Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Resumo

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Resumo

No cérebro, os sistemas de tráfico de membrana desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais, como morfologia neuronal, plasticidade sináptica, sobrevivência e comunicações gliais. Até à data, numerosos estudos têm relatado que defeitos nestes sistemas causam várias doenças neuronais. Assim, a compreensão dos mecanismos subjacentes à dinâmica das vesículas pode fornecer pistas influentes que poderiam auxiliar no tratamento de vários distúrbios neuronais. Aqui, descrevemos um método para quantificar motilidades de vesículas, tais como a distância de motilidade e a velocidade de movimento, utilizando um plug-in de software para a plataforma ImageJ. Para obter imagens para quantificação, marcamos estruturas de endossomas neuronais-lisossomas com proteínas marcadoras de vesículas marcadas com EGFP e observamos o movimento de vesículas usando uma microscopia de lapso de tempo. Este método é altamente útil e simplifica a medição da motilidade vesicular em neurites, tais como axônios e dendritos, bem como no soma de ambos os neurônios e células gliais. MaismoRe, este m�odo pode ser aplicado a outras linhas celulares, tais como fibroblastos e c�ulas endoteliais. Esta abordagem poderia fornecer um avanço valioso da nossa compreensão do tráfico de membrana.

Introdução

O controle preciso do tráfico de endossomas-lisossomos é indispensável para a regulação da função neuronal. Notavelmente, os movimentos dinâmicos destas vesículas são um factor chave subjacente à regulação da morfologia neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Defeitos neste sistema causam graves distúrbios neuronais ^{1 , 2} . Os mecanismos moleculares que ligam o tráfico de vesículas a doenças neuronais são considerados complicados, e vários grupos têm procurado examinar essa relevância. Por exemplo, foi relatado que a motilidade endosómica tardia perturbada está significativamente associada com a doença ^{3 de} Niemann-Pick C, uma doença neurodegenerativa hereditária causada por defeitos de lisossoma. Outro exemplo é uma mutação num canal de Ca ²⁺ lisossómico , trpml 1, que prejudica a motilidade lisossómica, resultando em doenças de armazenamento lisossomal ^{4 , 5 , 6} . Nosso grupo relatou que a desregulação do PtdIns (3,5) P ₂ volume de negócios suprime endosome e motilidade lisossomo nos neurônios, levando a um aumento da vulnerabilidade à resposta ao estresse ^{7 , 8} . A regulação metabólica de PtdIns (3,5) P ₂ , que localiza principalmente os endossomas e os lisossomas tardios, desempenha um papel importante em uma ampla variedade de funções celulares, incluindo o tráfico de vesículas e os processos de fusão-fissão 9,10. Uma vez que o PtdIns (3,5) P ₂ alterado provoca neurodegeneração grave 11,12, a regulação aberrante da motilidade endosoma-lisossoma pode ser um fator chave para a compreensão da patogênese da neurodegeneração. Uma investigação dos mecanismos moleculares subjacentes à motilidade vesicular pode assim fornecer pistas promissoras que podem aprofundar a nossaVários distúrbios neuronais.

Neste artigo, introduzimos um valioso método para quantificar a motilidade vesicular em neurônios usando um pacote de software livre chamado Manual Tracking. O objetivo foi desenvolver um método de quantificação rápida para analisar a motilidade vesicular. Esta quantificação é dirigida através de uma abordagem padrão de clicar em um ponto de referência em cada quadro de um filme de lapso de tempo. O uso do software de rastreamento manual torna essa abordagem bastante simples e de ampla utilidade, ao contrário de outras aplicações. Além disso, esta abordagem é também aplicável a outras células, tais como células gliais. Embora este método seja primitivo, pode ser aplicado a várias análises, incluindo a motilidade celular ea alteração morfológica. Por exemplo, depois de definir um ponto de referência em uma seqüência de imagens, informações sobre as posições dos pontos de referência eo tempo em cada posição podem ser extraídos de imagens seqüenciais usando a análise de dados e softwares de processamento de imagenslouça. Tomados em conjunto, este método é simples, mas poderoso e contribui para o desenvolvimento de maior eficiência em estudos baseados no tráfico de membranas, como aqueles que examinam a função do endossoma-lisossoma.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tsukuba (IACUC).

1. Dissecção

1. Para preparar os fetos embrionários do dia 13-14 ICR ou C57BL / 6, eutanásia camundongos grávidas por deslocamento cervical. Remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Enxaguar bem para remover o sangue.
2. Usando fórceps, transferir o útero para uma nova placa de Petri com etanol a 70% para esterilizar.
3. Transferir o útero para uma nova placa de Petri com HBSS. Remova os fetos do útero usando fórceps de dissecação esterilizados e tesoura cirúrgica.
4. Decapitar os fetos usando tesoura cirúrgica. Coloque-os em uma nova placa de Petri com HBSS.
5. Remova a pele eo crânio e tire os cérebros usando fórceps de dissecação esterilizados. Colocá-los em uma placa de Petri com HBSS.
   NOTA: A partir desta etapa, é melhor realizar o procedimento emBanco.
6. Remova as meninges usando fórceps de dissecação esterilizados sob um microscópio estéreo. Corte os gânglios basais, hipocampo e cerebelo usando fórceps. Usando fórceps de ponta curvada, transfira os cortices para uma nova placa de Petri com HBSS.
7. Recolher todos os cortices usando um conta-gotas descartable ou uma pipeta de 25 mL. Coloque-os em um tubo de 15 mL e, em seguida, remova o HBSS por pipetagem.
8. Adicione 3 mL de solução de enzima cortical cerebral ao tubo contendo os cortices. Coloque este tubo em banho-maria e incuba a 37 ° C durante 5 min.
   NOTA: Prepare uma enzima de cultura cortical cerebral que consiste em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,25% de tripsina e 1 mM de EDTA. Esterilize com um filtro de 0,22 μm.
9. Adicionar mais 3 mL de solução de enzima cortical cerebral no tubo que contém os cortices e incubar a 37 ° C num banho de água durante 5 minutos adicionais.
10. Remova a solução de enzima cortical cerebral usando uma pipeta de 5 mL e adicione 5 mL de DulbeCco de Eagle Modificado (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS).
11. Dissociar os córtices pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de 5 mL com uma ponta P1000 estéril. Pipetar novamente usando uma pipeta de 5 mL com uma ponta P200.
12. Coloque um filtro de nylon de 40 μm em um tubo de 50 mL e filtre a suspensão para remover os detritos.
13. Centrifugar a 420 xg durante 5 min à TA e em seguida remover o meio DMEM.
14. Adicionar 5 mL de meio de cultura cortical cerebral e ressuspender suavemente o sedimento celular.
    NOTA: Preparar um meio de cultura cortical cerebral constituído por meio basal de neurônio suplementado com 1x suplementos de B-27, 2 mM de L-glutamina e 100 U / mL de penicilina estreptomicina.
15. Contar as células usando um hemocitômetro e ajustar a concentração celular (como desejado) usando o meio de cultura cortical cerebral.
16. Placa 3,0 × 10 ⁶ neurónios corticais em 2,0 ml por placas de vidro revestidas de 35 mm.
    NOTA: Antes do revestimento,Placas de fundo de vidro de 35 mm com 0,1 mg / mL de bromidrato de poli-D-lisina (PDL) ou 0,01% de poli-L-ornitina (PLO). Incubar por 3 h - O / N a 37 ° C e lavar com PBS pelo menos 3x.

2. Motilidade da vesícula de imagem

1. Preparar os plasmídeos que rotularão cada tipo de vesícula. Por exemplo, use EGFP-Rab5 para endossomas precoces, EGFP-Rab7 para endossomos tardios, LAMP-EGFP para lisossomas e EGFP-LC3 para autofagosomas 8,13.
   NOTA: Estes plasmídeos estão disponíveis a pedido de tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Tipicamente, os neurónios de 3 a 5 dias in vitro (DIV) podem ser transfectados com estes plasmídeos utilizando reagentes de transfecção.
2. Misturar 4,0 μg de plasmídeos com 200 μL de meio isento de soro por pipetagem. Num tubo separado, diluir 8 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais ) em 200 μL de meio isento de soro. Incubar durante 5 min à RT.
3. Misturar a solução de plasmídeo e a solução regente de transfecção no passo 2.2 por pipetagem. Incubar durante 20 min à TA.
4. Adicionar meio isento de soro e 400 μL da solução de plasmídeo do passo 2.3 a cada placa de fundo de vidro revestido. Incubar os neurônios a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ a 5% por 30 min. Substituir o meio por 2 mL de meio de cultura cortical cerebral. Incubar os neurônios a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ a 5% por 1-2 dias.
5. Após 1 - 2 d de transfecção, seleccionar as células transfectadas para aquisição de imagem.
   NOTA: Os neur�ios prematuros com menos de 7 DIV t� uma tend�cia para exibir motilidade din�ica das ves�ulas. Selecione os neurônios que moderadamente expressam a sonda de fluorescência porque imagens claras não podem ser obtidas quando um neurônio altamente expressivo é selecionado. Além disso, selecione uma forma neuronal típica, como neurônios piramidais, que têm axônios longos e intrincados dendrites, para facilitar a identificação do axônio e dendrites (ver Figura 1A).
6. Aquisição de imagens usando um sistema de geração de imagens de lapso de tempo:
   Para imagens, use um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD (Charge-Coupled Device) com lentes objetivas Plan Apo 0.95NA 40X ou 100X Plan Apo VC NA1.4. Controlar a temperatura a 37 ° C utilizando um sistema de incubação. Adquirir imagens de neurônios em um frame / 5 s durante um período de 100 s controlado pelo software de aquisição de imagem. Alternativamente, adquira imagens em intervalos mais curtos e por períodos de tempo mais longos, como em uma moldura por 2 s ao longo de um período de 300 s.
   NOTA: Uma variedade de aplicações está disponível para tirar imagens seqüenciais, muitas das quais seriam adequadas para este método. Portanto, nenhuma aplicação específica é recomendada; Em vez disso, cada pesquisador deve usar qualquer aplicação disponível.

3. Análise de Imagem

1. Abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com Tracking manual ¹⁴ .
   NOTA: Até à data, o rastreamento manual foiDely usado nos experimentos de rastreamento ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Manual Tracking foi desenvolvido pelo Dr. Fabrice Cordelières. Instruções pormenorizadas por escrito estão disponíveis online ²⁰ . Para a análise, a qualidade dos dados de imagem é melhorada com um número suficiente de imagens. Recomenda-se a utilização de mais de 20 imagens.
2. Para combinar as imagens seqüenciais, escolha → → . Clique em .
3. Escolha → ; Uma janela de acompanhamento aparecerá.
4. Clique na caixa de seleção de E defina os parâmetros de rastreamento na seção de parâmetros.
   NOTA: Vários parâmetros podem ser definidos, incluindo intervalo de tempo, calibração x / y, calibração z, tamanho quadrado de pesquisa para centroTamanho do ponto, largura da linha e tamanho da fonte. Neste ensaio simplificado, foram definidos tanto o intervalo de tempo como a calibração x / y. Sob outras circunstâncias experimentais, pode ser necessário definir outros parâmetros também. Os parâmetros utilizados aqui são os seguintes: o é 5 s ea calibração é de 0,26642 μm para uma lente objectiva Plan Apo 0,95NA 40X ou 0,10657 μm para um plano 100X Apo VC NA1.4 lentes objetivas.
5. Após a definição dos parâmetros, clique em para iniciar uma nova faixa.
6. Após a determinação das vesículas de interesse ( por exemplo, as vesículas indicadas por setas azuis e vermelhas na Figura 1A (painel direito)), clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registar as coordenadas xy. Os resultados das coordenadas xy registradas, distância e velocidade aparecem em uma nova janela.
   NOTA: No caso de lisossomas, sinais luminosos fluorescentes grandes ( por exemplo, FigUre 1A (painel direito), seta alaranjada) são freqüentemente observados nos neurônios. Como estes sinais ocasionalmente exibem vesículas acumuladas ou varicosidades patológicas, estes sinais devem ser evitados para quantificar a motilidade.
7. Repita o passo 3.6 para coletar as coordenadas xy de vesículas de todas as imagens seqüenciais; Cada imagem avança automaticamente para a imagem sucessiva após a selecção do ponto de referência.
8. Exporte esses dados para uma nova tabela ( por exemplo, uma planilha). Use um software adequado para criar um gráfico adequado (consulte a Tabela de Materiais ).
   NOTA: Para analisar os dados, selecione a coluna , resuma todos os valores dessa coluna e mostre uma distância de motilidade como um gráfico de barras, como na Figura 1B . Além disso, repita este passo, calcule a média da distância total da motilidade e mostre como um gráfico de barras, como na Figura 1C . O software para criar um gráfico de barras e dados de forma de ondaA Tabela de Materiais.

Resultados

Este ensaio foi concebido para medir a dinâmica das vesículas em culturas in vitro . Este ensaio foi utilizado para determinar a motilidade vesicular associada com morfologia neuronal e sobrevivência. As Figuras 1A e B apresentam dados representativos que mostram a motilidade dos lisossomas nos neurónios. Os neur�ios corticos foram transfectados com o marcador de lisossoma, LAMP-EGFP, e observados utilizando um microsc�io ...

Discussão

Este protocolo introduz o procedimento para quantificar a motilidade vesicular. Nos neurônios primários, os endossomos e os lisossomos tendem a apresentar alta motilidade em neurônios mais jovens (4-6 DIV). Dado que os neurônios devem fornecer alguns componentes para os bordos de ataque para alongar os processos neurais, o tráfico de membranas deve ocorrer dinamicamente durante esta fase. Assim, é importante usar neurônios mais jovens para observar a motilidade dinâmica em dendritos neuronais. Além disso, vesí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Serum free medium
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Thermo Fisher	14170112
Penicilin Streptmycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
B-27 Supplements	Thermo Fisher	17504044
2.5% Trypsine	Thermo Fisher	15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma	P7280
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P4957
Nylon cell strainer	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max" (PEI)	polysciences	24765	Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Incubation system INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism version 6.0	GraphPad Software	NA
Excel version 15	Microsoft	NA
ImageJ verion 1.47	NA	NA