Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

Resumo

Nós pormenor um método para fabricar dispositivos microfluidicos tridimensionais à base de papel para uso no desenvolvimento de imunoensaios. A nossa abordagem para o dispositivo de montagem é um tipo de camadas múltiplas, de fabrico aditivo. Nós demonstramos um imunoensaio sanduíche para fornecer resultados representativos para esses tipos de dispositivos baseados em papel.

Resumo

Papel absorve fluidos autonomamente devido à ação capilar. Por padronização papel com barreiras hidrofóbicos, o transporte de fluidos pode ser controlada e orientada dentro de uma camada de papel. Além disso, empilhando camadas múltiplas de papel decorado cria sofisticadas redes microfluídicos tridimensionais que podem apoiar o desenvolvimento de ensaios analíticos e bioanalíticos. microcanais à base de papel são barato, portátil, fácil de usar, e não requerem equipamento externo para operar. Como resultado, eles são uma grande promessa como uma plataforma para diagnóstico point-of-care. A fim de avaliar adequadamente a utilidade e o desempenho analítico de dispositivos baseados em papel, devem ser desenvolvidos métodos adequados para assegurar o seu fabrico é reprodutível e a uma escala que é apropriado para ambientes de laboratório. Neste texto, um método para fabricar uma arquitectura geral do dispositivo que pode ser utilizado para os imunoensaios à base de papel é descrito. Nós usamos uma forma de manufacturin aditivog (laminação multi-layer) para preparar dispositivos que integram múltiplas camadas de papel decorado e adesivo padronizado. Além de demonstrar o uso correto desses dispositivos microfluídicos tridimensionais baseados em papel com um imunoensaio para gonadotrofina coriônica humana (hCG), erros no processo de fabricação que podem resultar em falhas do dispositivo são discutidas. Esperamos que esta abordagem para a fabricação de dispositivos baseados em papel vai encontrar ampla utilidade no desenvolvimento de aplicações analíticas projetadas especificamente para as configurações de recursos limitados.

Introdução

O papel é amplamente disponível numa gama de graus ou formulações, pode ser funcionalizado de modo a ajustar as suas propriedades, e podem transportar fluidos de forma autónoma, por acção capilar ou de drenagem. Se o papel é modelado com uma substância hidrofóbica (por exemplo, ^uma foto-resistente ou cera ^2), o que a absorção de fluidos pode ser controlada espacialmente dentro de uma camada de papel. Por exemplo, uma amostra aquosa pode ser aplicada dirigida para um certo número de zonas diferentes para reagir com reagentes químicos e bioquímicos armazenados dentro do papel. Estes dispositivos de microfluidos à base de papel tem sido demonstrado ser uma plataforma útil para o desenvolvimento de ensaios analíticos portáteis e barato ^{3, 4, 5, 6, 7.} Aplicações de dispositivos microfluídicos em papel incluem diagnósticos point-of-careef "> 8, a monitorização dos contaminantes ambientais ^9, a detecção de produtos farmacêuticos falsificados ^10, e cuidados de saúde deslocalizado (ou" telemedicina ") em recursos limitados definições ^11.

Múltiplas camadas de papel modelado podem ser montadas em um dispositivo integrado onde as zonas hidrofílicas de camadas vizinhos (ou seja, acima ou abaixo) se unem para formar redes fluídicos contínuas cujas entradas e saídas podem ser acoplados ou para a esquerda independente. ¹² Cada camada pode compreender um padrão único, o que permite a separação espacial dos reagentes e ensaios múltiplos a serem realizadas num único dispositivo. O dispositivo de microfluidos resultante tridimensional é não só capaz de fluidos de drenagem para permitir que os ensaios analíticos (por exemplo, a função hepática testa ¹³ e detecção electroquímica de pequenas moléculas de ^14), mas pode também supporta de uma série de funções sofisticadas (por exemplo, as válvulas ¹⁵ e simples máquinas ¹⁶⁾ comuns às abordagens microfluídicos tradicionais. Importante, porque o papel absorve fluidos por acção capilar, estes dispositivos podem ser operados com um mínimo esforço por parte do utilizador.

Uma vez que os reagentes podem ser armazenados no interior da arquitectura tridimensional de um dispositivo à base de papel, protocolos complexos pode ser reduzida a uma única adição da amostra aquosa de um dispositivo. Recentemente, foi introduzido um dispositivo de arquitectura tridimensional geral que pode ser utilizado para o desenvolvimento de imunoensaios à base de papel utilizando a técnica de cera-impressão para criar camadas padronizadas. ^{17, 18} Estes estudos concentraram-se sobre a forma como os aspectos relacionados com a concepção do dispositivo de número de camadas empilhadas utilizado, a composição das camadas, e o padrão da rede controlado-a por global de microfluidos tridimensionaldesempenho do imunoensaio. Em última análise, nós fomos capazes de usar essas regras de design para facilitar o rápido desenvolvimento de um imunoensaio multiplexado ^19. Neste manuscrito, um imunoensaio previamente desenvolvido para gonadotrofina coriônica humana (hCG; hormônio da gravidez) ¹⁷ é usado como um exemplo para ilustrar as estratégias que desenvolvemos para a montagem e fabrico de imunoensaios baseados em papel tridimensionais. Assim, vamos nos concentrar na montagem e operação de um dispositivo em vez do desenvolvimento de um ensaio.

Em um imunoensaio sanduíche, que é o formato utilizado para detectar hCG, um anticorpo de captura específico para uma subunidade da hormona é revestida sobre um substrato sólido, o qual é então bloqueado para limitar a adsorção não específica de uma amostra ou qualquer reagente subsequente. Este substrato é na maioria das vezes uma placa de micropoços de poliestireno (por exemplo, por um ensaio de imunossorvente ligado a enzima ou ELISA). A amostra é entãoadicionada a um poço e deixadas a incubar durante um período de tempo. Após lavagem rigorosa, é adicionado um anticorpo específico para a outra subunidade da hCG e deixado a incubar. Este anticorpo de detecção pode ser conjugado com uma partícula coloidal, enzima, fluoróforo ou a fim de produzir um sinal mensurável. O poço é novamente lavadas antes da interpretação dos resultados de um ensaio (por exemplo, utilizando um leitor de placas). Enquanto kits comerciais contam com este processo de vários passos que consomem tempo, todos estes passos podem ser executados rapidamente em microcanais à base de papel com um mínimo de intervenção para o utilizador.

O dispositivo utilizado para o imunoensaio hCG é composto por seis camadas activas, que são, de cima para baixo, utilizadas para a adição da amostra, armazenamento conjugado, incubação, captura, lavagem e blot (Figura 1). A camada de adição da amostra é feita de papel de filtro qualitativo. Isso facilita a introdução de uma amostra líquida e protege os reagentes na Laye conjugador de contaminação do ambiente ou de contacto acidental por parte do utilizador. A camada de conjugado (papel de filtro qualitativo) mantém o reagente produtor de cor (por exemplo, anticorpo, marcado com ouro coloidal) para o imunoensaio. A camada de incubação (papel de filtro qualitativo) permite que a amostra de viajar lateralmente dentro do plano do papel para promover a ligação do analito com reagentes antes de atingir a camada seguinte, a camada de captura. A camada de captura (membrana de nylon) contém ligandos específicos para o analito adsorvido ao material. Depois o ensaio é terminado, esta camada é revelada a permitir a visualização do imunocomplexo concluída. A camada de lavagem (papel filtro qualitativo) chama o excesso de líquidos, incluindo reagentes conjugados livres de distância da face da camada de captura para a camada de blot (papel de cromatografia de espessura). O dispositivo de seis camadas é realizada em conjunto por cinco camadas de adesivo padronizado, de dupla face: quatro camadas de adesivo permanente manter a integridade da assemdispositivo sangrados e uma camada de adesivo removível facilita a descamação do dispositivo para inspeccionar os resultados do imunoensaio na camada de captura.

Para o propósito deste manuscrito, que utilizam apenas as amostras de controlo positivas e negativas de hCG (0 mIU / ml e 81 mIU / mL, respectivamente) para se obter resultados representativos de um ensaio imunológico baseado em papel, o que permite uma discussão dedicado da relação entre métodos de fabricação e o desempenho de um dispositivo. Além de demonstrar como fabricar dispositivos com sucesso, destacam-se vários erros de fabricação que poderiam levar à falha de um dispositivo ou os resultados do ensaio irreproduzíveis. O protocolo e discussão detalhada neste manuscrito irá fornecer pesquisadores com informações valiosas sobre como imunoensaios baseados em papel são projetados e fabricados. Enquanto focamos a nossa demonstração sobre imunoensaios, antecipamos que as diretrizes aqui apresentadas serão de grande utilidade para a fabricação de Tridimensional de papel baseado em dispositivos microfluídicos.

Protocolo

1. Preparação de camadas Dispositivo de microfluidos baseados em papel

1. Prepare padrões para camadas de papel, nylon, e adesivo usando um programa de software de design gráfico. ⁶ Cada camada pode ter um padrão diferente.
   NOTA: O padrão pode incluir furos de alinhamento que não são necessários para um imunoensaio baseado em papel funcional, mas auxiliar com o fabrico de dispositivos reprodutível tridimensionais. Colocação destes furos vai diferir se os dispositivos são montados individualmente, em tiras, ou como folhas completas. O programa de software usado para projetar padrões podem variar de acordo com a escolha da técnica de padronização (por exemplo, fotolitografia, impressão de cera, ou corte). ⁶
2. Pulverizar a área de trabalho com uma solução de etanol a 70% (v / v) e água. Limpe a área de trabalho com uma toalha de papel limpa.

2. Preparação de camadas de papel: Amostra disso, Conjugado de armazenamento, incubação e Camadas Wash

1. Prepare camadas de papel de filtro qualitativo usando um grande cortador de papel de mesa. Corte uma folha estoque de papel em um tamanho de papel padrão para facilitar a padronização usando uma impressora (cera) de tinta sólida. Por exemplo, um único 460 x 570 ^mm2 de folha pode fazer 4 folhas de papel Carta EUA (8,5 x 11 polegadas ^2). Manusear papel com luvas limpas em todos os momentos para minimizar a contaminação.
2. Carregue uma folha solta de papel cromatografia na bandeja da impressora. Imprimir camadas previamente desenhados (ver Figura 1).
   NOTA: Um padrão pode ser impressos diretamente sobre esta folha usando a alimentação automática. Apenas uma folha de papel deve ser impresso em um tempo para evitar obstruções. Para todas as camadas, use as configurações de impressão "melhorado".

3. Preparação de nylon membrana da camada: Camada de captura

1. Cortar o rolo estoque de membrana de nylon em folhas (7,5 x 10 polegadas ²⁾ usando um cortador de papel de mesa. Tome muito cuidado no manuseamento do nylonmembrana para manter a sua integridade e proteger contra cópia. Armazenar qualquer material não utilizado em um armário secador, como membranas de nylon são sensíveis à umidade.
   NOTA: Corte as folhas são mais estreitas do que o papel Carta EUA. Porque as membranas de nylon são fina e frágil, que não pode ser processado pela impressora directamente e necessitam de apoio. Os detalhes são discutidos abaixo.
2. Utilizando uma impressora de cera, imprimir um padrão de camada de captura sobre um pedaço de papel de cópia e gravá-lo para uma caixa de luz para servir como um guia para o posicionamento da membrana de nylon. A caixa de luz auxilia o alinhamento de várias camadas.
3. Coloque uma folha de papel de cópia para a folha previamente impressa do papel de cópia. Tape a folha de papel em branco para a caixa de luz, mas não tape as duas folhas juntas.
4. Coloque uma folha solta de membrana de nylon para o pedaço de papel em branco cópia. Certifique-se de que cobre a membrana área impressa da camada de fundo do papel de cópia. Revestir todos os quatro lados da membrana de nylon para a folha limpade papel de cópia.
   NOTA: Certifique-se de que a membrana de nylon é plana e lisa de modo que não há problemas com a impressão (por exemplo, atolamentos de papel ou impressão desigual de cera). A cera pode ser impresso na fita em que a membrana de nylon está ligado ao papel de cópia. Se isso ocorrer, as áreas em que o nylon é incompletamente modelado, devido à cobertura de fita deve ser descartado. Para as preparações futuras, pedaços maiores de membrana de nylon pode ser utilizado para evitar este erro de impressão.
5. Coloque uma folha de membrana de nylon (apoiado pelo papel de cópia afixada a ele) no tabuleiro da impressora de alimentação manual. Imprimir apenas uma folha de membrana de nylon de cada vez.
   NOTA: Não existem etapas de preparação necessárias para a camada de mancha, uma vez que não é padronizado.

4. Criação de Barreiras hidrofóbicas na camada impressa

1. Fita as camadas impressas sobre uma moldura acrílica para um aquecimento uniforme de cima e por baixo da camada, quando colocado num forno de convecção a gravidade. Mantenha a membrana de nylon coladoa folha de suporte de papel de cópia até depois de a cera é fundida e hidrofóbicas são formadas barreiras.
   NOTA: O quadro acrílico é, um pedaço cortado a laser feito por encomenda de 1/2 ".. Plástico acrílico de espessura Dois tamanhos de quadro, dependendo do número de dispositivos que estão sendo fabricados foram utilizados A borda externa da moldura menor mede 11 5/8" x 2 3/4 ", e o orifício interno da armação mede 10 3/8" x 1 3/4 ". a fronteira exterior da estrutura maior mede 11 5/8" x 8 7/8 ", e o interior furo da armação mede 10 1/4 "x 7 7/8". o espaço aberto, permite ainda interior fusão da cera através de toda a espessura do papel.
2. Coloque as camadas no forno a 150 ° C durante 30 segundos até que a cera derrete na espessura do papel. Confirmar que a cera tem permeado a espessura do papel, agitando-o e verificação de imperfeições no design.
   NOTA: fornos de ar forçado ou placas quentes, também pode ser utilizado para fundir a tinta cera sólida. tempos de fusãoou temperaturas podem variar em função do método de aquecimento.
3. Remover o papel e a membrana de nylon a partir da moldura acrílica. Além disso, remova membrana de nylon da folha de suporte de papel de cópia.

5. Preparação de camadas adesivas

1. Padrão folhas frente e verso de folhas de cola usando uma plotter faca robótica, usando arquivos de projeto previamente preparado (passo 1.1). Proteger qualquer superfície adesiva exposta usando uma folha de forro de cera.
   NOTA: O adesiva de face dupla deve ser modelado com furos que permitem que a amostra flua através de camadas como uma via contínua fluídica. O revestimento de cera é facilmente removido do adesivo, e serve para a proteger da contaminação e rasgar durante o corte. Um cortador a laser ou morrer de imprensa também pode ser utilizado para camadas padrão de películas adesivas.

6. Backing de camadas de dispositivos com adesivo

1. Pulverizar a caixa de luz, com uma solução de 70% (v / v) de etanol e água. Limpe com um papel t limpaowel.
2. Tape uma camada padronizada de papel ou membrana de nylon que precisa ser feito com adesivo sobre a caixa de luz com o lado impresso para baixo.
3. Casca de um lado da camada protectora a partir da folha moldada de adesivo e apor à camada de papel ou membrana de nylon. Use a caixa de luz para garantir o alinhamento correcto dos padrões. Imprensa juntos. Coloque o dispositivo parcialmente montado em um deslizamento de proteção.
   NOTA: O deslizamento de proteção é um pedaço dobrado de laminação de cobertura de película que protege os dispositivos de contaminação ou danos, garantindo que eles não entrar em contato com os rolos laminadores.
4. Passe o conjunto de duas camadas, resultante através de um laminador automatizado para premir completamente o adesivo e de papel em conjunto, a remoção de quaisquer bolsas de ar a partir das camadas contíguas.
   NOTA: bolsas de ar entre as camadas do dispositivo pode interferir com a integridade do dispositivo e que a absorção reprodutibilidade, causando vazamentos.

7. Tratamento de Conjugado LAyer com reagentes para imunoensaios antes da montagem do dispositivo

1. conjugado camada de fita para um quadro de acrílico de modo a que a zona hidrófila a ser tratada é suspensa e não em contacto com a moldura.
2. Adicionar 2,5 uL de 100 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em 1x tampão fosfato salino (PBS) para a zona hidrófila na camada do conjugado. Deixar secar à temperatura ambiente durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante 5 min.
   NOTA: Este volume é apenas o suficiente para molhar a zona do papel. A solução de BSA ajuda a evitar a agregação das nanopartículas coloidais durante o processo de secagem, o que irá facilitar a libertação das nanopartículas quando o papel e os reagentes são re-hidratadas pela amostra.
3. Adicionar 5 uL de 5 OD coloidal de nanopartículas de ouro conjugadas com anticorpo anti-hCG-β, e repetir o processo de secagem.
   NOTA: As unidades de concentração de nanopartículas de ouro coloidal são frequentemente expressos em densidade óptica (DO) medida pelo absorbance em λ = 540 nm. Nenhum tratamento é necessário para o bloco pavio antes da montagem do dispositivo no ponto 10.

8. Tratamento de Canal Lateral com Reagente para imunoensaios antes da montagem do dispositivo

1. Fita camada de canal lateral, para um quadro de acrílico de modo a que a zona hidrófila a ser tratada é suspensa e não em contacto com a moldura.
2. Adicionar 10 ul de agente de bloqueio (5 mg leite não gordo / mL e 0,1% (v / v) de Tween 20 em PBS 1x) para tratar o canal lateral. Repetir o mesmo processo de secagem (2 min à temperatura ambiente e depois a 65 ° C durante 5 min) como a camada de conjugado.

9. O tratamento da camada de captura com reagentes para imunoensaios antes da montagem do dispositivo

1. camada de captura de fita para um quadro de acrílico de modo a que a zona hidrófila a ser tratada é suspensa e não em contacto com a moldura.
2. Tratar a camada de captura com 5 uL de 1 mg / ml de anticorpo anti-α-hCG e, em seguida, permitir que oamostra secar à temperatura ambiente durante 2 min, seguido por 8 min a 65 ° C.
3. Adicionar 2 mL de agente de bloqueio (5 mg / ml de leite sem gordura e 0,1% (v / v) de Tween 20 em PBS 1x). Repetir o processo de secagem para a camada de captura.
   NOTA: Este valor é adequado para revestir os artigos sem a oclusão dos poros da membrana de nylon, o que pode acontecer quando um excesso de um agente muito bloqueio é usado.

Microfluídicos em suporte de papel 10. Assembly of Three-dimensional

1. Tape a camada de lavagem para a caixa de luz (o lado impresso virado para cima). Se forem utilizados furos de alinhamento, removê-los a partir de camadas subsequentes usando uma ferramenta do furador de mão.
2. Remover a película de protecção sobre a parte de trás da camada de captura para expor o adesivo. Alinhar a camada de captura de acima da camada de lavagem utilizando os furos de alinhamento como uma guia. Pressione as duas camadas em conjunto. Evitar tocar zonas hidrofílicas para minimizar a contaminação, ou danos no dispositivo. Pinças podem ser utilizados para auxiliar assembly.
3. Remover a película de protecção sobre a parte de trás da camada de incubação para expor o adesivo. Alinhe a camada de incubação acima da camada de captura e pressioná-los juntos. Continuar a adicionar camadas desta maneira até que todas as camadas activas são montados.
4. Coloque o dispositivo parcialmente montado em um deslizamento de protecção e firmemente apor as camadas em conjunto, utilizando um laminador.
5. Remover a película de protecção sobre a parte de trás da camada da lavagem e fixar a camada de mancha para a parte inferior do dispositivo. etapa de laminação Repita 10,4 para completar a montagem do dispositivo microfluídico baseado em papel tridimensional. Corte desejado número de dispositivos a partir de tiras ou folhas de dispositivos totalmente montados usando uma tesoura.
   NOTA: folhas inteiras de dispositivos, as tiras de dispositivos ou dispositivos individuais podem ser preparados utilizando uma abordagem similar.

11. Realizar um imunoensaio baseado em papel

1. Adicionar 20 ul de uma amostra para a zona hidrófila na parte superior do dispositivo (isto é, Tele provar layer).
2. Esperar para a amostra de pavio completamente para dentro do dispositivo, em seguida, adicionar 15 ul de tampão de lavagem (0,05% v / v de Tween 20 em solução salina tamponada 1x com fosfato). Após a primeira aliquota de tampão de lavagem tem mau completamente para dentro do dispositivo, adicionar uma segunda aliquota de 15 ul de tampão de lavagem.
   NOTA: O tampão de lavagem tem mau completamente para dentro do dispositivo quando a gotícula de líquido ter desaparecido, não mostrando nenhum menisco na superfície do papel. O ensaio é concluído quando a segunda aliquota de tampão de lavagem tenha entrado completamente o dispositivo.
3. Para revelar o resultado do ensaio, descascar as três camadas de topo do dispositivo utilizando uma pinça para expor a camada de captura.
   1. Interpretar os resultados do ensaio qualitativamente por observação da presença ou ausência de cor. Alternativamente, a imagem da camada de leitura usando um scanner de desktop e uso de imagem do software de processamento ou algoritmos para quantificar os resultados e caracterizar as distribuições de intensidade dentro de umzona de detecção. ²⁰

Resultados

A obtenção de desempenhos de ensaio reprodutíveis em microcanais tridimensionais à base de papel baseia-se num método de fabricação que garante a consistência entre os dispositivos. Para atingir este objetivo, nós identificamos um número de processos de fabricação e considerações materiais, e discuti-los aqui no contexto de demonstrar um imunoensaio baseado em papel. Usamos um método de impressão de cera de modo a formar barreiras hidrófobos dentro de dispositivos de mic...

Discussão

Identificação de uma estratégia de produção reproduzível é uma componente essencial do desenvolvimento do ensaio. ²² Usamos uma camada por camada de abordagem sequencial, para a fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensionais baseados em papel. Em contraste com os métodos que se aplicam de dobragem ou origami técnicas para produzir dispositivos de multicamadas a partir de uma única folha de papel ^{23, 24} de fabrico a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illustrator CC	Adobe		to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer	Amazon	B00R92C9DI	to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven	Fisher Scientific	15-103-0509	to melt wax into paper
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator	Amazon	B00AXHSZU2	to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter	Graphtec America	CE6000-40	to pattern adhesive films
Swingline paper cutter	Amazon	B0006VNY4C	to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner	Amazon	B000VG4AY0	to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch	McMaster-Carr	3488A9	to remove alignment holes
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)	Fisher Scientific	05-714-4	to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size )	Pall Corporation	NBCHI3R	to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF021621	to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF051521
wax liner	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	to assist with patterning adhesive
acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	to fabricate frame
self-adhesive sheets	Fellowes	CRC52215	to use as protective slip
absolute ethanol	VWR	89125-172	to sanitize work area
bovine serum albumin	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls	Fisher Scientific	22-071-066	to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1)	Arista Biologicals	CGBCG-0701	to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody	Arista Biologicals	ABACG-0500	to treat capture layer
10X phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid skim milk powder	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147