Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Riepilogo

L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Abstract

Nel cervello, i sistemi di traffico di membrana svolgono un ruolo importante nella regolazione delle funzioni neuronali, come la morfologia neuronale, la plasticità sinaptica, la sopravvivenza e le comunicazioni gliali. Ad oggi, numerosi studi hanno riportato che i difetti di questi sistemi causano varie malattie neuronali. Quindi, la comprensione dei meccanismi sottostanti alla dinamica delle vescicole può fornire indizi influenti che potrebbero aiutare nel trattamento di diversi disturbi neuronali. Qui descriviamo un metodo per quantificare le motilità delle vescicole, come la distanza della motilità e il tasso di movimento, utilizzando un plug-in software per la piattaforma ImageJ. Per ottenere immagini per la quantificazione, abbiamo etichettato strutture endosomi-lisosomi neuronali con proteine ​​del marker di vescicola tagged EGFP e osservato il movimento delle vescicole usando una microscopia a tempo trascorso. Questo metodo è estremamente utile e semplifica la misurazione della motilità della vescicola nei neuriti, come assoni e dendriti, così come nel soma di entrambi i neuroni e le cellule gliali. FurthermoQuesto metodo può essere applicato ad altre linee cellulari, come i fibroblasti e le cellule endoteliali. Questo approccio potrebbe fornire un prezioso avanzamento della nostra comprensione del traffico di membrana.

Introduzione

Il controllo preciso del traffico endosomi-lisosomi è indispensabile per la regolazione della funzione neuronale. In particolare, i movimenti dinamici di queste vescicole sono un fattore chiave alla base della regolazione morfologica, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. I difetti in questo sistema causano gravi disordini neuronali ^{1 , 2} . I meccanismi molecolari che collegano il traffico di vescicole alle malattie neuronali sono considerate complicate e diversi gruppi hanno cercato di esaminare questa rilevanza. Ad esempio, è stato riportato che la motilità endoteliale tardiva perturbed è significativamente associata alla malattia di Niemann-Pick C ³ , un disordine neurodegenerativo ereditato causato da difetti lisosomi. Un altro esempio è una mutazione in un canale lizosomico Ca ²⁺ , trpml 1, che danneggia la motilità lisosomica, con conseguente malattia di stoccaggio lisosomiale ^{4 , 5 , 6} . Il nostro gruppo ha riferito che la disregolazione del turnover di PtdIns (3,5) P ₂ elimina la motilità endosoma e lisosomica nei neuroni, portando ad un aumento della vulnerabilità alla risposta allo stress ^{7 , 8} . La regolazione metabolica di PtdIns (3,5) P ₂ , che localizza principalmente in endosomi tardivi e lisosomi, svolge un ruolo importante in un'ampia varietà di funzioni cellulari, tra cui la trattazione di vescicole e processi di fusione-fissione ^{9 , 10} . Poiché la perdita di turnover PtdIns (3,5) P ₂ causa una grave neurodegenerazione ^{11 , 12} , la regolazione aberrante della motilità endosoma-lisosomica potrebbe essere un fattore chiave per comprendere la patogenesi della neurodegenerazione. Un'analisi dei meccanismi molecolari che sottostanno la motilità della vescicola possono quindi fornire suggerimenti promettenti che possono approfondire la nostra undeDi diversi disturbi neuronali.

In questo articolo introdurremo un metodo prezioso per quantificare la motilità delle vescicole nei neuroni usando un pacchetto software libero chiamato Tracking manuale. Lo scopo era sviluppare un metodo di quantificazione rapida per analizzare la motilità della vescicola. Questa quantificazione è diretta attraverso un approccio standard di clic su un punto di riferimento in ogni fotogramma di un film a tempo trascorso. L'utilizzo del software di monitoraggio manuale rende questo approccio molto semplice e di grande utilità, a differenza di altre applicazioni. Inoltre, questo approccio è applicabile anche ad altre cellule, come le cellule gliali. Anche se questo metodo è primitivo, può essere applicato a varie analisi, tra cui la motilità cellulare e il cambiamento morfologico. Ad esempio, dopo aver definito un punto di riferimento in una sequenza di immagini, le informazioni sulle posizioni dei punti di riferimento e l'ora in ogni posizione possono essere estratti da immagini sequenziali utilizzando l'analisi dei dati e l'elaborazione delle immagini software. Considerati insieme, questo metodo è semplice ma potente e contribuisce allo sviluppo di una maggiore efficienza negli studi basati sul traffico di membrana, come quelli che esaminano la funzione endosomi-lisosomi.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università di Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissezione

1. Per preparare il giorno embrionale 13-14 ICR o C57BL / 6 feti, eutanizzare i topi incinte con dislocazione cervicale. Rimuovere l'utero e metterlo in un piatto di Petri con Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Sciacquarlo bene per rimuovere il sangue.
2. Usando le pinze, trasferire l'utero in un nuovo piatto di petri con 70% di etanolo per sterilizzare.
3. Trasferire l'utero in un nuovo piatto di Petri con HBSS. Rimuovere i feti dall'utero usando le pinze di dissezione sterilizzate e le forbici chirurgiche.
4. Decapitate i feti usando le forbici chirurgiche. Metterli in un nuovo piatto di Petri con HBSS.
5. Rimuovere la pelle e il cranio e togliere il cervello usando le pinze sterilizzate di dissezione. Metteteli in un piatto di Petri con HBSS.
   NOTA: da questo passo in avanti, è meglio eseguire la procedura su un processo pulitopanchina.
6. Rimuovere le meningi usando le pinze sterilizzate di dissezione sotto un microscopio stereo. Tagliare i gangli basali, l'ippocampo e il cervelletto usando le pinze. Utilizzando pinze curve, trasferire i cortici in un nuovo piatto di Petri con HBSS.
7. Raccogliere tutti i cortici usando un dispensatore usa e getta o una pipetta da 25 ml. Metterli in un tubo da 15 ml e poi rimuovere l'HBSS pipettando.
8. Aggiungere 3 ml di soluzione enzimatica corticale cerebrale al tubo contenente i cortici. Mettere questo tubo in un bagno d'acqua e incubare a 37 ° C per 5 min.
   NOTA: Preparare un enzima di coltura cerebrale corticale costituito da salina fosfata-bufferizzata (PBS) con 0,25% di tripsina e 1 mM di EDTA. Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm.
9. Aggiungere un ulteriore 3 ml di soluzione enzimatica corticale cerebrale nel tubo contenente i cortici e incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per altri 5 minuti.
10. Rimuovere la soluzione cerebrovascolare corticale usando una pipetta da 5 ml e aggiungere 5 ml di DulbeCoco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
11. Dissociare i cortici delicatamente pipettando su e giù usando una pipetta da 5 ml con una punta sterile P1000. Pipettare nuovamente utilizzando una pipetta da 5 ml con una punta P200.
12. Inserire un filtro da 40 μm di nylon su un tubo da 50 ml e filtrare la sospensione per rimuovere i detriti.
13. Centrifugare a 420 xg per 5 minuti a RT e quindi rimuovere il mezzo DMEM.
14. Aggiungere 5 ml di terreno cerebrale corticale e riposare delicatamente il pellet cellulare.
    NOTA: Preparare un mezzo di coltura cerebrale corticale costituito da mezzo basale neuronale integrato con supplementi 1x B-27, 2 mM L-glutammina e 100 U / mL penicillina streptomicina.
15. Conte le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare (come desiderato) usando il mezzo di coltura cerebrale corticale.
16. Plate 3.0 × 10 ⁶ neuroni corticali in 2.0 mL per piatti con fondo vetro 35 mm rivestiti.
    NOTA: Prima di piastrellare, rivestire la35mmm piatti a base di vetro con 0,1 mg / ml di poli-D-Lysina idrobromide (PDL) o 0,01% di poli-L-ornitina (PLO). Incubare per 3 h - O / N a 37 ° C e lavare con PBS almeno 3x.

2. Imaging della motilità della vescicola

1. Preparare i plasmidi che indicheranno ogni tipo di vescicola. Ad esempio, utilizzare EGFP-Rab5 per i primi endosomi, EGFP-Rab7 per endosomi tardivi, LAMP-EGFP per i lisosomi e EGFP-LC3 per autofosomi ^{8 , 13} .
   NOTA: Questi plasmidi sono disponibili su richiesta da tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Tipicamente, i neuroni da 3 -5 giorni in vitro (DIV) possono essere trasfettati con questi plasmidi utilizzando reagenti di transfection.
2. Mescolare 4,0 μg di plasmidi con 200 μL di mezzo senza siero pipettando. In un tubo separato, diluire 8 μl di reagente di transfezione (vedere tabella dei materiali ) in 200 μl di mezzo senza siero. Incubare per 5 minuti a RT.
3. Mescolare la soluzione del plasmide e la soluzione del regensante di transfection nel punto 2.2 pipettando. Incubare per 20 minuti a RT.
4. Aggiungere il mezzo senza siero e 400 μL della soluzione plasmidica dal punto 2.3 a ciascun piatto in vetro rivestito rivestito. Incubare i neuroni a 37 ° C in un incubatore di CO ₂ a 5% per 30 min. Sostituire il supporto con 2 ml di terreno cerebrale corticale. Incubare i neuroni a 37 ° C in un incubatore di CO ₂ a 5% per 1-2 giorni.
5. Dopo 1 - 2 d di trasfezione, selezionare le cellule trasfettate per l'acquisizione di immagini.
   NOTA: I neuroni prematuri meno di 7 DIV tendono a mostrare una motilità dinamica delle vescicole. Selezionare i neuroni che esprimono moderatamente la sonda di fluorescenza, poiché non è possibile ottenere immagini chiare quando si seleziona un neurone altamente esprimente. Inoltre, selezionare una forma neuronale tipica, come i neuroni piramidali, che hanno lunghi assoni e dendriti intricati, per facilitare l'identificazione dell'assone e dei dendriti (si veda la Figura 1A).
6. Acquisizione di immagini utilizzando un sistema di imaging temporale:
   Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) con 40X Plan Apo 0.95NA o 100X Plan Apo VC NA1.4 obiettivi. Controllare la temperatura a 37 ° C utilizzando un sistema di incubazione. Acquisire immagini neuron a un frame / 5 s per un periodo di 100 s controllato dal software di acquisizione immagini. In alternativa, acquisite immagini a intervalli più brevi e per periodi più lunghi, ad esempio in un fotogramma per 2 s durante un periodo di 300 anni.
   NOTA: Sono disponibili diverse applicazioni per l'acquisizione di immagini sequenziali, molte delle quali adatte a questo metodo. Pertanto, nessuna applicazione particolare è raccomandata; Piuttosto, ogni ricercatore dovrebbe utilizzare qualsiasi applicazione è disponibile.

3. Analisi delle immagini

1. Aprire tutte le immagini sequenziali nel software ImageJ con il monitoraggio manuale ¹⁴ .
   NOTA: Ad oggi, il monitoraggio manuale è stato con wiDely utilizzati nel monitoraggio degli esperimenti ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Il monitoraggio manuale è stato sviluppato dal dott. Fabrice Cordelières. Istruzioni dettagliate scritte sono disponibili online ²⁰ . Per l'analisi, la qualità dei dati di imaging viene migliorata con un numero sufficiente di immagini. Si raccomanda di utilizzare più di 20 immagini.
2. Per combinare le immagini sequenziali, scegli → → . Fare clic su .
3. Scegliere → ; Verrà visualizzata una finestra di monitoraggio.
4. Fare clic sulla casella di controllo di E definire i parametri di tracciamento nella sezione parametri.
   NOTA: È possibile impostare diversi parametri, tra cui intervallo di tempo, calibrazione x / y, z calibrazione, ricerca quadrato per centroIng, dimensione del punto, larghezza della linea e dimensione del carattere. In questo saggio semplificato sono stati definiti sia l'intervallo di tempo che la calibrazione x / y. In altre circostanze sperimentali, potrebbe essere necessario definire anche altri parametri. I parametri utilizzati qui sono i seguenti: è di 5 s e la calibrazione è pari a 0,26642 μm per un obiettivo obiettivo 40X Plan Apo 0,95NA o 0,10657 μm per un piano AXo 100X NA1,4 obiettivo.
5. Dopo che i parametri sono definiti, fare clic su per avviare una nuova traccia.
6. Dopo aver determinato le vescicole di interesse ( ad es., Le vescicole indicate dalle frecce blu e rosse nella figura 1A (pannello destro)), fare clic sul centro dei segnali nelle immagini sequenziali per registrare le coordinate xy. I risultati delle coordinate xy registrate, la distanza e la velocità vengono visualizzate in una nuova finestra.
   NOTA: Nel caso dei lisosomi, grandi segnali luminosi fluorescenti ( ad esempio, figUre 1A (pannello destro), freccia arancione) sono spesso osservati nei neuroni. Poiché questi segnali occasionalmente presentano vescicole accumulate o varicosità patologiche, questi segnali vanno evitati per quantificare la motilità.
7. Ripetere il passaggio 3.6 per raccogliere le coordinate xy delle vescicole da tutte le immagini sequenziali; Ogni immagine avanza automaticamente all'immagine successiva dopo aver selezionato il punto di riferimento.
8. Esportare questi dati in una nuova tabella ( ad esempio un foglio di calcolo). Utilizzare un software appropriato per creare un grafico adatto (vedere tabella dei materiali ).
   NOTA: Per analizzare i dati, selezionare la colonna , riassumere tutti i valori di questa colonna e mostrare una distanza di movimento come grafico a barre, come nella figura 1B . Inoltre, ripetere questo passaggio, calcolare la media della distanza totale di motilità e mostrare come un grafico a barre, come nella Figura 1C . Viene visualizzato il software per la creazione di un grafico a barre e dei dati delle forme d'ondaLa tabella dei materiali.

Risultati

Questo test è stato progettato per misurare la dinamica delle vescicole nella coltura in vitro . Questo saggio è stato utilizzato per determinare la motilità vescicola associata alla morfologia neuronale e alla sopravvivenza. Figura 1A e B mostrano dati rappresentativi che mostrano la motilità dei lisosomi nei neuroni. I neuroni corticali sono stati trasfettati con il marker lizosomico, LAMP-EGFP, e osservati utilizzando un microscopio stand...

Discussione

Questo protocollo introduce la procedura per quantificare la motilità della vescicola. Nei neuroni primari, endosomi e lisosomi tendono a mostrare un'elevata motilità nei neuroni più giovani (4-6 DIV). Dato che i neuroni devono fornire alcuni componenti ai bordi principali per allungare i processi neurali, il traffico di membrana dovrebbe verificarsi dinamicamente durante questa fase. Quindi, è importante utilizzare i neuroni più giovani per osservare la motilità dinamica nei dendriti neuronali. Inoltre, le ve...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Serum free medium
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Thermo Fisher	14170112
Penicilin Streptmycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
B-27 Supplements	Thermo Fisher	17504044
2.5% Trypsine	Thermo Fisher	15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma	P7280
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P4957
Nylon cell strainer	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max" (PEI)	polysciences	24765	Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Incubation system INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism version 6.0	GraphPad Software	NA
Excel version 15	Microsoft	NA
ImageJ verion 1.47	NA	NA