Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Zusammenfassung

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Im Gehirn spielen Membran-Trafficking-Systeme eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Funktionen wie neuronaler Morphologie, synaptischer Plastizität, Überleben und Glia-Kommunikation. Bisher haben zahlreiche Studien berichtet, dass Defekte in diesen Systemen verschiedene neuronale Erkrankungen verursachen. So kann das Verständnis der Mechanismen, die der Vesikeldynamik zugrunde liegen, einflussreiche Hinweise liefern, die bei der Behandlung von mehreren neuronalen Störungen helfen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Vesikelmotazitäten, wie Motilitätsabstand und Bewegungsgeschwindigkeit, mit einem Software-Plug-In für die ImageJ-Plattform. Um Bilder zur Quantifizierung zu erhalten, markierten wir neuronale Endosom-Lysosomenstrukturen mit EGFP-markierten Vesikelmarkerproteinen und beobachteten die Bewegung von Vesikeln mit einer Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ist sehr nützlich und vereinfacht die Messung der Vesikelmotilität in Neuriten wie Axonen und Dendriten sowie im Soma von Neuronen und Gliazellen. WeiterDiese Methode kann auf andere Zelllinien, wie Fibroblasten und Endothelzellen, angewendet werden. Dieser Ansatz könnte einen wertvollen Fortschritt für unser Verständnis des Membranhandels darstellen.

Einleitung

Die präzise Kontrolle des Endosom-Lysosomen-Traffickings ist für die Regulierung der neuronalen Funktion unentbehrlich. Bemerkenswerterweise sind die dynamischen Bewegungen dieser Vesikel ein Schlüsselfaktor für die Regulierung der neuronalen Morphologie, der Entwicklung und des Überlebens. Defekte in diesem System verursachen schwere neuronale Störungen ^{1 , 2} . Die molekularen Mechanismen, die den Vesikelhandel mit neuronalen Erkrankungen verknüpfen, gelten als kompliziert, und mehrere Gruppen haben versucht, diese Relevanz zu untersuchen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die gestörte späte Endosom-Motilität signifikant mit der Niemann-Pick-C-Krankheit ³ assoziiert ist, einer erblichen neurodegenerativen Störung, die durch Lysosomendefekte verursacht wird. Ein weiteres Beispiel ist eine Mutation in einem lysosomalen Ca ²⁺ -Kanal, trpml 1, der die lysosomale Motilität beeinträchtigt, was zu lysosomalen Speicherkrankheiten ^{4 , 5 , 6} Unsere Gruppe hat berichtet, dass die Dysregulation des PtdIns (3,5) P ₂ Umsatzes die Endosom- und Lysosommotilität in Neuronen unterdrückt, was zu einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber der Stressreaktion ^{7 , 8 führt} . Die metabolische Regulation von PtdIns (3,5) P ₂ , die sich meist auf späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert, spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Funktionen, darunter Vesikelhandels- und Fusionsspaltungsverfahren ^{9 , 10} . Da beeinträchtigte PtdIns (3,5) P ₂ -Verwender eine schwere Neurodegeneration ^{11 , 12} verursachen ^, könnte die abweichende Regulation der Endosom-Lysosom-Motilität ein Schlüsselfaktor für das Verständnis der Pathogenese der Neurodegeneration sein. Eine Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Vesikelmotilität zugrunde liegen, kann so vielversprechende Hinweise liefern, die unsere Ungerechtigkeit vertiefen könnenVerständnis von mehreren neuronalen Störungen.

In dieser Arbeit stellen wir eine wertvolle Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen mit einem kostenlosen Softwarepaket namens Manual Tracking vor. Ziel war es, eine schnelle Quantifizierungsmethode zur Analyse der Vesikelmotilität zu entwickeln. Diese Quantifizierung wird durch einen Standardansatz des Klickens auf einen Referenzpunkt in jedem Rahmen eines Zeitrafferfilms gelenkt. Die Verwendung der manuellen Tracking-Software macht diesen Ansatz im Gegensatz zu anderen Anwendungen ganz einfach und von weitem Nutzen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch auf andere Zellen, wie Gliazellen, anwendbar. Obwohl diese Methode primitiv ist, kann sie auf verschiedene Analysen angewendet werden, einschließlich der zellulären Motilität und der morphologischen Veränderung. Beispielsweise können nach der Definition eines Referenzpunktes über eine Sequenz von Bildern Informationen über die Positionen der Referenzpunkte und die Zeit an jeder Position aus sequentiellen Bildern unter Verwendung von Datenanalyse und Bildverarbeitung weich extrahiert werdenWare. Zusammengenommen ist diese Methode einfach, aber leistungsfähig und trägt zur Entwicklung einer verbesserten Effizienz in Studien auf der Grundlage von Membran-Trafficking, wie die untersucht Endosom-Lysosom-Funktion.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden mit der Genehmigung des Tsukuba Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) durchgeführt.

1. Dissektion

1. Zur Vorbereitung embryonalen Tag 13-14 ICR oder C57BL / 6 Föten, euthanisieren schwangere Mäuse durch zervikale Versetzung. Entfernen Sie den Uterus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Spülen Sie es gut, um das Blut zu entfernen.
2. Mit Pinzette, übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit 70% Ethanol zu sterilisieren.
3. Übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie die Föten aus dem Uterus mit sterilisierten Sezierzangen und chirurgischen Scheren.
4. Entschlüsseln Sie die Föten mit chirurgischen Scheren. Legen Sie sie in eine neue Petrischale mit HBSS.
5. Entfernen Sie die Haut und den Schädel und nehmen Sie die Gehirne mit sterilisierter Sezierzange heraus. Setzen Sie sie in eine Petrischale mit HBSS.
   HINWEIS: Von diesem Schritt an ist es am besten, das Verfahren auf einem sauberen durchzuführenBank.
6. Entfernen Sie die Meninges mit sterilisierter Sezierzange unter einem Stereomikroskop. Schneide die Basalganglien, Hippocampus und Kleinhirn mit Pinzette ab. Mit gebogenen Pinzetten, übertragen Sie die Cortices auf eine neue Petrischale mit HBSS.
7. Sammeln Sie alle Cortices mit einer Einweg-Tropfmaschine oder einer 25-ml-Pipette. Setzen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und entfernen Sie dann die HBSS durch Pipettieren.
8. Füge 3 ml der zerebralen kortikalen Enzymlösung zu dem Röhrchen hinzu, das die Cortices enthält. Setzen Sie diese Röhre in ein Wasserbad und inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
   ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturenzyms, bestehend aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA. Sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter.
9. Fügen Sie weitere 3 ml zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen hinzu, das die Kortizes enthält, und bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 5 min inkubieren.
10. Entfernen Sie die zerebrale kortikale Enzymlösung mit einer 5-ml-Pipette und fügen Sie 5 ml Dulbe hinzuCco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS).
11. Dissoziieren Sie die Cortices durch sanftes Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette mit einer sterilen P1000-Spitze. Mit einer 5-ml-Pipette mit einer P200-Spitze erneut pipettieren.
12. Setzen Sie ein 40 μm Nylon-Zellsieb auf ein 50 mL-Röhrchen und filtrieren Sie die Suspension, um den Schmutz zu entfernen.
13. Bei 420 xg für 5 min bei RT zentrifugieren und dann das DMEM-Medium entfernen.
14. Fügen Sie 5 ml zerebrales kortikales Kulturmedium hinzu und lassen Sie das Zellpellet vorsichtig resuspendieren.
    ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturmediums, bestehend aus Neuron-Basalmedium, ergänzt mit 1x B-27 Ergänzungen, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
15. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und stellen Sie die Zellkonzentration (wie gewünscht) mit dem zerebralen kortikalen Kulturmedium ein.
16. Tafel 3,0 × 10 ⁶ kortikale Neuronen in 2,0 ml pro beschichtetem 35 mm Glasboden.
    HINWEIS: Vor dem Überziehen, beschichten35mmm Glasboden mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid (PDL) oder 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubieren für 3 h - O / N bei 37 ° C und Waschen mit PBS mindestens 3x.

2. Imaging Vesicle Motility

1. Bereiten Sie die Plasmide, die jede Art von Vesikel zu etikettieren. Verwenden Sie zum Beispiel EGFP-Rab5 für frühe Endosomen, EGFP-Rab7 für späte Endosomen, LAMP-EGFP für Lysosomen und EGFP-LC3 für Autophagosomen ^{8 , 13} .
   HINWEIS: Diese Plasmide sind auf Anfrage von tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp erhältlich. Typischerweise können 3 -5 Tage in vitro (DIV) Neuronen mit diesen Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien transfiziert werden.
2. Mischen Sie 4,0 μg Plasmide mit 200 μl serumfreiem Medium durch Pipettieren. In einem separaten Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien ) in 200 μl serumfreies Medium verdünnen . 5 min bei RT inkubieren.
3. Mischen Sie die Plasmidlösung und die Transfektionsregentlösung in Schritt 2.2 durch Pipettieren. Inkubieren für 20 min bei RT.
4. Fügen Sie serumfreies Medium und 400 μl der Plasmidlösung aus Schritt 2.3 zu jeder beschichteten Glasbodenschale hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator für 30 min. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml zerebrales kortikales Kulturmedium. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator für 1-2 Tage.
5. Nach 1 - 2 d Transfektion wählen Sie die transfizierten Zellen zur Bildaufnahme aus.
   HINWEIS: Vorzeitige Neuronen weniger als 7 DIV neigen dazu, dynamische Vesikelmotilität zu zeigen. Wählen Sie Neuronen aus, die die Fluoreszenzsonde mäßig exprimieren, da keine klare Bilder erhalten werden können, wenn ein hochexprimierendes Neuron ausgewählt wird. Wählen Sie auch eine typische neuronale Form, wie zyramidenförmige Neuronen, die lange Axone und komplizierte Dendriten aufweisen, um die Identifizierung des Axons und der Dendriten zu erleichtern (siehe Abbildung 1A)).
6. Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem:
   Für die Bildgebung, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Charge-Coupled Device (CCD) Kamera mit 40X Plan Apo 0.95NA oder 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv Linsen ausgestattet. Kontrollieren Sie die Temperatur bei 37 ° C mit einem Inkubationssystem. Erwerben Sie Neuronenbilder an einem Rahmen / 5 s über einen Zeitraum von 100 s, der von der Bilderfassungssoftware gesteuert wird. Alternativ können Bilder in kürzeren Intervallen und für längere Zeiträume, wie z. B. bei einem Rahmen pro 2 s über einen Zeitraum von 300 s, aufgenommen werden.
   HINWEIS: Für die Aufnahme von aufeinanderfolgenden Bildern stehen viele Anwendungen zur Verfügung, von denen viele für diese Methode geeignet sind. Daher wird keine besondere Anwendung empfohlen; Vielmehr sollte jeder Forscher verwenden, welche Anwendung verfügbar ist.

3. Bildanalyse

1. Öffnen Sie alle aufeinanderfolgenden Bilder in der ImageJ Software mit manueller Tracking ¹⁴ .
   HINWEIS: Bisher war das manuelle Tracking mit wiDie in den Verfolgungsversuchen ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19} verwendet ^wurden . Manuelles Tracking wurde von Dr. Fabrice Cordelières entwickelt. Detaillierte schriftliche Anweisungen sind online verfügbar ²⁰ . Für die Analyse wird die Qualität der Bilddaten mit einer ausreichenden Anzahl von Bildern verbessert. Es wird empfohlen, mehr als 20 Bilder zu verwenden.
2. Um die sequentiellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie → → . Klicken Sie auf .
3. Wählen Sie → ; Ein Tracking-Fenster wird auftauchen.
4. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen und definieren Sie die Verfolgungsparameter im Parameterbereich.
   HINWEIS: Es können mehrere Parameter eingestellt werden, einschließlich Zeitintervall, x / y-Kalibrierung, z-Kalibrierung, Suchquadratgröße für MitteIng, Punktgröße, Linienbreite und Schriftgröße. In diesem vereinfachten Assay wurden sowohl das Zeitintervall als auch die x / y-Kalibrierung definiert. Unter anderen experimentellen Umständen kann es notwendig sein, auch andere Parameter zu definieren. Die hier verwendeten Parameter sind wie folgt: Das ist 5 s und die ist entweder 0,2662 μm für eine 40X Plan Apo 0,95NA Objektiv oder 0,10657 μm für einen 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektivlinse.
5. Nachdem die Parameter definiert sind, klicken Sie auf , um einen neuen Track zu starten.
6. Nach der Bestimmung der Vesikel von Interesse ( z. B. die Vesikel , die durch blaue und rote Pfeilspitzen in Abbildung 1A (rechte Seite) angezeigt werden, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequentiellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Die Ergebnisse der aufgezeichneten xy-Koordinaten, Entfernung und Geschwindigkeit erscheinen in einem neuen Fenster.
   HINWEIS: Im Falle von Lysosomen werden große helle Fluoreszenzsignale ( z. B. AbbUre 1A (rechte Tafel), orange Pfeilspitze) werden oft in Neuronen beobachtet. Da diese Signale gelegentlich entweder akkumulierte Vesikel oder pathologische Variationen aufweisen, sollten diese Signale zur Quantifizierung der Motilität vermieden werden.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.6, um die xy-Koordinaten der Vesikel aus allen sequentiellen Bildern zu sammeln; Jedes Bild wechselt automatisch zum aufeinanderfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt ist.
8. Exportieren Sie diese Daten in eine neue Tabelle ( zB eine Tabellenkalkulation). Verwenden Sie eine entsprechende Software, um einen geeigneten Graphen zu erstellen (siehe Tabelle der Materialien ).
   HINWEIS: Um die Daten zu analysieren, wählen Sie die Spalte , summieren alle Werte dieser Spalte und zeigen einen Motilitätsabstand als Balkendiagramm wie in Abbildung 1B . Zusätzlich wiederholen Sie diesen Schritt, berechnen Sie den Durchschnitt des gesamten Motilitätsabstandes und zeigen Sie als Balkendiagramm wie in Abbildung 1C . Die Software zur Erstellung eines Balkendiagramms und Wellenformdaten wird angezeigtDie Tabelle der Materialien.

Ergebnisse

Dieser Assay wurde entwickelt, um die Vesikeldynamik in der in vitro Kultur zu messen. Dieser Assay wurde verwendet, um die Vesikelmotilität zu bestimmen, die mit der neuronalen Morphologie und dem Überleben assoziiert ist. Abbildung 1A und B zeigen repräsentative Daten, die die Lysosomenmotilität in Neuronen zeigen. Kortikale Neuronen wurden mit dem Lysosommarker, LAMP-EGFP, transfiziert und unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzmikros...

Diskussion

Dieses Protokoll führt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Vesikelmotilität ein. In primären Neuronen, Endosomen und Lysosomen neigen dazu, hohe Motilität in jüngeren Neuronen (4-6 DIV) zu zeigen. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen einige Komponenten an die Vorderkanten liefern müssen, um neuronale Prozesse zu verlängern, sollte der Membranhandel in diesem Stadium dynamisch auftreten. So ist es wichtig, jüngere Neuronen zu verwenden, um die dynamische Motilität in neuronalen Dendriten zu beobachten. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Serum free medium
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Thermo Fisher	14170112
Penicilin Streptmycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
B-27 Supplements	Thermo Fisher	17504044
2.5% Trypsine	Thermo Fisher	15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma	P7280
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P4957
Nylon cell strainer	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max" (PEI)	polysciences	24765	Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Incubation system INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism version 6.0	GraphPad Software	NA
Excel version 15	Microsoft	NA
ImageJ verion 1.47	NA	NA