Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Riepilogo

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene.

Abstract

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Introduzione

Schermi genetici a termine sono stati ampiamente utilizzati per generare mutanti genetici che perturbano vari processi biologici in organismi modello come il Caenorhabditis elegans (C. elegans) ^1. Le analisi di questi mutanti portano alla scoperta dei geni funzionalmente importanti e loro vie di segnalazione ^1,2. Tradizionalmente, mutagenesi in C. elegans si ottiene utilizzando prodotti chimici mutageni, radiazioni, o trasposoni ^2. Sostanze chimiche come metanosolfonato etile (EMS) e N -ethyl- N -nitrosourea (ITA) sono tossici per l'uomo; raggi gamma o raggi ultravioletti (UV) mutagenesi richiede attrezzature speciali; e ceppi trasposoni-attivi, come ad esempio ceppi mutatori ^3, possono causare mutazioni inutili durante la manutenzione. Abbiamo sviluppato un approccio semplice per indurre mutazioni ereditarie con un fotosensibilizzante geneticamente codificato ^4.

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono danneggiare il DNA ^5.Il generatore mini ossigeno singoletto (miniSOG) è una proteina fluorescente verde di 106 aminoacidi che è stato progettato dalla LOV (luce, ossigeno, e tensione) del dominio di Arabidopsis phototropin 2 ^6. Dopo l'esposizione alla luce blu (~ 450 nm), miniSOG genera ROS compreso l'ossigeno singoletto con fl avin mononucleotide come cofattore ^6-8, che è presente in tutte le cellule. Abbiamo costruito una proteina di fusione His-mSOG etichettando miniSOG al C-terminale dell'istone-72, un C. elegans variante dell'istone 3. Abbiamo generato una singola copia transgene ⁹ per esprimere la sua-mSOG nella linea germinale di C. elegans. In condizioni di coltura normali nel buio, i vermi transgenici His-mSOG hanno dimensioni normali covata e durata ^4. Al momento l'esposizione alla luce blu del LED, i vermi His-mSOG producono mutazioni ereditarie tra loro progenie ^4. Lo spettro di mutazioni indotte include cambiamenti nucleotide, come ad esempio G: C a T: A e G: C a C: G, e piccoli chromosoMi eliminazioni ^4. Questa procedura mutagenesi è semplice da eseguire, e richiede l'installazione minima di sicurezza del laboratorio. Qui, descriviamo l'installazione di illuminazione a LED e le procedure per la mutagenesi optogenetic.

Protocollo

1. Costruzione del illuminatore LED

NOTA: L'attrezzatura necessaria a LED è riassunto nella lista dei materiali. L'intera impostazione del LED è piccolo e può essere posizionato in qualsiasi punto in laboratorio, anche se si consiglia di riporla in una stanza buia per controllare la luce l'esposizione di vermi ^4.

1. Collegare il LED ad un controllore con cavi (Figura 1A, D).
2. Collegare il controller per una funzione generatore / amplificatore digitale con un cavo BNC (Figura 1A, C, D).
3. Fissare i LED luminosi 10 cm sopra il palco con un supporto personalizzato (Figura 1A).
   NOTA: Abbiamo fatto il supporto con parti metalliche.
4. Coprire l'installazione di illuminazione a LED in parte, ma evitare accumulo di calore (Figura 1B), il che rende i vermi malati.
   NOTA: Usiamo una copertina rigida in plastica su misura con la parte superiore aperta e in basso (Figura 1A). Il rivestimento non è necessario per la mutagenesi in sé, ma è usato to limitare l'esposizione non necessaria della luce blu per l'ambiente circostante. Si consiglia di non coprire il setup LED completamente (Figura 1B) per evitare il surriscaldamento dei vermi.
5. Indossare occhiali di protezione laser.
   NOTA: indossare gli occhiali di protezione laser, perché la luce è molto luminoso. Occhiali da sole può funzionare così.
6. Attivare la leva del regolatore LED di 'Int.' per illuminazione continua (Figura 1D) e impostarlo al 65% della potenza massima (Figura 1C).
7. Utilizzare un fotometro per misurare l'intensità della luce blu sul palco dove i vermi sono posizionati utilizzando il protocollo del produttore. La configurazione dà 2,0 mW / mm ² sotto illuminazione continua.

2. Trattamento Light Blue

NOTA: utilizzare il ceppo CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III ⁴ Il ceppo è disponibile. presso il Caenorhabditis Genetics center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. Mantenere il ceppo His-mSOG al buio su terreno di coltura nematode standard (NGM) piatti con E. coli OP50 seguendo un protocollo standard di ^10,11.
   NOTA: In luce ambiente, juSi164 ceppi contenenti, non visualizzano un tasso di mutazione di sopra di un tasso di spontanea ^4. passaggio ceppo di routine utilizzando un ambito dissezione con una lampada alogena in genere non causare mutazioni pure. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare l'esposizione inutile alla luce, ad esempio, mantenendo i ceppi in un incubatore scuro all'interno di serie, o coprendo i ceppi con un foglio. Si consiglia di congelare aliquote del ceppo dopo averlo ricevuto nel caso in cui le mutazioni inutili si accumulano nel tempo.
2. Scegliere gravido giovane adulto (circa post-L4 12 h) gli animali con un verme scegliere ^11.
   NOTA: gli animali più giovani mostrare effetto mutageno meno ^4, mentre gli animali più anziani possono avere dimensioni covata inferiore.
3. Tagliare un filtro pAPER per adattarsi un piatto 60 millimetri con 25 mm x 25 mm Foro quadrato e posto su una piastra di testa di serie (Figura 1E).
   NOTA: Un pugno quadrato può essere utilizzato, ma le dimensioni del punzone non deve essere preciso.
4. Goccia 100 ml di 100 mM CuCl ₂ sulla carta da filtro in modo uniforme per restringere vermi all'interno del foro quadrato sulla piastra.
5. Scegliere il numero desiderato di gravide giovani adulti ermafroditi (vedi punto 3 per un esempio) e trasferimento al centro della piastra CuCl _2.
6. Indossare occhiali di protezione laser.
7. Accendere il LED e il generatore di funzioni.
8. Attivare la leva del controller LED a 'Ext.' controllarlo dal generatore di funzione (Figura 1D).
9. Impostare il controller al 65% della potenza massima e il generatore di funzioni come onda sinusoidale, 4 Hz (Figura 1C).
10. Posizionare la piastra CuCl ₂ dal passo 2.5 senza coperchio sulla scena sotto il LED (Figura 1A </ Strong>).
11. Illuminare gli animali con luce blu per 30 minuti.
12. Trasferire i vermi in cerca sani per un piatto testa di serie come P _0.
    NOTA: Il numero desiderato di P ₀ dipende dal tipo di schermata. Vedere il punto 3 per un esempio. I P ₀ vermi possono sembrare essere scoordinato immediatamente dopo il trattamento della luce e si riprenderà nel corso del tempo.
13. Mantenere vermi coperti con un foglio in un incubatore o al buio; e seguire la procedura standard per iniziare lo screening fenotipi desiderati tra loro progenie ^2,10.

3. Esempio di uno screening genetico di andata

NOTA:. Questo è un esempio della schermata clonale con 120 genomi aploidi per verificare se il LED e la tensione funzionano figura 2 mostra uno schema del procedimento.

1. [Day1] Dopo il trattamento la luce blu, raccogliere cinque worm cerca sani su un piatto NGM con OP50 come P _0, tenerli in un 20 ° C incubatore, e far loro deporre le uova per 1D (targa '1 ° giorno').
2. [Day2] Trasferimento P ₀ su una nuova piastra di testa di serie (piastra 'Day2').
3. [Giorno 3] Raccogliere e uccidere P ₀ sulla targhetta 'Day2' bruciandoli.
4. [Day4] Raccogliere 30 gravido giovane adulto F ₁ dal piatto del '1 ° giorno' e trasferirli su singoli piatti (30 F ₁ Piano per '1 ° giorno').
5. [5 ° giorno] Ripetere il punto 3.4 per la targa 'Day2' (30 F ₁ piastre per 'Day2').
6. [Day7-9] Controllare le morfologie anormali e / o comportamenti di F ₂ vermi rispetto al ceppo WT (Figura 3a) allo stereomicroscopio standard quando diventano adulti.
   NOTA: A ereditarie mutazione mostra circa un quarto di vermi con lo stesso fenotipo tra F ₂ quando è recessiva con elevata penetranza. Tuttavia, alcuni mutanti possono crescere lentamente e / o mostrare penetranza parziale. Pertanto, è possibile che meno di un quarto dei mutanti può essere trovato unpiatto.
7. Raccogliere i vermi con fenotipi visibili individualmente e controllare l'ereditabilità del fenotipo nella prossima generazione.

4. Esempio di integrazione extrachromosomal Transgene

1. Iniettare il DNA di interesse in CZ20310 juSi164 [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparare i vermi transgenici con un basso tasso di trasmissione (10-30%), a seguito di un protocollo di ^12,13 iniezione standard.
   NOTA: In alternativa, gli array extracromosomici stabiliti possono essere attraversate in ceppi juSi164. Per evitare genotipizzazione per juSi164, eterozigoti juSi164 possono essere utilizzati come P ₀ malgrado l'efficienza potrebbe essere diminuita. Il metodo di genotipizzazione per juSi164 è descritta nel paragrafo 5.
2. [Day1] Trattare ~ 20 animali transgenici come P ₀ con luce blu come descritto al punto 2.
   NOTA: Più P ₀ vermi sono necessarie a seconda del TR tasso asmissione. Transgeni possono essere identificati da fenotipi o pennarello co-iniezione ^12,13.
3. Raccogliere 10 sano P cercando ₀ su piatti individuali, tenerli in un incubatore a 20 °, e far loro deporre le uova per un paio di giorni (P ₀ piastre)
4. [Day4] individuare 20 transgenici F ₁ vermi da ogni piatto P ₀ su piatti individuali e far loro deporre le uova. (20 F ₁ x 10 p ₀ piastre = 200 f ₁ piastre in totale.)
5. [Day7] Trova F ₁ piatti con> 75% F ₂ con transgeni.
6. Scegliere cinque animali transgenici dalla velocità di trasmissione> 75% F ₁ piastre (F ₂ piastre).
7. [Giorno10] Tenere F ₂ piastre con velocità di trasmissione di 100% come potenziali linee integrate.
8. Outcross le linee potenziali integrati utilizzando una procedura standard ¹⁰ per controllare la segregazione mendeliana e di togliere eventuali mutazioni di fondo.

Le "> 5. genotipizzazione

1. Lyse 20 outcrossed F ₂ vermi in tampone di lisi utilizzando un protocollo standard di ^14.
2. Eseguire PCR utilizzando i primer per l'inserimento MosSCI ^9, juSi164, (Tabella 1) con una temperatura di ricottura di 58 ° C seguendo un protocollo standard ^14.
   NOTA: Non è necessario genotipo unc-119 (ED3) perché unc-119 (ED3) può essere rilevato da un comportamento non coordinato dopo aver rimosso il transgene salvataggio (juSi164) nei seguenti passi 5.4 e 5.5.
3. Eseguire agarosio elettroforesi su gel ¹⁵ ed esaminare le dimensioni delle bande (Tabella 1) per trovare il WT per juSi164.
4. Esaminare se la progenie F ₂ ha paralizzato i vermi a causa dell'esistenza di unc-119 (ED3).
5. Se i vermi non coordinate si trovano sul gradino 5.4, singoli diversi vermi nonuncoordinated per ottenere tutti i vermi nonuncoordinated nella prossima generazione.

Risultati

Abbiamo condotto uno screening genetico in avanti con CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) con l'esposizione alla luce 30 minuti seguendo il protocollo standard descritto nelle sezioni 2 e 3. Tra 60 F ₁ piastre corrispondenti a 120 genomi aploidi mutagenizzate, abbiamo trovato 8 F ₁ piatti con F ₂ vermi che mostrano fenotipi visibili, come difetti dimensioni del corpo (figura 3B), il movimento scoordinato (Figura 3C),

Discussione

Qui, descriviamo una procedura dettagliata di mutagenesi optogenetic usando la sua-mSOG espresso nella linea germinale e fornire un esempio di uno screening genetico in avanti su piccola scala. Rispetto alla mutagenesi chimica standard, questo metodo di mutagenesi optogenetic ha diversi vantaggi. In primo luogo, non è tossico, mantenendo in tal modo il personale di laboratorio da mutageni chimici tossici come SME, ITA e trimethylpsoralen con la luce ultravioletta (TMP / UV). In secondo luogo, la procedura sperimentale ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K