Изготовление Трехмерная бумаги на основе микрожидком Устройства для иммуноанализа

Резюме

Мы подробно метод для изготовления трехмерных бумажных микрожидкостных устройств для использования в разработке иммуноанализа. Наш подход к сборке устройства представляет собой тип многослойной структуры, добавка производства. Мы демонстрируем сэндвич иммуноанализа для получения репрезентативных результатов для этих видов бумажных устройств.

Аннотация

Бумага фитили жидкости автономно за счет капиллярного действия. По кучность бумаги с гидрофобными барьерами, транспортировка жидкостей может контролироваться и направляться в слой бумаги. Кроме того, укладка нескольких слоев бумаги узорной создает сложные трехмерные микрожидкостных сети, которые могут поддержать развитие аналитических и биоаналитических анализов. Бумага на основе микрофлюидальные устройства недороги, портативный, легкий в использовании и не требуют внешнего оборудования для работы. В результате, они имеют большие перспективы в качестве платформы для точки оказания медицинской помощи диагностики. Для того, чтобы правильно оценить полезность и аналитическую производительность бумажных устройств, подходящие методы должны быть разработаны для обеспечения их производство является воспроизводимым и в масштабе, который подходит для лабораторных установок. В этой рукописи, способ для изготовления общей архитектуры устройства, которое может быть использовано для бумажных иммуноанализа описывается. Мы используем форму аддитивной изготовления уг (многослойное ламинирование) для подготовки устройства, которые содержат несколько слоев узорной бумаги и узорной клея. В дополнение к демонстрации надлежащего использования этих трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств с иммуноанализа для хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), ошибки в процессе производства, что может привести к отказам устройств обсуждаются. Мы ожидаем, что этот подход к технологии производства бумаги на основе устройства найдут широкое применение в разработке аналитических приложений, разработанных специально для условиях ограниченных ресурсов.

Введение

Бумага широко доступен в диапазоне составов или классов, могут быть функционализированные для настройки его свойств, и может транспортировать жидкости автономно под действием капиллярных сил или впитывания. Если бумага с рисунком с гидрофобным веществом (например, фоторезист ¹ или воск ^2), впитывающее жидкости можно регулировать в пределах пространственно слоем бумаги. Например, приложенное водный образец может быть направлен на ряд различных зон, чтобы вступать в реакцию с химическими и биохимическими реагентами, хранящимся в бумаге. Эти бумажные микрофлюидальные устройства были продемонстрированы , чтобы быть полезной платформой для разработки портативных и недорогих аналитических анализов ^{3, 4, 5, 6, 7.} Применение бумажных микрофлюидальных устройств включают в себя пункт-ухода диагностикиэф "> 8, мониторинг загрязнителей окружающей среды ^9, обнаружение поддельных лекарственных средств ^10, и делокализованы здравоохранения (или" телемедицина ") в ограниченных ресурсов установки ^11.

Несколько слоев узорчатой бумаги могут быть собраны в единое устройство , где гидрофильные зоны из соседних слоев (то есть, выше или ниже) подключаются к образуют непрерывные жидкостных сети , чьи входы и выходы могут быть соединены или влево независимыми. ¹² Каждый слой может содержать уникальный шаблон, который позволяет пространственное разделение реагентов и нескольких анализов , которые должны выполняться на одном устройстве. В результате трехмерная Микрожидкостных устройство не только способны впитывания жидкости, позволяющие аналитических анализов (например, функция печени тесты ¹³ и электрохимическую обнаружение малых молекул ^14), но он может также вирпорт ряд сложных функций (например, клапаны ¹⁵ и ¹⁶ простых машин) , общие для традиционных микрофлюидальных подходов. Важно отметить, что из-за бумаги фитили жидкости под действием капиллярных сил, эти устройства могут работать с минимальными усилиями со стороны пользователя.

Поскольку реагенты могут быть сохранены в пределах трехмерной архитектуры бумажной основе устройства, сложные протоколы могут быть сведены к одному добавлением водного образца к устройству. Недавно мы представили общую архитектуру трехмерное устройство, которое может быть использовано для разработки бумажных иммуноанализа с использованием метода восковой печати для создания узорных слоев. ^{17, 18} Эти исследования были сосредоточены на том , как аспекты , связанные с конструкцией устройства-количества наложенных друг на друга слоев используется, состав слоев, и образец трехмерной микрожидком сети под контролем общей перпроизводительности таких иммуноанализа. В конечном счете, мы смогли использовать эти правила проектирования для содействия быстрому развитию мультиплексированного иммуноанализа ^19. В этой рукописи, ранее разработанная для иммунологического анализа хорионического гонадотропина человека (ХГЧ; беременность гормон) ¹⁷ используется в качестве примера для иллюстрации стратегий , которые мы разработали для сборки и изготовления трехмерных бумажных иммуноанализа. Соответственно, мы ориентируемся на монтаже и эксплуатации устройства, а не разработке анализа.

В сэндвич иммуноанализа, который является форматом, используемым для обнаружения ХГЧ захвата антитела, специфичные к одной субъединице гормона наносят на твердую подложку, которая затем блокируют, чтобы ограничить неспецифической адсорбции образца или любого последующего реагента. Этот субстрат является наиболее часто полистирольный планшета дл (например, для твердофазного иммуноферментного анализа или ELISA). Затем образецдобавлены в лунку и оставляли выдерживаться в течение определенного периода времени. После тщательного промывания добавляют антитело, специфичное к другому субъединицей ХГЧ и позволили инкубировать. Это антитело обнаружения может быть конъюгирован с коллоидной частицы, фермент или флуорофором с целью получения измеримого сигнала. Хорошо снова промывают до интерпретации результаты анализа (например, с использованием планшет - ридера). В то время как коммерческие наборы полагаться на этот многоступенчатой ​​трудоемкий процесс, все эти шаги могут быть быстро выполнены в бумажной основе микрожидкостных устройств с минимальным вмешательством к пользователю.

Устройство , используемое для ХГЧ иммунологического анализа включает в себя шесть активных слоев, которые, сверху вниз, используемые для добавления образца, сопряженного хранения, инкубации, захвата, промывка и блоттинга (рисунок 1). Образец дополнение слой изготовлен из качественной фильтровальной бумаги. Это облегчает введение жидкого образца и защищает реагенты в сопряженном ЛэR от загрязнения из окружающей среды или случайного контакта пользователем. Сопряженная слой (качественный бумажный фильтр) держит цвет по производству реагента (например, коллоидное золото-меченых антител) для иммуноферментного анализа. Инкубационный слой (качественный фильтровальная бумага) позволяет образец путешествовать в боковом направлении в пределах плоскости бумаги, чтобы способствовать связыванию аналита с реагентами до достижения следующего слоя, слой захвата. Слой захвата (нейлоновую мембрану) содержит лиганды, специфичные для анализируемого вещества, адсорбированного на материале. После того, как анализ завершен, то этот слой раскрывается для того, чтобы визуализировать законченного иммунокомплексными. Мыть слой (качественный фильтр бумаги) привлекает избыток жидкости в том числе свободных сопряженных реагентов вдали от поверхности слоя захвата в блот слой (толщиной хроматографической бумаги). Устройство шестислойный проводится совместно пятью слоями узорчатого, двухстороннюю клейкую: четыре слоя клея постоянного поддержания целостности ASSEMкровоточили устройство и один слой съемного клея облегчает отслаивание устройства для проверки результаты иммунологического анализа на слое захвата.

Для целей этой рукописи, мы используем только положительные и отрицательные контрольные образцы ХГЧ (0 мМЕ / мл и 81 мМЕ / мл, соответственно) для получения репрезентативных результатов бумажной основе иммуноферментного анализа, что позволяет специальный обсуждение взаимосвязи между способы изготовления и производительность устройства. В дополнение к демонстрации того, как успешно производить устройства, мы выделяем несколько производственных ошибок, которые могут привести к выходу из строя устройства или невоспроизводимых результатов анализа. Протокол и обсуждение подробно в этой рукописи предоставит исследователям ценную информацию о том, как на бумажной основе иммунологические разработаны и изготовлены. В то время как мы фокусируем нашу демонстрацию на иммуноанализа, мы ожидаем, что принципы, представленные здесь, будут широко полезны для изготовления трех-Дименасиональных на бумажной основе микрожидкостных устройств.

протокол

1. Подготовка слоев микрожидкостных устройств на бумажной основе

1. Подготовка моделей для слоев бумаги, нейлона и клея с помощью графической программы проектирования программного обеспечения. ⁶ Каждый слой может иметь различный характер.
   Примечание: Шаблон может включать в себя отверстия выравнивания, которые не требуются для функционального бумажной основе иммуноферментного анализа, но помочь с воспроизводимым изготовления трехмерных устройств. Размещение этих отверстий будет отличаться, если устройства собраны в индивидуальном порядке, в лентах или в виде полных листов. Программа программное обеспечение , используемое для разработки моделей может варьироваться в зависимости от выбора метода структуризации (например, фотолитографии, воск печати или резки). ⁶
2. Брызги рабочую зону с раствором 70% (об / об) этанола и воды. Протрите область работы с чистым бумажным полотенцем.

2. Подготовка слоев бумаги: Примеры того, Сопряженно хранения, инкубирование и умой Слои

1. Подготовьте слои качественной фильтровальной бумаги, используя большой резак настольный бумаги. Вырезать фондовый лист бумаги в стандартный формат бумаги для облегчения кучность с использованием твердых чернил (воск) принтер. Например, один 460 х 570 мм ² лист может сделать 4 листа бумаги US Letter (8,5 х 11 дюймов ^2). Ручка с бумагой чистые перчатки в любое время, чтобы свести к минимуму загрязнение.
2. Загрузите вырезать лист хроматографической бумаги в лоток принтера. Печать ранее разработанные слои (рисунок 1).
   Примечание: Шаблон может быть напечатан непосредственно на этом листе, используя автоматическую подачу. Только один лист бумаги должен быть напечатан в то время, чтобы избежать застревания бумаги. Для всех слоев, используйте "Enhanced" параметры печати.

3. Получение нейлоновой мембраны Layer: Capture Layer

1. Вырезать фондовый рулон нейлоновую мембрану на листы (7,5 х 10 дюймов ²⁾ с помощью резака бумаги столешница. Соблюдайте осторожность при обращении с нейлономмембраны для поддержания его целостности и защиты от копирования. Храните неиспользованную материал в эксикаторе шкафу, так как нейлоновые мембраны чувствительны к влаге.
   Примечание: Обрежьте листы являются более узкими, чем US Letter бумаги. Поскольку нейлоновые мембраны являются тонкими и хрупкими, они не могут быть обработаны с помощью принтера непосредственно и требуют поддержки. Подробности описаны ниже.
2. С помощью воска принтер, распечатать шаблон захвата слоя на лист бумаги для копирования и ленты ее светового короба, чтобы служить в качестве руководства для позиционирования нейлоновой мембраны. Светлая коробка помогает выравнивание нескольких слоев.
3. Поместите чистый лист бумаги для копирования на ранее напечатанного листа бумаги для копирования. Лента чистый лист бумаги к светлой коробке, но не магнитофоны два листа вместе.
4. Поместите форматный лист нейлоновой мембраны на чистый лист бумаги для копирования. Убедитесь, что мембрана закрывает печатную площадь нижнего слоя бумаги для копирования. Лента все четыре стороны нейлоновой мембраны для чистого листабумаги для копирования.
   Примечание: Убедитесь , что нейлоновая мембрана является плоской и гладкой , так что нет никаких проблем с печатью (например, замятия бумаги или неравномерной печати воска). Воск может быть напечатано на ленте, где нейлоновые мембраны, прикрепленной к копировальной бумаги. В этом случае, области, где нейлон неполностью узорчатые из-за покрытия на магнитной ленте должны быть отброшены. Для будущих препаратов, более крупные куски нейлоновой мембраны могут быть использованы, чтобы избежать этой ошибки печати.
5. Загрузите лист нейлоновой мембраны (поддерживаемый копировальной бумаги, прикрепленному к нему) в лоток ручной подачи принтера. Печать только один лист нейлоновой мембраны одновременно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет никаких шагов по подготовке необходимых для блот-слоя, так как он не по образцу.

4. Создание гидрофобные барьеров в напечатанном слое

1. Лента отпечатанные слои на акриловой рамки для равномерного нагрева выше и ниже слоя при помещении в гравитационный конвекционной печи. Держите нейлоновую мембрану приклеенный кподдержка листа бумаги для копирования до после того, как воск плавится и образуются гидрофобные барьеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: акриловая рамка представляет собой выполненное на заказ, лазерная резка кусок 1/2 ".. Толстый оргстекла двух размеров в зависимости от количества устройств, изготовленных были использованы внешняя граница меньшего кадра измеряет 11 5/8" х 2 3/4 ", а внутреннее отверстие рамы измеряет 10 3/8" х 1 3/4 ". внешняя граница большего кадра измеряет 11 5/8" х 8 7/8 ", а внутренний отверстие рамы измеряет 10 1/4 "х 7 7/8". открытая, внутреннее пространство позволяет даже плавлении воска по всей толщине листа.
2. Поместите слои в печи при 150 ° С в течение 30 секунд до тех пор, пока воск не растает в толщине бумаги. Убедитесь, что воск пронизана толщину бумаги, повернув его и проверяя несовершенства конструкции.
   Примечание: Принудительный печи воздух или горячий пластины также могут быть использованы для плавления твердого воска чернил. раз плавильныеили температуры могут варьироваться в зависимости от способа нагрева.
3. Извлеките бумагу и нейлоновую мембрану из акрилового кадра. Кроме того, удалить нейлоновую мембрану из опорного листа бумаги для копирования.

5. Подготовка адгезивных слоев

1. Pattern Двухсторонняя листы клейкой пленки с использованием роботизированного ножа плоттера, используя проектные файлы, предварительно подготовленный (шаг 1.1). Защитите любую открытую клейкую поверхность, используя лист воска лайнера.
   Примечание: Клеевой двухсторонний следует узорной с отверстиями, позволяющими образец течь через слои в виде непрерывного струйного пути. Воск вкладыш легко удаляется из клея, и служит для защиты от загрязнения и разрывам во время резания. Резак лазер или умирают пресса также могут быть использованы для формирования рисунка слоев клейкой пленки.

6. Подложка из слоев устройства с помощью клейкой

1. Спрей световую коробку с раствором 70% (об / об) этанола и воды. Протрите чистой бумаги тOwel.
2. Лента фигурным слоем бумаги или нейлоновой мембраны, которая должна быть подкреплена с клеем на световом коробе с отпечатанной стороной вниз.
3. Пил одну сторону защитной гильзы из узорчатого листа клея и прикрепить его к слою бумаги или нейлоновой мембраны. С помощью светового короба, чтобы обеспечить надлежащее выравнивание моделей. Сжать. Поместите частично собранное устройство в защитной полосой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защитный скольжения является сложенный лист пленки для ламинирования подложки, которая защищает устройства от загрязнения или повреждения, гарантируя, что они не контактируют с ламинатор роликами.
4. Пропускают полученную сборку двухслойную через автоматизированный ламинатор, чтобы полностью нажмите клей и бумагу вместе, удаляя карманы воздуха из присоединяемых слоев.
   Примечание: воздушные карманы между слоями устройства могут создавать помехи целостности устройства и затекания воспроизводимостью путем приводит к утечкам.

7. Лечение Сопряженных LАйер с реагентами для иммуноанализа перед сборкой устройств

1. Ленточный конъюгат слой на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
2. Добавить 2,5 мкл 100 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в гидрофильной зоне на конъюгате слое. Дайте ей высохнуть при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем при 65 ° С в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем достаточно лишь смочить зону бумаги. Раствор БСА помогает предотвратить агрегацию коллоидных наночастиц в процессе сушки, что облегчает высвобождение наночастиц, когда бумага и реагенты регидратации образцом.
3. Добавьте 5 мкл 5 OD коллоидного золота наночастицы конъюгированных с анти-бета-ХГЧ антителом, и повторить процесс сушки.
   Примечание: Единицы концентрации наночастиц коллоидного золота часто выражаются в виде оптической плотности (OD), измеренной по абсоrbance при λ = 540 нм. Никакое лечение не требуется для фитиля прокладки перед монтажом устройства в Разделе 10.

8. Лечение бокового канала с реактивом для иммуноанализа Перед сборкой устройств

1. Ленточный слой боковой канал на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
2. Добавьте 10 мкл блокирующего агента (5 мг / мл обезжиренного молока и 0,1% (об / об) твина 20 в 1x PBS) для лечения бокового канала. Повторите тот же процесс сушки (2 мин при комнатной температуре, а затем при 65 ° С в течение 5 мин) в качестве сопряженного слоя.

9. Лечение захвата слоя с реагентами для иммуноанализа перед сборкой устройств

1. Лента захвата слой на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
2. Обрабатывают слой захвата с 5 мкл 1 мг / мл анти-α-ХГЧ антителом, а затем позволитьобразец высохнуть при комнатной температуре в течение 2 мин, затем 8 минут при температуре 65 ° С.
3. Добавьте 2 мкл блокирующего агента (5 мг / мл обезжиренного молока и 0,1% (об / об) твина 20 в 1x PBS). Повторите процесс сушки для слоя захвата.
   Примечание: Эта сумма подходит для покрытия бумаги без закупоривания пор нейлоновой мембраны, что может произойти, когда слишком много используется блокирующий агент.

10. Монтаж Трехмерная бумаги на основе микрожидкостных устройств

1. Лента промывочной слой на световом коробе (отпечатанной стороной вверх). Если используются отверстия выравнивания, удалите их с последующими слоями с помощью ручного инструмента перфорирования.
2. Удалите защитную пленку на задней стороне слоя захвата, чтобы обнажить клей. Совместите слой захвата над промывочного слоя, используя отверстия выравнивания в качестве ориентира. Нажмите два слоя вместе. Избегайте прикосновения гидрофильных зон, чтобы свести к минимуму загрязнение или повреждение устройства. Пинцет может быть использован для оказания помощи АССАМБЛЕЯLY.
3. Удалите защитную пленку на задней части инкубационного слоя, чтобы обнажить клей. Совместите инкубационный слой над слоем захвата и нажмите их вместе. Продолжайте добавлять слои таким образом, пока все активные слои не будут собраны.
4. Поместите частично собранное устройство в защитной полосой и надежно прикрепить слои вместе, используя ламинатор.
5. Удалите защитную пленку на задней части промывного слоя и прикрепить Блот слой на нижней части устройства. Повторите шаг ламинирование 10.4, чтобы завершить сборку трехмерной бумажной основе микрожидкостных устройств. Вырезать требуемое количество устройств из полос или листов полностью собранных устройств с помощью ножниц.
   Примечание: полные листы устройств, полосы устройств или отдельные устройства могут быть получены с использованием аналогичного подхода.

11. Выполнение иммуноанализа на бумажной основе

1. Добавьте 20 мкл образца к гидрофильной зоне на верхней части устройства (то есть, тон образец слоя).
2. Подождите образца впитывать полностью в устройство, а затем добавляют 15 мкл промывочного буфера (0,05% об / об Твина 20 в 1x фосфатным буферным раствором). После того, как первый аликвоту промывочного буфера нечестивым полностью в устройство, добавить второй 15 мкл аликвоты буфера для промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: промывочный буфер имеет полностью нечестивые в устройство, когда капля жидкости исчезла, не показывая мениск на поверхности бумаги. Анализ завершается, когда второй аликвоты буфера для промывки полностью вошел в устройство.
3. Для выявления результатов анализа, отслаиваться трех верхних слоев устройства с помощью пинцета , чтобы обнажить слой захвата.
   1. Интерпретировать результаты анализа качественно путем наблюдения за наличие или отсутствие цвета. В качестве альтернативы, изображение считывания слой с помощью сканера на рабочем столе и использовать программное обеспечение для обработки изображений или алгоритмы для количественной оценки результатов и характеризуют распределение интенсивности в пределахЗона обнаружения. ²⁰

Результаты

Получение воспроизводимых опробования представления в трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств зависит от способа изготовления, что обеспечивает согласованность между устройствами. Для достижения этой цели, мы определили ряд производственных процессов и м?...

Обсуждение

Определение воспроизводимый стратегии производства является одним из важнейших компонентов развития анализа. ²² Мы используем последовательный, слой за слоем подход к производству трехмерных бумажных микрожидкостных устройств. В отличие от тех методов , которые применя?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illustrator CC	Adobe		to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer	Amazon	B00R92C9DI	to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven	Fisher Scientific	15-103-0509	to melt wax into paper
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator	Amazon	B00AXHSZU2	to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter	Graphtec America	CE6000-40	to pattern adhesive films
Swingline paper cutter	Amazon	B0006VNY4C	to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner	Amazon	B000VG4AY0	to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch	McMaster-Carr	3488A9	to remove alignment holes
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)	Fisher Scientific	05-714-4	to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size )	Pall Corporation	NBCHI3R	to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF021621	to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF051521
wax liner	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	to assist with patterning adhesive
acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	to fabricate frame
self-adhesive sheets	Fellowes	CRC52215	to use as protective slip
absolute ethanol	VWR	89125-172	to sanitize work area
bovine serum albumin	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls	Fisher Scientific	22-071-066	to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1)	Arista Biologicals	CGBCG-0701	to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody	Arista Biologicals	ABACG-0500	to treat capture layer
10X phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid skim milk powder	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147