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Resumo

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Resumo

A medição da reactividade imunológica a antigénios do dador em receptores de transplante é provável que seja crucial para o sucesso redução ou interrupção do tratamento. A reacção mista de leucócitos (MLR), ensaios de diluição limitante, e o ensaio de trans-vivo hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) foram todas aplicadas a esta questão, mas estes métodos têm limitado a capacidade de previsão e / ou limitações práticas significativas que reduzem a sua utilidade. fluxo de imagem citometria é uma técnica que combina os poderes quantitativos multiparamétricos de citometria de fluxo com as capacidades de imagens de microscopia fluorescente. Recentemente, feito uso de uma abordagem por citometria de fluxo de imagem para definir a proporção de células T do receptor, capazes de formar sinapses imunes maduras, com as células apresentadoras de antigénio do doador (APCs). Usando um modelo de transplante de coração de rato bem caracterizada, que demonstraram que a frequência de in vitro sinapses imunes entre o t-APC Membreventos contato ane previu fortemente resultado do enxerto em rejeição, a tolerância, e uma situação onde a sobrevivência do transplante depende de células T reguladoras induzidas. A frequência dos contactos t-APC aumentou com células T de ratinhos, durante a rejeição aguda e diminuíram com as células T de murganhos que não responde prestados ao aloantigénio. A adição de células T reguladoras para o sistema in vitro reduzida prolongados contactos t-APC. Criticamente, este efeito também foi observado com policlonalmente humana expandida, que ocorre naturalmente células T reguladoras, que são conhecidos para controlar a rejeição de tecidos humanos em modelos de ratinho humanizados. Além disso o desenvolvimento desta abordagem pode permitir uma caracterização mais profunda do compartimento de células T alorreactivas do em receptores de transplantes. No futuro, o desenvolvimento e a avaliação deste método utilizando células humanas podem constituir a base de ensaios utilizados para seleccionar pacientes para minimização imunossupressão, e ele pode ser usado para medir o impacto de tolerogénioic terapias na clínica.

Introdução

O transplante de órgão sólido transformou o tratamento de doentes com doenças terminais do rim, fígado, coração, e pulmões. Devido às disparidades em maiores e menores de histocompatibilidade, no entanto, aloenxertos são prontamente rejeitados por células T do receptor se imunossupressores não são usados. Estes agentes têm numerosos efeitos adversos, incluindo os riscos de cancro e disfunção de órgãos. Um importante objectivo clínico é, portanto, para diminuir a dose de imunossupressão para o nível mínimo requerido para evitar a rejeição de aloenxertos. Este nível é susceptível de variar, dependendo do grau de activação do sistema imune inato; o grau de doador-receptor aloantigénio incompatibilidade; e as diferenças inter-pacientes em função imune, farmacocinética e farmacodinâmica.

Infelizmente, os clínicos de transplante não têm quaisquer ferramentas para avaliar com precisão a reactividade dador em doentes individuais 1. o mistoreacção de leucócitos (MLR) pode detectar reactividade doador, mas falha para prever de forma fiável resultado enxerto 2, 3. Ensaios de diluição limitantes, ELISPOTs de citoquinas, e o ensaio de trans-vivo quer medir um intervalo limitado de respostas ou não são práticos assinaturas 4, 5, 6, 7, 8 os perfis de expressão .Gene revelaram relacionados com a tolerância operacional 9, 10, 11, 12 e rejeição 13, 14, 15, mas estes nem sempre são generalizáveis entre populações 16 e podem em última análise, têm utilidade limitada em pacientes individuais. Analy baseada na sequênciases do receptor de células T (TCR) de células T no sangue periférico 17 ou proliferar na MLR 18 também têm sido desenvolvidos, mas requerem mais a validação.

Conceptualmente, seria desejável ter um ensaio que detecta os passos necessários primeiros na activação de células T destinatário por um antigénio do doador. Uma vez que a cultura de células ao longo do dia (como na MLR) pode introduzir produtos manufacturados, um tal teste, idealmente não iria requerer a medição de eventos a jusante, tais como a proliferação ou função efectora. De igual modo, no entanto, também seria desejável para o teste de depender de algum elemento de função de células T, pois as avaliações puramente descritivos (Por exemplo, sequenciação de TCR) pode ser incapaz de distinguir entre as células T anérgicas e funcionais.

Numerosos estudos indicam que o contacto prolongado t-APC é necessário para a formação de uma sinapse imune, que é um primeiro aspecto essencialpasso na resposta de células T 19, 20, 21, 22. Recentemente, relatou que, durante a dinâmica em imagiologia lapso de tempo in vitro, de cerca de 5 - 10% de rato células T CD4 + formar contactos de longa duração com células de osso alogénico derivadas de medula dendríticas (BMDCs) 23. A frequência de contacto prolongado foi aumentada em animais que rejeitaram um enxerto, ao passo que em ratinhos previamente tornada tolerante aos mesmos antigénios, manteve-se em níveis observados em ratinhos untransplanted 23. Interacções de longa duração foi reduzida na presença de receptor Tregs e aumento na sua ausência, e observou-se fenómenos semelhantes, utilizando células humanas T e DCs derivadas de monócitos alogénicos (MoDCs) 23.

No entanto, a enumeração de contactos prolongados feita dentro de um populatio de células T policlonaln é demorado e trabalhoso. Por isso, fez uso de imagens de citometria de fluxo para examinar a formação de sinapses imunológico alogênico. fluxo de imagem citometria incorpora as de aquisição de dados e análise de capacidades multiparamétricos de citometria de fluxo convencional com as habilidades de imagem de uma única célula de microscopia de fluorescência. Esta técnica foi utilizada por outros investigadores a estudar a formação de sinapses imune pelas células T monoclonais 24, 26, 27 ou na presença de superantigénios 28. Em tais configurações, no entanto, a frequência de células T que respondem varia de 30-100%, enquanto que as células T aloreactivas são geralmente estimado para representar 5-15% do total de repertório de células T 29, 30, 31, 32. Importante, nós mostramos que o fluxo de imagem citometria pode produzir avery medida comparável de alorreactiva frequência de células T 23 e que as alterações na frequência sinapse dentro de uma população de células T policlonais são preditivos de resultado do enxerto 23. Actualmente, esta abordagem tem sido optimizado para medir a aloreactividade directa de células T CD4 +, mas, em princípio, também poderia ser desenvolvido para analisar as células T CD8 + e da via indirecta. Aloreactividade indireta é acreditado para tornar-se cada vez mais relevante em tempos mais longos pós-transplante 33. Estamos actualmente a desenvolver este método a utilização de células humanas, o que permitirá testar em pacientes. Assim, no futuro, a abordagem geral pode ser útil para a avaliação funcional de respostas de células T em receptores de transplante, antes do transplante; imediatamente após o transplante; e, a longo prazo, quando a minimização da droga torna-se um objetivo importante.

Protocolo

1. Prepare Reagentes e materiais necessários

  1. Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) ( "tampão de lavagem"). Prepare PBS com FCS a 2% contendo 0,1% de detergente não iónico ( "tampão perm-lavagem"; ver a Tabela de Materiais). Prepare PBS com 1,5% de formaldeído.
    NOTA: CUIDADO! O formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno e deve ser tratado enquanto estiver usando o equipamento de protecção individual adequado.
  2. Prepare PBS contendo 2% de FBS e 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para a separação magnética de células ( "tampão MCS").
  3. Prepare a 50 ug / mL de isotiocianato de fluorescea-faloidina (faloidina-FITC) em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Prepara-se uma mancha nuclear de 1 mg / ml (por exemplo, 1 mg / ml de 7-aminoactinomycin D (7-AAD) em DMSO ou bis-benzimida corante; ver a Tabela de Materiais) em DMSO. Preparar anticorpos marcados com fluorocromo apropriado para as células de interesse ea imagiologia citómetro de fluxo.
  4. Obtenção de tecidos de origem animal (por exemplo, nódulos linfáticos e baço) como uma fonte de células T e tecidos animais alogénico (por exemplo, do baço e de medula óssea) como uma fonte de células de apresentação de antigénio ou células progenitoras.
  5. Preparar o meio de cultura de células (por exemplo, meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ou Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 10%), 50? M 2-mercaptoetanol, penicilina e estreptomicina e obter 24- e / ou 96- bem placas de cultura celular.

2. Preparar células apresentadoras de antigénio-

NOTA: Em teoria, qualquer população APC podia ser examinadas com este método. As células imaturas óssea de ratinho derivados da medula dendríticas (DC) como APCs foram processadas neste caso. existem muitos protocolos para gerar essas células (por exemplo, as referências 34 e 35). Resumidamente, foi utilizado o seguinte protocolo.

  1. medula nivelado a partir o fémur ea tíbia em RPMI 1640 ou DMEM.
  2. Passar as células em suspensão através de um filtro de células de 70 mícrons para remover pequenos pedaços de osso e detritos.
  3. Sedimentar as células por centrifugação e, em seguida, lisar as células vermelhas usando um tampão de cloreto de amónio durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Sedimentar as células por centrifugação (400 xg, 5 min) e ressuspender o sedimento celular.
  5. Lave as células em 5 - 10 mL de tampão de lavagem, pelete por centrifugação (400 xg, 5 min), e re-suspensão da pelota celular.
  6. Enriquecer precursores hematopoiéticos mais de uma coluna de separação de células por marcação das células com biotinilado anti-CD3 (5 ng / ml), anti-B220 (5 ug / ml), anti-MHC classe II (1 ug / mL) e anti-CD11b (/ ml 5 ug) anticorpos.
  7. Sedimentar as células por centrifugação (400 xg, 5 min) e re-suspensão da pelota celular.
  8. Incubar as células com microesferas magnicas anti-biotina (ver a Tabela de Materiais) a 4 ° C durante 10 min.
  9. Lavar e sedimentar as células (400 x g, 5 min) e re-suspend-os em 1 ml de tampão de MCS antes de remover as células marcadas utilizando uma selecção positiva (LS) coluna de separação magnética de células imunizadas com 3 mL de tampão de MCS e colocado no seu íman. Lavar a coluna 3 vezes com 3 mL de tampão de MCS; o escoamento irá conter as células desejadas.
  10. Cultura das células que passam através da coluna durante 6 dias em meio RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 2 ng / mL de recombinante de rato macrófagos de granulócitos factor de estimulação de colónia (GM-CSF) e 2 ng / mL de β1 do factor de crescimento transformante humano recombinante (TGF? 1) . Substituir metade do meio a cada 2 dias com meio completo fresco contendo 2 ng / ml de GM-CSF e TGF-? 1.
    NOTA: TGF? 1 humana tem actividade em células de camundongo. Os dados foram gerados utilizando estas DCs imaturas. Outras células (por exemplo, células B e DCs maduras) podem ser adequados como APCs, mas não foram testados neste ensaio.
  11. Criopreservar DCs em 90% de soro / DMSO a 10% e armazenar em azoto líquido; recuperar emdo dia de uso. Antes de usar, contar o número de DCs viáveis ​​em um hemocitômetro utilizando exclusão azul de tripano. Re-suspender o sedimento de células em meio de cultura a uma densidade adequada (ver passo 4.1) antes de serem utilizados na secção 4.

3. Preparar células T

  1. Utilizar métodos de selecção negativa, para evitar a transmissão de sinais de activação inadvertidamente ou inibitórias para as células.
    NOTA: Neste exemplo, as células T CD4 + são preparados para análise.
    1. Para preparar as células T CD4 + a partir do baço do rato, triturar o baço através de um filtro de células de 70 mícrons usando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro celular com tampão de lavagem.
    2. Sedimentar as células em suspensão por centrifugação (400 xg, 5 min) e, em seguida, efectuar a lise das células vermelhas por re-suspender o sedimento num tampão de cloreto de amónio durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Sedimentar as células por centrifugação (400 xg, 5 min) e re-suspender o sedimento.
    4. Lava-se a células em 5 - 10 mL de tampão de lavagem e sedimento por centrifugação (400 xg, 5 min). Re-suspender o sedimento.
    5. Corar as células com anticorpos biotinilados para CD8, complexo de histocompatibilidade principal de classe II (MHC II, 1 ug / ml), e CD19 (5 ug / ml). Incubar durante 10 min a 4 ° C.
    6. Lavam-se as células em 10 ml de tampão de lavagem e sedimento por centrifugação (400 xg, 5 min). Re-suspender o sedimento.
    7. Incubar as células com microesferas magnicas anti-biotina (ver a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Lavam-se as células em 10 ml de tampão de lavagem e sedimento por centrifugação (400 xg, 5 min); re-suspender o sedimento.
    9. Re-suspender as células em 1 ml de tampão de MCS e enriquecer as células T CD4 + através de uma coluna de separação de células magnético sensibilizados com 3 mL de tampão de MCS em um íman. Lavar a coluna 3 vezes com 3 mL de tampão de MCS. Coluna de escoamento irá conter as células T enriquecidas.
  2. Por cytome fluxo padrãotente, avaliar a pureza das células T utilizando-se uma alíquota das células seleccionadas negativamente. Corar as células utilizando um conjugado de estreptavidina-fluorocromo (para identificar quaisquer células marcadas com biotina que deveriam ter sido removidos da coluna) e um anticorpo ou anticorpos para identificar a população de células T de interesse (CD4 neste caso); uma pureza de ≥85% é aceitável 23.
    1. Contar as células T em um hemocitómetro de exclusão de azul de tripano (≥90% de viabilidade é aceitável).
      NOTA: tampão MCS contém EDTA, a qual deve ser removido antes do ensaio. Para alcançar este objetivo, sedimentar as células por centrifugação (400 xg, 5 min) e lava-se em 1 mL de tampão de lavagem. Sedimentar as células novamente (400 xg, 5 min) e re-suspensão em meio de cultura a uma densidade adequada (ver passo 4.1).

4. Co-incubar células T e DCs

  1. As células T e DCs de sementes numa proporção de 2: 1 T: proporção DC numa placa de cultura celular de 24 poços ou de 96 poços. Garanta que o volume da cultura final é ≤500 ul para placas de 24 poços ou ≤50 ul para placas de 96 poços.
    NOTA: Pequenos volumes encorajar as interacções célula-célula e permitir espaço para tampão de fixação posterior.
    1. Ajustar o número de células precisas empiricamente, mas como um guia geral, usar 1 x 10 6 culas T e 0,5 x 10 6 DC por poço (placa de 96 poços). Estes devem ser considerados o número mínimo de células, porque a utilização de menos células torna enumeração das sinapses imunes difíceis.
      1. Para aumentar o número de células, definir-se poços em duplicado e o tanque depois do passo 5 (fixação).
        NOTA: Quando da criação de poços em replicado, é aconselhável para semear DCs em todos os poços de primeiros e, em seguida, as células semente de T em todos os poços; isto minimiza discrepâncias no tempo de incubação entre poços.
  2. Incubar a placa durante 4 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2.
e_title "> 5. fixar as células em placa

  1. Adicionar 3 vezes o volume de cultura de 1,5% de formaldeído em PBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 30 min; tt é importante para fixar as células antes de as remover da placa para minimizar a perturbação das interacções célula-célula.
  2. Transferir as células na placa em tubos de lavagem e coloração subsequente. Nesta fase, as células retiradas adicionais para controlos de mancha-única. Para além destes controlos, toda a cultura deve ser corado com a mistura de anticorpos (ver o passo 4.1.1).

6. Células Stain

  1. células de manchas em 100 ul de tampão de lavagem contendo um cocktail de anticorpos fluorocromo-conjugados desejados durante 30 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
    NOTA: O cocktail inclui anticorpos específicos de células e específicos APC-T. Fluorocromos deve ser escolhido de tal modo que eles podem ser distinguidos utilizando a configuração da imagem citómetro de fluxo. em tele experiências mostradas aqui, azul-fluororo conjugado CD11b (5 ug / mL, ver a Tabela de Materiais) e CD90.2 APC conjugada (5 ug / ml) foram usadas.
  2. Lavam-se as células em 1 ml de tampão de lavagem e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Re-suspender as células em tampão de lavagem contendo perm-faloidina FITC a 0,05-0,5 ug / ml e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz.
    NOTA: As concentrações de faloidina-FITC de cerca de 0,1 ug / mL funcionar bem para células de ratinho, mas a concentração apropriada é esperada variar de acordo com o fornecedor, tipo de célula, e imagiologia citómetro de fluxo.
  3. Lavam-se as células em 1 ml de tampão de perm / lavagem e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Re-suspender as células em tampão de perm / lavagem contendo corante nuclear a uma concentração adequada (por exemplo, cerca de 25 ug / ml de 7-AAD) e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz.
  4. Lava-se a células em 1 mL de tampão de perm / lavagem e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Lavar as células uma vez em tampão de lavagem, pelete, e re-suspensão em 50 - 100 de tamp de lavagem, a transferência das células para pequenos, tubos de microcentrífuga tapados.
  5. Continuar a aquisição de dados imediatamente ou armazenar as células a 4 ° C protegida da luz durante até vários dias antes da aquisição de imagem sobre o citómetro de fluxo.
    NOTA: As células foram armazenadas com sucesso desta forma por até 7 dias. armazenamento mais longo pode ser possível, mas não foi testado.

7. adquirir dados

  1. Inicializar e configurar o fluxo de imagens citômetro de acordo com as instruções do fabricante. Assegurar a estabilidade do núcleo de fluxo antes da recolha de todos os dados.
  2. Reservar um canal para a aquisição de imagens de campo claro. Adquirir dados de controlo-mancha única com o canal de campo claro desligado.
    1. Clique no botão "Load" e inseta um tubo contendo uma amostra totalmente manchado (uma amostra que tenha sido manchado com todos os fluorocromos necessárias) para o suporte.
    2. Na janela "espaço de trabalho", seleccionar e criar um novo diagrama de dispersão, com a razão de aspecto da área ao longo dos singuletos e porta, onde a relação de aspecto é próximo de 1. Criar uma nova dispersão para cada canal utilizado (intensidade do canal no eixo horizontal) .
    3. Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e, se necessário, ajustar a tensão do laser na caixa de "Iluminação".
    4. Descarregar o tubo e carregar o primeiro tubo único-coradas.
    5. Na caixa "Configurações de Aquisição", digite o nome da amostra e definir o número de eventos que devem ser coletados; se é uma única mancha (para controles de compensação), 1.000 - 2.000 eventos são suficientes.
    6. Na caixa de "canais", seleccionar os canais que cada amostra tenha sido coradas com. Para os controlos-mancha única, todos os canais devem ser seleccionados com brightfield e dispersão lateral fora. Clique no botão "Record" sob a caixa "Aquisição"; quando o número de eventos atinge o limite especificado, a aquisição irá parar automaticamente.
    7. Clique no botão "Return" para descarregar o tubo. Repita os passos 7.2.4 - 7.2.6 para cada controle de mancha-única. Dependendo do citómetro e software, que pode não ser possível configurar todas as portas mostrado na Figura 1 durante a aquisição (mais de intermitcia preciso é realizada durante a análise; ver secção 8).
  3. Adquirir amostras como para as amostras individuais-corados (no passo 7.2), mas no quadro de "canais", seleccionar todos os canais que são necessários, incluindo o canal de campo claro.
    1. Antes de gravar dados, verificar para confirmar que a intensidade do canal é adequado para identificar as populações de células pretendidas. Se não, ajustar as configurações de laser e controles-mancha única regravar usando as novas configurações, conforme descrito na etapa 7.2.
    2. Para cadaamostra, adquirir várias dezenas de milhares de eventos.
      NOTA: Sob a maioria das condições, eventos de contacto célula-célula é uma pequena minoria do número total de células (a maioria são células individuais). Em geral, é desejável ter pelo menos 100 eventos no portão contacto membranar final.

8. Analisar os dados

  1. Analisar os dados adquiridos no fluxo de imagens citometria utilizando software analítico disponível gratuitamente a partir do site do fabricante (a conta de usuário deve ser criado; ver a tabela de materiais).

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Figura 1. Estratégia Gating usado para identificar aloreactiva imunitário sinapses. A. Em foco eventos são fechados a partir de todos os eventos, revendo imagens de células com base na raiz quadrada da média da taxa de mudança do perfil de intensidade da imagem (Gradiente RMS) usando o campo claro channel (Canal 4, CH04), como descrito no texto. B. Entre os eventos em foco, dupletos são distinguidas a partir de células individuais através da representação gráfica da relação de aspecto em relação a área para o canal de campo claro. células individuais são agrupados perto à relação de aspecto de 1 e tem uma área mais pequena, enquanto dupletos estão perto de 0,5 e tem uma área maior. C. A intensidade da fluorescência da APC (neste caso, um marcador de células dendríticas [DC], CD11c) é então representada graficamente contra a intensidade de fluorescência do marcador de células T (neste caso, CD90.2), e eventos de duplo-positivos são fechado. Fronteiras do portão pode ser refinado, revendo imagens de eventos perto das fronteiras. D. dupletos t-APC são então refinados de modo a que eles contêm apenas uma APC através da representação gráfica da relação de aspecto em relação a área do marcador APC (CD11c, CH02). Dupletos E. Estes single-APC são então refinados de modo a que eles contêm apenas uma célula T através da representação gráfica da relação de aspecto em relação a áreado marcador de células T (CD90.2, CH06). F. Finalmente, eventos que contêm apenas dois núcleos são seleccionados através da representação gráfica de um histograma da contagem de manchas no canal corante nuclear (7-AAD, CH05) e gating eventos que contêm apenas os pontos 2 7-AAD-positivos (isto é, núcleos). Os acontecimentos deste portão são analisados por contacto da membrana e formação de sinapses, como descrito na Figura 2. Os dados foram analisados de forma cega no que diz respeito à atribuição do tratamento e são de uma experiência anteriormente publicada em 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: A estratégia de intermitcia é descrita nesta secção e está representado na Figura 1. Análise do fluxo de imagem citometria de dados deve ser realizada de forma cega em relação à atribuição de tratamento. Embora acreditemos que as sinapses imunes e não-synaptic contactos são geralmente facilmente distinguidos (ver abaixo e as Figuras 2 e 3), cegando deve minimizar o viés decorrente da subjectividade inerente à análise de imagem.

  1. Gerar uma matriz de compensação por carregamento dos ficheiros de dados de controlo-mancha única para o assistente compensação. Depois de carregar os ficheiros individuais coradas, seleccionar os canais fluorescentes utilizadas na experiência.
    NOTA: O software gera automaticamente uma matriz de compensação, mas isso deve ser validada manualmente para garantir que as populações positivas corretos foram selecionados.
    1. Clique duas vezes em um valor na matriz e adicionar o gráfico para a área de análise. Criar uma nova porta se necessário excluir quaisquer células / dobletes / falsos positivos mortos; esta nova população positiva refinado pode ser seleccionado na caixa de matriz no menu para cada canal para baixo.
    2. Repetir este procedimento para cada canal. Clique em "Finish" para salvar o compensatiomatriz n (ficheiro .ctm).
  2. Obtenha um arquivo de análise de dados (.daf) do arquivo raw (.rif), carregando o arquivo .rif em software de análise e aplicação da matriz de compensação.
  3. Uma vez que os dados são carregados, executar gating para identificar eventos de contacto das células T-APC.
    NOTA: Uma estratégia típica gating envolve a identificação de eventos em foco, selecionando dobletes com base em critérios de tamanho (área versus razão de aspecto do evento), e selecionando dobletes células-APC T como eventos que são double-positivo para a célula T e marcadores de APC (Figura 1A-C).
    NOTA: A relação de aspecto é a razão entre a largura de um evento a sua altura, o que permite a discriminação de células individuais (razão de perto de 1) a partir de dupletos (razão de perto de 0,5).
  4. Identificar eventos em-foco traçando a raiz quadrada da média da taxa de variação do perfil de intensidade de imagem (RMS gradiente) no canal de campo claro (Figura 1A). Clique em the gradiente RMS histograma para exibir eventos celulares em caixas individuais e, em seguida, colocar um portão excluindo eventos fora de foco.
  5. Traça-se a área em função da relação de aspecto do canal de campo claro e desenhar um portão que identifica dupletos baseada na forma e tamanho (Figura 1B) evento. Revisão de imagens de eventos apenas dentro e fora da fronteira desta porta pode ajudar o analista a refinar o tamanho ea posição do portão. Em seguida, construir uma trama de estes eventos doublet em que a intensidade do marcador de células T aparece sobre um eixo e a intensidade do marcador APC aparece no outro. Desenhar um portão dupleto t-APC contendo eventos positivos para ambos os marcadores.
  6. Entre as células T APC doublet eventos, selecionar eventos que contêm apenas uma célula T e um APC.
    1. Fazer isso através da representação gráfica da relação de aspecto em relação a área para o marcador de APC e por gating em dupletos contendo um único APC (Figura 1D). Traça-se a relação de aspecto em relação a área de marca de células Ter e portão na dupletos contendo uma única célula T (Figura 1E).
      NOTA: O refinamento adicional pode ser alcançado através da representação gráfica de um histograma da função de contagem de manchas como aplicado a fluorescência corante nuclear e gating em eventos apenas com dois pontos (Figura 1F).
  7. Em alguns casos, as duas células dentro de um gibão não estará em contato; para identificar as células em contacto um com o outro, definir máscaras de objectos para as APCs e as células T.
    1. Use a opção "Máscaras" no menu Análise para abrir o gerente de Máscaras e definir uma nova máscara. Digite um nome, como "máscara objeto de células T". Clique no botão "Função" e, na caixa de diálogo, escolha "Objeto".
    2. Seleccionar o canal no qual o marcador de células T é detectada (por exemplo, CH06). Clique em "OK".
      NOTA: "Objeto (M06, CH06, Apertado)" é exibido na caixa de função. Esta máscara objeto padrão normalmente works bem, mas pode exigir otimização.
    3. Repetir este processo para criar uma máscara de objeto da APC no canal apropriado.
  8. Depois de identificar as máscaras de APC e de células T, determinar contacto membrana através da representação gráfica de células T marcador intensidade de fluorescência na máscara objecto APC contra APC intensidade de fluorescência na máscara objecto de células-T. Nesta parcela, desenhar uma porta que inclui apenas as células em contacto um com o outro.
    NOTA: Tipicamente, existem populações de duplos-positivos e duplo-negativo relativamente claros (Figura 2A). A fronteira entre as populações duplos-positivos e duplo-negativas pode ser definido por rever imagens de campo claro de células na região de fronteira para assegurar que as células em contacto estão dentro do portão e que as células que não estão em contacto, são excluídos.
  9. Nesta fase, rever manualmente as phalloidin imagens FITC de eventos dentro deste portão para distinguir sinapses imunes maduras de contato célula-célula simples. vocêif a função "imagens de marca" para marcar essas imagens.
    NOTA: A percentagem de eventos com tag (sinapses imunes) no interior desta porta pode ser utilizada como um índice de alorreactividade directa na população de células T a ser estudada.

Resultados

Este método foi utilizado para investigar alorreactividade de células T CD4 + em ratinhos tornaram tolerantes a aloantigénios doadores antes de transplante heterotópico de aloenxerto cardíaco. Ratinhos CBA (H-2 k) foi dado um protocolo de tolercia que consiste em um específico do doador (B6, H-2 b) transfusão de sangue combinado com um não-anticorpo que empobrecem células CD4 um mês antes de receber um transplante cardíaco B6. Este protocolo resulta em sobrevivência do aloenxerto de longo prazo que é dependente de células T reguladoras Foxp3 + 36, 37. Sete dias após o transplante, as células T CD4 + esplénicas foram obtidos a partir tornadas tolerantes e destinatários não tornados tolerantes de aloenxertos cardíacos e B6 foram co-incubadas com DC derivadas de medula óssea B6 de acordo com este protocolo. A Figura 2 mostra os dados representativos a partir desta experiência. O portão de contacto membrana é mostrada na Figura 2Uma, com mira verdes colocados sobre um evento sináptica (painel esquerdo, 1) e sobre um evento não-sináptica (painel da direita). A Figura 2B mostra os canais de campo claro e de fluorescência para este evento. Para reduzir a tendência, os dados foram analisados por um observador cego para atribuição do tratamento 23. Como mostrado em vários exemplos na Figura 3, tanto a partir de não tornados tolerantes (Figura 3A-B) e tornados tolerantes (Figura 3C-D) receptores CBA de corações B6, sinapses são facilmente distinguidos dos contactos não-sinápticos pela presença de uma crista de FITC-positivos densa na interface t-APC. Estes resultados mostram que a detecção visual de sinapses imunes realizadas por células T do receptor faixas com o grau de alorreactividade no receptor.

figure-results-2111
Figura 2. Identificação de t-APC Doublets com MembranaContato e formação de sinapses imunes. Os eventos no portão dupleto final (Figura 1F) são analisados. A. marcador de células T de fluorescência na máscara objecto APC é representada graficamente contra a APC fluorescência do marcador na máscara objecto DC. Alguns eventos doublet ter uma APC e uma célula T sem contato célula-célula e aparecem no canto inferior esquerdo da trama (imagens não mostrados). Um portão de contacto da membrana pode assim ser desenhada que inclui apenas dupletos em que as células T e APCs estão em contacto. As imagens de cada evento neste portão são analisadas quanto à evidência de rearranjo do citoesqueleto de actina no canal de faloidina-FITC e pode ser marcado usando o software de análise. O painel da esquerda indica um evento sinapse imune (identificada como 1 e indicado pela mira verdes), enquanto que o painel direita indica um evento de contacto da membrana, sem a formação de sinapses imune (marcado 2 e indicada por mira verdes). A determinação da formação de sinapses requer análise manual de estesimagens, mostrado em B. B. A linha de cima mostra as imagens de campo claro e de fluorescência de canal para um dupleto com uma sinapse imune (corresponde ao evento 1 em A); a linha inferior mostra um dupleto com contacto membrana mas sem formação de sinapses (corresponde ao caso 2 em A). Os dados foram analisados de forma cega no que diz respeito à atribuição do tratamento e são de uma experiência anteriormente publicada em 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4033
Figura 3. Exemplos de formação de T-APC sinapse. Ratinhos CBA receberam aloenxertos cardíacos provenientes de dadores B6 após quer sem pré-tratamento (AB) ou após a indução de tolerância com sangue total B6 sob a tampa de um anticorpo anti-CD4 não descartável ( rong> CD). Após 7 dias, as células T CD4 + esplénicas foram testados para a formação de sinapses com DCs B6. A. Três exemplos de dupletos não-sinápticas com contacto de membrana a partir de um animal não tornados tolerantes. B. Três exemplos de sinapses imunes a partir de um animal não tornados tolerantes. C. Três exemplos de dupletos não-sinápticas com contacto de membrana a partir de um animal tornados tolerantes. D. Três exemplos de sinapses imunológicas de um animal tornados tolerantes. a formação de sinapses é indicada pela presença de uma crista brilhante, FITC-positivos na interface t-APC (CH03). Os dados foram analisados de forma cega no que diz respeito à atribuição do tratamento e são de uma experiência anteriormente publicada em 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ays "> Anticorpo / Dye fluorocromo Canal Concentração CD11c eF450 CH02 5 ug / ml, titula empiricamente CD90.2 APC CH06 5 ug / ml, titula empiricamente phalloidin FITC CH03 0,05-0,5 ug / ml 7-AAD - cH05 25 ug / mL

Tabela 1. Os anticorpos e corantes utilizados neste estudo. anticorpos fluorocromo-conjugados, corantes, fornecedores, e as concentrações recomendadas são apresentados na tabela. O fluxo de imagiologia citómetro canal que foi utilizado para detectar cada fluorocromo também é mostrado na tabela.

Discussão

Fluxo de citometria de imagem foi usada para demonstrar a formação de sinapses imunológico entre as células T e APCs monoclonais ou na presença de superantigénios 24, 25, 26, 27, 28. Este método tira vantagem do facto de que depois de um T contacto célula-APC produtiva, a célula T reorganiza seu citoesqueleto de actina, polarizando-a para o local de contacto 21. Este rearranjo não ocorre sem a sinalização de TCR, e é, portanto, uma correlação inicial da activação de células T 19, 20, 21. O método aqui apresentado adapta-se esta abordagem para a medição de alorreactiva frequência de células T nas populações de células T policlonais. Como tal, ele pode, no futuro servir como a base para o desenvolvimento de ensaios para Reagentes doador ty em transplantes clínicos.

Embora comparações directas ainda não tiverem sido feitas, a detecção de alorreactivas sinapses imunes parece ter poder preditivo superior do que a MLR convencional. Por exemplo, trabalho anterior demonstrou que, no protocolo de tolercia descrito acima, os resultados de uma MLR falhar para correlacionar de forma fiável com o resultado do enxerto 2.

Um certo número de ensaios foram desenvolvidos para o estado operacionalmente tolerante em humanos 9, 10, 11, embora estes não medem a função celular efectora em resposta ao aloantigénio. Em contraste, a IFN? Ensaios ELISPOT função de células T efectoras 8 medida mas não pode captar o espectro completo de secreção de citoquinas que podem ser relevantes para a rejeição de aloenxertos aguda e crónica, tal como IL-17, 38,> 39. O ensaio de diluição limitante 4, que é um trabalho intensivo, e o ensaio in vivo de trans-6, que requer ratos, têm limitações práticas significativas que impedem a sua aplicação em um ambiente clínico. As recentes melhorias na análise de células de proliferação utilizando a análise da sequência de TCR de células T que respondem na MLR pode ser de valor, mas como o ensaio aqui apresentado, irá exigir uma validação adicional em estudos clínicos 18, 40.

Maior desenvolvimento do ensaio de detecção sinapse imunológico vai exigir que uma série de questões importantes ser respondida. Em primeiro lugar, o ensaio tal como foi desenvolvido só mede aloreactividade directa. A via directa envolve a apresentação de complexos de MHC / péptido alogénicos em APC derivadas do dador. Os últimos são geralmente eliminados rapidamente após o transplante, e ainda mais aloantigio apresentação é Carried fora por APCs que apresentam receptores doador intacta MHC (via semi-directa) ou antigénios do dador transformados em auto MHC (via indirecta). A via indirecta é um importante factor de rejeição crónica 33, 41.

Em princípio, deve ser possível detectar sinapses imunes indiretos com este ensaio, mas indiretamente alorreativas células T têm uma freqüência muito menor do que as diretas 42, 43, o que significa que será necessária a análise de um número maior de eventos. Uma segunda consideração é que temos apenas testado neste ensaio utilizando células T CD4 +, enquanto que as células T CD8 + são também uma componente importante da resposta anti-dador. Mais uma vez, deve ser possível de detectar sinapses CD8 + T cell-APC utilizando este método. Outra limitação é que o método requer a avaliação manual e análise de imagens de células no final, membportão contato Rane, e atualmente estamos trabalhando na automatização desta etapa.

Finalmente, o método requer testes e desenvolvimento em seres humanos, e estudos preliminares com amostras humanas estão actualmente a ser realizada. Além disso análise fenotípica subconjunto de células T (isto é, efectora, memória, reguladora, etc.) em combinação com a detecção de sinapses imunes em receptores de transplante representaria uma abordagem poderosa para a caracterização do repertório de células T alorreactivas e vai ser um foco importante para trabalho futuro.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

SCJ foi apoiado por uma Sociedade Internacional de Coração e Pulmão Transplante Research Fellowship e uma Royal College of Physicians e Surgeons of Canada Detweiler Viajando Fellowship.SM foi apoiado em parte por uma Sociedade Internacional de Coração e Pulmão Transplante Award Desenvolvimento de Carreira (para SCJ). SS foi apoiado pelo National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH é o destinatário de uma Kidney Research Fellowship UK Senior não-clínicos. Este trabalho foi financiado pelos seguintes subsídios a AB e KW: um Programa de Confiança Grant Wellcome (082519Z07Z), um coração britânico Foundation Grant Program (PG / 10 / 62,28504) e do Programa da UE Quadro 7 (Um estudo; BioDRIM). Os autores agradecem a Michael Parsons e da Facilidade de Citometria de Fluxo do núcleo do Instituto de Pesquisa Lunenfeld-Tanenbaum, Sistema de Saúde Sinai, Toronto para fornecer acesso a e apoio com o instrumento ImageStream Mark X.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered salineVariousVaries
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificAM9260G
Triton X-100 nonionic detergentSigma-AldrichX100
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
FormaldehydeSigma-AldrichF1635Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore sizeFisher Scientific08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichP5282
7-aminoactinomycin DThermo Fisher ScientificA1310Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2eBioscience17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11beBioscience48-0112Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3eBioscience13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class IIeBioscience13-5321
Biotinylated anti-mouse B220eBioscience13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8eBioscience13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19eBioscience13-0193
Anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS magnetic cell separatorMIltenyi Biotec130-042-302
recombinant mouse GM-CSFPeprotech315-03
recombinant human TGFβ1Peprotech100-21Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AImaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/AFree download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium VariousVaries
Fetal bovine serumVariousVaries
Cell culture platesVariousVaries

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