo, lo sviluppo del sistema di espressione BacMam ⁷ consentito per la produzione di grandi quantità di SERT in un breve periodo di 2 settimane, facilitando sia l'immunizzazione e cristallizzazione. Infine, lo sviluppo di strategie per selezionare gli anticorpi ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D consentiti per la scoperta di anticorpi 8B6 che promuove imballaggio ben ordinata di complessi SERT-anticorpo in cristalli.

Ci sono un certo numero di passaggi critici e reagenti nonché problemi comuni che spesso si verificano durante il protocollo. In primo luogo, la generazione di alta titolo virale SERT P2 può essere problematico. Aggiunta di basse concentrazioni di virus P1 per generare virus P2 come descritto in questo protocollo solito attenua questo problema, e nei casi in cui il titolo del virus P2 è bassa, virus P3 può essere fatta usinvirus g ad una MOI di 0,0001. I virus con un titolo inferiore a 1 x 10 ⁸ particelle virali / ml non devono essere utilizzati e quasi sempre luogo a basse rese di proteine. Per l'espressione, HEK293S GnTI ^- le cellule sono stati scelti in quanto mancano N -acetylglucosaminyltransferase I attività e, quindi, non può sintetizzare complessi -glycans N, invece produrre solo alta mannosio N -glycans. Unirà Endoh N linked glicosilazione di alte glicani mannosio in due siti a ciclo extracellulare 2 (EL2), lasciando un -acetylglucosamine N attaccato al asparagina. Digestione di N -linked zuccheri riduce l'entropia superficie EL2 che rischia importante per la cristallizzazione. Per la generazione di anticorpi, il SERT _IC deve essere utilizzato per l'immunizzazione. GFP è altamente immunogenica ¹² e non deve essere utilizzato come tag di fusione per generare anticorpi poiché è difficile da rimuovere completamente SEC. La N- flessibile e C-terminale di SERT anche non eranoincluso nel costrutto per evitare anticorpi contro queste regioni. I topi possono essere immunizzati con 30 mcg di proteine ​​ricostituita; continuare topi immunizzanti fino elevate concentrazioni sieriche di anticorpi possono essere rilevati e produrre cellule ibridomi come descritto ^13. Un costrutto termostabilizzato è di solito la scelta migliore per l'immunizzazione; se il trasportatore è ben educati e mantiene l'attività biologica dopo la purificazione, questo è spesso sufficiente a sollevare gli anticorpi. L'anticorpo 8B6 è stata sollevata contro WT SERT. Per cristallizzazione, solo le frazioni di picco da SEC contenenti complesso monodisperse come giudicato da FSEC dovrebbero essere combinati e concentrati. cristalli SERT-8B6 crescono in una ristretta gamma di condizioni e ci sono una serie di passaggi che dovrebbero essere adottate per risolvere i problemi specificamente legati alla crescita dei cristalli SERT. Tris base regolato con HCl non deve essere usato nella soluzione serbatoio, poiché questo buffer non supporta la crescita di cristalli; è quindi critico utilizzare al posto di Tris regolato con NaOH. cristalli SERT crescere in un intervallo di concentrazione ristretta di PEG 400, quindi se i cristalli non crescono o in presenza di tanti piccoli cristalli, sarebbe consigliato anche un piccolo aumento o una diminuzione della concentrazione di PEG 400. Inoltre, l'acido additivo 6-amminoesanoico è stato utilizzato anche nella schermata ottimizzata per migliorare nucleazione. Il rapporto goccia di proteine: soluzione bene è anche un fattore determinante per la crescita dei cristalli. Goccia rapporti di 1,5 - 2: 1 sono raccomandati, con rapporti goccia più vicino a 2: 1 tipicamente sostenere la crescita di cristalli più grandi 3-dimensionale. Infine, l'uso di basso profilo piastre da 24 pozzetti è anche fondamentale verso la crescita dei cristalli, presumibilmente a causa di modifiche del tasso di diffusione del vapore.

Un approccio alternativo al metodo SPA è stato sviluppato per schermo per i mutanti che stabilizzano il trasportatore della serotonina topo in una conformazione di cocaina-bound utilizzando un filtro saggio di ⁵ vincolante. Per contro, il ba SPAsaggio SED consente di passi sequenziali di riscaldamento seguito da determinazione della frazione di SERT, che rimane legato al ligando. Così, questo consente la rapida determinazione della temperatura di fusione da un piccolo numero di campioni. Il metodo SPA si basa sulla disponibilità di un radiomarcato ligando ad alta affinità e se non sono noti ligandi che legano con affinità submicromolari allora sarà necessario un approccio alternativo. Molti altri metodi sono comunemente usati per misurare la stabilità della proteina come legame di coloranti fluorescenti e calorimetria ^14, ma sono a basso throughput e sono sia in grado di misurare direttamente la funzione o richiedono grandi quantità di proteine. Se non è possibile utilizzare il metodo SPA, un approccio alternativo ad alta produttività è un FSEC basato termostabilità Assay ¹⁵ (FSEC-TS), dove il campione viene riscaldato seguita dalla separazione della frazione del trasportatore rimanente. FSEC-TS è un approccio utile per accedere comportamento cromatografico e lo stato oligomerico ed è apstrumento complementare owerful che può essere utilizzato insieme al metodo di SPA.

Un confronto tra i vari sistemi di espressione della proteina comune è stato anche trovato per favorire l'uso di cellule di mammifero per l'espressione del SERT ¹⁶ e non sorprende questo è probabile che il caso di molte proteine di origine mammifera. I metodi che abbiamo usato per l'espressione sono stati adattati per il SERT, ma è probabile facilmente adattabile. Condizioni che favoriscono alti livelli di espressione devono essere attentamente identificati variando il tempo di espressione, temperatura, concentrazione di virus, e la presenza di inibitori delle istone deacetilasi quali butirrato di sodio.

In genere privilegiamo purificazione di affinità in un detergente a catena lunga come C12M insieme con CHS prima della ricostituzione di mantenere alta affinità di legame ligando. Ricostituzione mediante assorbimento idrofoba è una tecnica mite che abbiamo trovato per essere efficace per molti altri trasportatori e recettori. Se questonon ha esito positivo, la rimozione di detergenti con elevate concentrazioni micellari critiche per dialisi, diluizione o SEC può essere impiegato ¹⁷ purché l'antigene è sufficientemente stabile in tali detergenti. Nei casi in cui non vengono rilevati anticorpi adeguati, abbiamo quasi sempre il problema è dovuto alla perdita di funzione o denaturazione dell'antigene e in tali casi ci eseguita con successo nuove vaccinazioni con particolare attenzione alla biochimica delle proteine. Infine, leganti e anticorpi che si legano con alta affinità dovrebbero costituire la base per un esperimento di cristallizzazione razionalmente pianificata e sfruttando una variante termostabile, si può programmare una più ampia gamma di condizioni variando le proprietà dei diversi detergenti. Inoltre, la cristallizzazione in un mesofase lipidico ¹⁸ o utilizzando bicelle ¹⁹ dovrebbero sempre essere considerati come alternativa alla cristallizzazione in micelle.

Questi principi e metodi possono essere utilizzati con una certa modificationi per molte altre proteine ​​transmembrana che sono difficili da esprimere e purificare da altri host di espressione, e sarà particolarmente utile per la determinazione della struttura dei bersagli di farmaci ad alta affinità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Gentamicin	Fisher	BP918-1
Tetracycline	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside	Anatrace	I1003	IPTG
Miniprep kit	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Sf9 transfection reagent
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Sodium butyrate	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310
Cholesteryl hemmisuccinate	Sigma	C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Brain polar lipid	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonin	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Available from authors
Imidazole	Sigma	56749
n-Octyl β-D-maltoside	Anatrace	O310	Anagrade
Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400	Sigma	91893
6-aminohexanoic acid	Sigma	7260
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	heating block for thermostability assay
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates	Eppendorf	5306000006
0.2 µm syringe filter	Olympus Plastics	25-243
1 L filter system	Corning	430517
2 L flat bottom tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000B
CO2 incubator	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Strep-Tactin resin	Iba Life Sciences	2-1208-025	Strep affinity resin
Extruder	Northern Lipids
Li-Cor imaging system	Odyssey		western blot imaging system
XK16 column	GE Healthcare	28-9889-37	column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC903024
Äkta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) column	GE Healthcare	17-5172-01	Used for FSEC
Tangential flow apparatus	Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator	Pall Filtron	OS030T12
Talon resin	Clonetech	635504	His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101	Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17-5175-01	Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate	Hampton Research	HR3-306
18 mm coverslips	Hampton Research	HR3-239
Virocyt virus counter	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-well scintillation counter
HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101
Sertraline	Sigma	S6319