히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

요약

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

초록

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

서문

앞으로 유전 화면이 널리 예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의) ^1과 모델 생물의 다양한 생물학적 과정을 방해 유전 적 돌연변이를 생성하는 데 사용되었다. 이러한 돌연변이의 분석은 기능적으로 중요한 유전자의 발견을 유도 및 시그널링 ^1,2 경로. 전통적으로, C.에서 돌연변이 유발 엘레은 돌연변이 유발 화학 물질, 방사선, 또는 트랜스포존 ^2를 사용하여 달성된다. 에틸 메탄 (EMS) 및 N - 에틸 N의 -nitrosourea (ENU) 인간에게 독성이 같은 화학; 감마선 또는 자외선 (UV) 방사선 돌연변이 특별한 장비를 필요로; 및 뮤 테이터 균주 ³ 등 트랜스포존 활성 균주, 유지 보수시 불필요한 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. 우리는 유 전적으로 인코딩 된 감광제 ^(4)를 이용하여 유전 변이를 유도하는 간단한 방법을 개발했습니다.

반응성 산소 종 (ROS)의 DNA ^5가 손상 ^될 수 있습니다.미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)는 LOV (빛, 산소 및 전압)에서 설계 한 106 아미노산 애기 phototropin ^2/6 도메인의 녹색 형광 단백질이다. 청색광 (~ 450 ㎚), miniSOG에 노출시 ROS는 모든 세포에 존재하는 보조 인자 ^6-8로 FL AVIN 모노 뉴클레오티드와 일 중항 산소를 포함한 생성한다. 우리는 히스톤-(72), C의 C 말단에 miniSOG에 태그를 지정하여 그의-mSOG 융합 단백질을 구성 히스톤 (3)의 엘레 변형 우리는 C.의 생식 세포에 그의-mSOG을 표현하는 단일 복사 유전자 ^(9)을 생성 엘레. 어둠 속에서 정상 배양 조건은 그의-mSOG 유전자 변형 웜은 정상 무리의 크기와 수명 ^{4 있습니다.} 블루 LED 빛에 노출되면, 그의-mSOG 웜은 자신의 자손 ⁴ 사이의 유전 변이를 생산하고 있습니다. T에 C : A와 G : C에 C : G, 작은 chromoso에 의한 돌연변이의 스펙트럼은 G와 같은 염기 변화를 포함날 ⁴ 삭제. 이 돌연변이 유발 절차를 수행하는 간단하고, 최소한의 실험 안전 설정을 요구한다. 여기, 우리는 optogenetic 돌연변이 유발을위한 LED 조명 설정 및 절차에 대해 설명합니다.

프로토콜

LED가 조명기 1. 건설

주 : 필요한 장비는 LED 자재 목록에 요약 하였다. 전체 LED 설치가 작고, 우리는이 웜 ^(4)의 빛 노출을 제어하는 어두운 방에 배치 할 것을 권장하지만, 실험실에서 삽입 될 수 있습니다.

1. 케이블 (그림 1A, D)와 컨트롤러에 LED를 연결합니다.
2. BNC 케이블 (그림 1A, C, D)와 디지털 함수 발생기 / 앰프 컨트롤러를 연결합니다.
3. 사용자 정의 홀더 (그림 1A)를 사용하여 스테이지 위의 LED 조명 10cm를 수정합니다.
   참고 : 우리는 금속 부품 홀더를했다.
4. 부분적으로 LED 조명 설치를 커버하지만, 웜 아프게 축열 (그림 1B)를 피하십시오.
   참고 : 우리는 개방 상단과 하단 (그림 1A)와 주문 제작 하드 플라스틱 커버를 사용합니다. 커버는 돌연변이 자체에 요구되지 않으며, t를 사용오 주위에 푸른 빛의 불필요한 노출을 제한합니다. 우리는 벌레의 과열을 방지하기 위해 LED 설치 완전히 (그림 1B)를 포함하지 않는 것이 좋습니다.
5. 레이저 보호 안경을 착용 할 것.
   주 : 빛이 매우 밝은이기 때문에 우리는 레이저 보호 안경을 착용하십시오. 선글라스가 잘 작동 할 수 있습니다.
6. 에 LED 컨트롤러의 레버 스위치 '지능을.' 연속 조명 (그림 1D)의 최대 전력 (그림 1C)의 65 %로 설정합니다.
7. 벌레는 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 배치 단계에있는 푸른 빛의 강도를 측정하는 광도계를 사용합니다. 설정은 연속 조명 아래 2.0 mW의 / mm ^{2를 제공합니다.}

2. 블루 라이트 치료

참고 :. 인증 기관은-UNC가-119 (+) Pmex-5-HIS-72 : miniSOG - 3'UTR (TBB-2) +] UNC-119 (ED3) III ⁴ 균주를 사용할 수있는 변형 CZ20310 juSi164를 사용하여 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터 (CGC에서, HTTP: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. E. 표준 선충의 성장 배지 (NGM)에 어둠 속에서 그의-mSOG의 피로를 유지 판 대장균 OP50 표준 프로토콜 ^{10, 11 다음.}
   참고 : 주변 광에 따라, juSi164 함유 균주가 자발적 비율 ⁴ 위의 돌연변이 속도를 표시하지 않습니다. 일반적뿐만 아니라 돌연변이를 일으키지 않는 할로겐 램프와 해부 범위를 사용 루틴 변형 통로. 그럼에도 불구하고, 치료는 표준 어두운 내부 배양기에서 긴장을 유지, 또는 호일로 변종을 포함, 예를 들어 빛에 불필요한 노출을 피하기 위해주의해야한다. 불필요한 돌연변이가 시간이 지남에 축적 경우를받은 후 균주의 분취 량을 동결하는 것이 좋습니다.
2. 임신하는 젊은 성인을 선택 웜으로 (약 12 시간 후 L4) 동물 ^{(11)을 선택합니다.}
   참고 : 오래된 동물이 낮은 무리의 크기를 가질 수있는 동안 젊은 동물, 이하 돌연변이 유발 효과 ^{4을 보여줍니다.}
3. 필터 페이지를 잘라조리개는 25mm X 25mm 사각형 구멍이있는 60mm 판에 맞게 및 시드 화 판 (그림 1E)에 배치합니다.
   주 : 사각형 펀치를 사용할 수 있지만, 펀치의 크기가 정확하지 않습니다.
4. 접시에 사각형 구멍에서 벌레를 제한 균등 필터 종이에 100 밀리미터의 CuCl _2의 100 μL를 삭제합니다.
5. 임신하는 젊은 성인 자웅 동체의 원하는 번호를 (예를 들어 3 단계 참조) 선택과의 CuCl ₂ 판의 중심에 전송할 수 있습니다.
6. 레이저 보호 안경을 착용 할 것.
7. LED와 함수 발생기 ON 전환합니다.
8. 에 LED 컨트롤러의 레버 스위치 '내선을.' 함수 발생기 (도 1D)가 그것을 제어한다.
9. 최대 전력의 65 %에서 컨트롤러와 사인파, 4 Hz에서 (그림 1C)와 같은 함수 발생기를 설정합니다.
10. LED가 (그림 1A <아래 단계에 뚜껑없이 단계 2.5에서의 CuCl ₂ 판을 배치/ STRONG>).
11. 30 분 동안 푸른 빛으로 동물을 조명.
12. P _0으로 시드 판에 건강한 찾고 웜을 전송합니다.
    참고 : P _0의 원하는 번호가 화면의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들어 3 단계를 참조하십시오. 는 P ₀ 벌레는 빛 치료 후 즉시 조정되지 않은 것으로 나타날 수 있으며, 시간이 지남에 따라 회복됩니다.
13. 인큐베이터이나 어둠 속에서 호일을 사용하여 적용 벌레를 유지; 그들의 자손 ^2,10 중 원하는 표현형을 심사 시작하는 표준 절차를 따르십시오.

순방향 유전 화면 3. 예

참고 :. 이것은 LED 및 변형이 작동하는지 확인하기 위해 120 반수체 게놈을 가진 클론 화면의 예입니다 그림 2는 절차의 개략도를 보여줍니다.

1. [첫째날] 푸른 빛을 처리 한 후, P _0으로 OP50와 NGM 판에 다섯 건강한 찾고 벌레를 선택 20 ° C 배양기에서 그들을 유지하고 그들에게 1 알을 낳기하자D ( '첫째날'판).
2. [둘째 날] 새 시드 판에 전송 P ₀ ( '둘째 날'판).
3. [Day3] 선택하고 레코딩하여 '둘째 날'접시에 P _공을 죽일.
4. [Day4]를 '첫째날'판에서 30 임신하는 젊은 성인 F _1을 선택하고 개별 플레이트 ( '첫째날'30 F ₁ 판)에 전송할.
5. '둘째 날'플레이트 [Day5] 단계를 반복 3.4 ( '둘째 날'30 F ₁ 판).
6. 그들이 성인이 될 때 Day7-9] 표준 실체 현미경 하에서 비정상적인 형태 학적 및 / 또는 WT 변형 (그림 3A)에 비해 F ₂ 웜의 동작을 확인합니다.
   참고 : 높은 침투와 열성이다 F ₂ 중 같은 표현형과 벌레의 내무반에 관한 유전 변이가 표시됩니다. 그러나 일부 돌연변이 천천히 성장 및 / 또는 부분적인 침투를 표시 할 수 있습니다. 따라서, 돌연변이 미만 분기가 발견 될 수있다플레이트.
7. 개별적으로 볼 수 표현형과 벌레를 선택하고 다음 세대의 표현형의 유전을 확인합니다.

염색체 외 형질 전환 유전자 통합 4. 예

1. A의 CZ20310 juSi164에 관심있는 DNA를 주입 [Pmex-5-HIS-72 : miniSOG - 3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) 및 준비 유전자 변형 벌레 표준 주입 프로토콜 ^12,13 다음 저 전송률 (10~30%).
   참고 : 또는 설립 염색체 외 배열이 juSi164 균주에 교차 할 수 있습니다. juSi164에 대한 유전자형을 방지하기 위해, juSi164의 이형 효율이 감소 될 수 있지만 P _0으로 사용될 수있다. juSi164 대한 유전자형 방법은 섹션 5에서 설명한다.
2. 2 단계에 설명 된대로 [첫째날] ~ 푸른 빛 P _0로 (20) 형질 전환 동물을 취급합니다.
   참고 : 더 P ₀ 웜은 그럴 필요에 따라 필요 ansmission 속도. 표현형은 유전자 또는 공사 출 마커 ^{(12, 13)에} 의해 식별 될 수있다.
3. 개인 접시에 10 건강한 찾고 P _{0 선택} 20 ° C 배양기에서 그들을 유지하고 며칠 (P ₀ 판)에 대한 알을 낳는하자
4. [Day4] 싱글 아웃 (20) 형질 전환 F ₁ 개별 플레이트 상에 각각 P ₀ 판에서 벌레와 그들이 알을 낳기 수 있습니다. (20 F ₁ × P ₀ 판 = 총 200 F ₁ 판).
5. [Day7] F에게> 75 % F ₂ 가지는 유전자 ₁ 판을 찾습니다.
6. F에게> 75 % 전송 속도에서 ₁ 판 (F ₂ 판) 오 형질 전환 동물을 선택합니다.
7. [Day10] F 잠재적 인 통합 선으로 100 %의 전송 속도 ₂ 판을 보관하십시오.
8. 멘델의 분리를 확인하고 잠재적 인 배경 돌연변이를 제거하기 위해 표준 ^절차를 사용하여 ⁽¹⁰⁾ 전위 집적 라인 교배.

제작 "> 5. 유전자형

1. 를 Lyse (20)는 표준 프로토콜 ^(14)을 사용하여 용해 완충액 F ₂ 웜 outcrossed.
2. 표준 프로토콜 ¹⁴ 다음 58 ℃의 어닐링 온도 MosSCI 삽입 ⁹ juSi164 (표 1)에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.
   주 : UNC-119 (ED3)가 다음 단계 5.4 및 5.5에서 구하고 트랜스 (juSi164)을 제거한 후 배위 동작에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 UNC-119 (ED3)를 유전자형 불필요하다.
3. 아가로 오스 겔 전기 영동 ^(15)을 실행하고 juSi164에 대한 WT를 찾기 위해 밴드 크기 (표 1)를 검사합니다.
4. 은 F ₂ 자손으로 인해 UNC-119 (ED3)의 존재에 벌레를 마비 경우 검사합니다.
5. 조정되지 않은 웜 단계 5.4에서 발견하는 경우, 하나의 여러 nonuncoordinated 웜은 다음 세대의 모든 nonuncoordinated 웜을 얻었다.

결과

우리는 120 돌연변이 반수체 게놈에 해당하는 60 F ₁ 판 중 섹션 2와 3에 설명 된 표준 프로토콜 다음 30 분 빛 노출을 사용 CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3)와 앞으로 유전자 화면을 수행, 우리는 8 F ₁ 판을 발견 F 등의 신체 사이즈 결함 (그림 3B), 조정되지 않은 운동 (그림 3C), 성인 치사 (그림 3D)으로 볼 수 표현형을 _표시?...

토론

여기서는 optogenetic 돌연변이의 상세한 절차는 그의-mSOG는 배아에서 발현 이용하여 소규모 순방향 유전 화면의 일례를 설명 제공. 표준 화학적 돌연변이 유발에 비해,이 optogenetic 돌연변이 유발 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 첫째, 이에 거리와 같은 EMS, ENU 같은 독성 화학 돌연변이에서 실험실 인력을 유지하고 자외선 (TMP / UV)와 trimethylpsoralen, 무독성이다. 둘째, 돌연변이 유발 실험 절차는 P _...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K