A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Resumo

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

Resumo

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Introdução

Telas genéticos forward têm sido amplamente utilizados para gerar mutantes genéticos perturbadoras vários processos biológicos em organismos modelo tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) ^1. As análises de tais mutantes levar à descoberta de genes funcionalmente importantes e suas vias de sinalização ^1,2. Tradicionalmente, a mutagénese em C. elegans é conseguida usando produtos químicos mutagénicos, radiação ou transposons ^2. Produtos químicos, tais como metanossulfonato de etilo (EMS) e N-etil-N -nitrosourea (ENU) são tóxicos para os seres humanos; de raios gama ou de raios ultravioleta (UV) mutagénese radiação requer equipamento especial; e estirpes transposon-activa, tais como cepas mutantes ^3, pode causar mutações desnecessários durante a manutenção. Nós desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias usando um fotossensibilizador geneticamente codificado ^4.

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) podem danificar o DNA ^5.O Gerador de mini-oxigênio singlete (miniSOG) é uma proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que foi projetado a partir do LOV (luz, oxigênio, e tensão) de domínio de Arabidopsis phototropin 2 ^6. Após a exposição à luz azul (~ 450 nm), miniSOG gera ROS, incluindo oxigénio singuleto com FL avin mononucleótido como um cofactor ^6-8, que está presente em todas as células. Construiu-se uma proteína de fusão His-MSOG por marcação miniSOG para o terminal C da histona-72, um C. variante elegans de histona 3. Geramos um transgene de cópia única ⁹ para expressar His-MSOG na linha germinativa de C. elegans. Em condições normais de cultura no escuro, os vermes transgênicos His-MSOG tem o tamanho da ninhada normal e tempo de vida ^4. Após a exposição à luz LED azul, os vermes His-MSOG produzir mutações hereditárias entre seus descendentes ^4. O espectro de mutações induzidas inclui mudanças de nucleótidos, tais como G: C para T: A e G: C para C: G, e pequena chromosome Exclusões ^4. Este processo de mutagénese é simples de executar, e requer uma configuração mínima segurança do laboratório. Aqui, descrevemos a instalação de iluminação LED e procedimentos para mutagénese optogenética.

Protocolo

1. Construção do Iluminador LED

NOTA: O equipamento de LED necessário é resumido na Lista de Materiais. A configuração LED inteiro é pequeno e pode ser colocado em qualquer lugar no laboratório, embora recomendamos que ser colocado em um quarto escuro para controlar a exposição à luz de vermes ^4.

1. Ligue o LED a um controlador com cabos (Figura 1A, D).
2. Ligue o aparelho a uma função de gerador / amplificador digital com um cabo BNC (Figura 1A, C, D).
3. Corrigir os LED de luz 10 cm acima do palco usando um suporte personalizado (Figura 1A).
   NOTA: Nós fizemos o suporte com peças de metal.
4. Cubra a instalação de iluminação LED parcialmente, mas evitar a acumulação de calor (Figura 1B), o que torna vermes doente.
   NOTA: Nós usamos uma cobertura de plástico rígido feito por encomenda com a parte superior aberta e inferior (Figura 1A). A tampa não é necessária para a própria mutagénese, mas é usado o to limitar a exposição desnecessária da luz azul para os arredores. Aconselhamos a não cobrir a configuração LED totalmente (Figura 1B) para evitar o sobreaquecimento os vermes.
5. Use óculos de laser de proteção.
   NOTA: usar óculos de laser de proteção porque a luz é muito brilhante. Óculos de sol pode funcionar tão bem.
6. Mudar a alavanca do controlador de LED para 'Int.' para iluminação contínua (Figura 1D) e estabelece-lo em 65% da potência máxima (Figura 1C).
7. Use um fotômetro para medir a intensidade da luz azul sobre a fase em que os vermes são colocados utilizando o protocolo do fabricante. A configuração dá 2,0 mW / mm ² sob iluminação contínua.

2. Tratamento Light Blue

NOTA: Utilize a tensão CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III ⁴ A estirpe está disponível. no Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. Manter a tensão His-MSOG no escuro em meio de crescimento nematóide padrão (NGM) placas com E. coli OP50 seguindo um protocolo padrão ^10,11.
   NOTA: Sob luz ambiente, juSi164 estirpes molecular contendo não apresentam uma taxa de mutação acima de uma taxa espontânea ^4. passagem estirpe de rotina usando um escopo de dissecação com uma lâmpada de halogéneo geralmente não causa mutações também. No entanto, os cuidados devem ser tomados para evitar a exposição desnecessária à luz, por exemplo, mantendo as tensões em uma incubadora-escuro dentro standard, ou cobrindo as tensões com papel alumínio. Aconselha-se a congelar alíquotas da estirpe após recebê-la no caso de mutações desnecessárias se acumulam ao longo do tempo.
2. Escolha grávida jovem adulto (cerca de 12 h pós-L4) animais com um verme pegar ^11.
   NOTA: Os animais mais jovens mostram efeito menos mutagênico ^4, enquanto que os animais mais velhos podem ter menor tamanho da ninhada.
3. Corte um filtro paper para atender a uma placa de 60 mm com 25 mm x 25 milímetros furo quadrado e coloque sobre uma placa unseeded (Figura 1E).
   NOTA: Um perfurador quadrado pode ser usado, mas o tamanho do punção não tem de ser preciso.
4. Queda de 100 ul de 100 mM de CuCl _2, no papel de filtro para restringir uniformemente vermes dentro do furo quadrado sobre a placa.
5. Escolha número desejado de grávidas hermafroditas adultos jovens (ver Passo 3, por exemplo) e transferir para o centro da placa de _CuCl2.
6. Usar a laser óculos de proteção.
7. Ligue o LED e o gerador de função.
8. Mudar a alavanca do controlador de LED para "Ext." para controlá-lo por o gerador de funções (Figura 1D).
9. Definir o controlador a 65% da potência máxima e o gerador de função como onda senoidal, 4 Hz (Figura 1C).
10. Colocar a placa de CuCl ₂ do Passo 2.5, sem uma tampa sobre o palco sob o diodo emissor de luz (Figura 1A </ Strong>).
11. Iluminar os animais com luz azul durante 30 min.
12. Transferir vermes aparência saudável a um prato semeado como P _0.
    NOTA: O número desejado de P ₀ depende do tipo de tela. Consulte a Etapa 3 para um exemplo. Os P ₀ vermes pode parecer ser descoordenada imediatamente após o tratamento de luz e vai recuperar ao longo do tempo.
13. Mantenha vermes cobertos com folha em uma incubadora ou no escuro; e siga o procedimento padrão para começar a triagem fenótipos desejados entre os seus descendentes ^2,10.

3. Exemplo de uma tela genética Adiante

NOTA:. Este é um exemplo do ecrã clonal com 120 genomas haplóides para verificar se o diodo emissor de luz e a tensão estão a trabalhar Figura 2 mostra um esquema do processo.

1. [Day1] Após o tratamento luz azul, escolher cinco vermes aparência saudável em uma placa NGM com OP50 como P _0, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los colocar ovos para 1d (placa 'Day1').
2. [Day2] Transferência P ₀ para uma nova placa sem sementes (placa 'Day2').
3. [Day3] Escolha e matar P ₀ na placa o 'Day2', queimando-os.
4. [Day4] Escolha 30 gravídico jovem adulto F ₁ da chapa 'Day1' e transferi-los em placas individuais (30 F ₁ Bocas para 'Day1').
5. [Dia5] Repita o passo 3.4 para a placa do "Day2 '(30 F ₁ placas para' Day2 ').
6. [Day7-9] Verifique as morfologias anormais e / ou comportamento de F ₂ vermes em comparação com a estirpe WT (Figura 3A) sob um microscópio estereoscópico padrão quando se tornam adultos.
   NOTA: uma mutação hereditárias exibe cerca de um quarto dos vermes com o mesmo fenótipo entre F _2, quando é recessiva com alta penetrância. No entanto, alguns mutantes podem crescer lentamente, e / ou mostrar penetrância parcial. Portanto, é possível que menos do que um quarto dos mutantes pode ser encontrado numaprato.
7. Escolha vermes com fenótipos visíveis individualmente e verificar a herdabilidade do fenótipo na próxima geração.

4. Exemplo de Integração Extracromossômica Transgene

1. Injetar o DNA de interesse em CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (tbb-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparar vermes transgênicos com uma baixa taxa de transmissão (10-30%) na sequência de um protocolo de ^12,13 injeção padrão.
   NOTA: Como alternativa, as matrizes extracromossômicos estabelecidos podem ser cruzados para as cepas juSi164. Para evitar a genotipagem em juSi164, heterozigotos juSi164 pode ser usado como a P _0, embora a eficiência pode ser diminuída. O método de genotipagem para juSi164 é descrito na Seção 5.
2. [Dia1] Tratar ~ 20 animais transgénicos como P ₀ com luz azul, como descrito no Passo 2.
   NOTA: Mais P ₀ vermes são necessárias, dependendo do tr taxa de ansmission. Os transgenes podem ser identificados por co-injecção ou fenótipos marcador ^12,13.
3. Escolha 10 saudável P procura ₀ em placas individuais, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los põem ovos por alguns dias (P ₀ placas)
4. [Day4] Único out 20 transgênico F ₁ vermes de cada placa P ₀ em placas individuais e deixá-los pôr ovos. (20 f ₁ x 10 placas de P ₀ = 200 F ₁ placas no total).
5. [Day7] Encontrar F ₁ placas com> 75% F ₂ com transgenes.
6. Escolha cinco animais transgénicos a partir da taxa de transmissão de> 75% F ₁ F ₂ placas (placas).
7. [Dia10] Mantenha F ₂ placas com taxa de transmissão de 100% como potenciais linhas integradas.
8. Outcross as potenciais linhas integradas, usando um procedimento padrão ¹⁰ para verificar a segregação mendeliana e remover possíveis mutações de fundo.

le "> 5. Genotipagem

1. Lyse outcrossed 20 F ₂ vermes em tampão de lise utilizando um protocolo padrão ^14.
2. Executar PCR utilizando os iniciadores para MosSCI inserção ^9, juSi164, (Tabela 1) com uma temperatura de recozimento de 58 ° C, seguindo um protocolo padrão ^14.
   NOTA: Não é necessário ao genótipo unc-119 (ED3), porque unc-119 (ED3) pode ser detectado pelo comportamento descoordenado após a remoção do transgene resgatando (juSi164) nas seguintes etapas 5.4 e 5.5.
3. Execute eletroforese em gel de agarose ¹⁵ e examinar os tamanhos da banda (Tabela 1) para encontrar o WT para juSi164.
4. Examinar se a progênie F ₂ tem paralisado vermes devido à existência de unc-119 (ED3).
5. Se vermes descoordenados são encontrados na etapa 5.4, individuais vários vermes nonuncoordinated obter todos os vermes nonuncoordinated na próxima geração.

Resultados

Foi realizado um rastreio genético para a frente com CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3), utilizando a exposição à luz 30 min seguindo o protocolo padrão descrito nas secções 2 e 3. Entre 60 F ₁ placas correspondentes a 120 genomas haplóides mutagenizados, encontramos 8 F ₁ placas com F ₂ vermes que exibem fenótipos visíveis, tais como defeito tamanho do corpo (Figura 3B), o movimento descoordenado (Figura 3C),

Discussão

Aqui, nós descrevemos um procedimento detalhado de mutagénese utilizando optogenetic His-MSOG expresso na linha germinativa e fornecem um exemplo de um rastreio genético para a frente em pequena escala. Comparado a mutagénese química padrão, este método de mutagénese optogenetic tem várias vantagens. Em primeiro lugar, não é tóxico, mantendo assim o pessoal de laboratório longe de agentes mutagénicos químicos tóxicos, tais como EMS, ENU e trimetilpsoraleno com luz ultravioleta (TMP / UV). Em segundo luga...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K