Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

Resumo

As células do estroma da marrow (MSCs) com potencial neural existem dentro da medula óssea. Nosso protocolo enriquece essa população de células por meio de pré-condicionamento hipóxico e, posteriormente, as direciona para se tornar células maduras de Schwann.

Resumo

Este manuscrito descreve um meio de enriquecer para os progenitores neurais da população de células do estroma da medula (MSC) e, posteriormente, direcioná-los para o destino das células maduras de Schwann. Nós submetimos MSCs de ratos e humanos a condições hipóxicas transitórias (1% de oxigênio por 16 h), seguido de expansão como neurospheres com substrato de baixa inserção com fator de crescimento epidérmico (EGF) / suplementação básica de fator de crescimento de fibroblastos (bFGF). As neurosferas foram semeadas em plástico de cultura de tecido revestido com poli-D-lisina / laminina e cultivadas em um coque gliogênico contendo β-Heregulin, bFGF e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) para gerar células semelhantes a células de Schwann (SCLCs). Os SCLCs foram direcionados para o compromisso do destino via cocultura durante 2 semanas com neurônios de gânglios radiculares dorsais purificados (DRG) obtidos de ratos Sprague Dawley grávidas E14-15. As células maduras de Schwann demonstram persistência na expressão de S100β / p75 e podem formar segmentos de mielina. As células geradas dessa maneira têm potencialPplicações no transplante de células autólogas após lesão da medula espinhal, bem como na modelagem da doença.

Introdução

O transplante de progenitores neurais e seus derivados demonstra promessa como estratégia de tratamento após lesão do nervo traumático ^{1 , 2} e neurodegeneração ^{3 , 4} . Antes da aplicação clínica, é essencial assegurar: i) um método para acessar e expandir uma fonte autóloga de células progenitoras e / ou ii) um meio para direcioná-las para tipos relevantes de células maduras ³ . O nosso interesse na terapia celular por lesão da medula espinhal levou-nos a buscar uma fonte celular robusta e autóloga de progenitores neurais de tecidos adultos.

Uma subpopulação de MSCs origina-se da crista neural e é facilmente acessível a partir da cavidade da medula. Essas células são progenitores neurais que podem gerar neurônios e glia ⁵ . Modelos animais de isquemia cerebral demonstram que hipoxia promove o prol IFOP e multipotência de progenitores neurais no cérebro ⁶ . Esta foi a base para a utilização do pré-condicionamento hipóxico como um meio de expansão em relação aos progenitores neurais derivados da medula.

O transplante de células de Schwann para a medula espinhal lesionada promove a regeneração ² . Os SCLCs podem ser gerados a partir de MSCs por meio de suplementação com fatores gliogênicos ( ie, β-Heregulin, bFGF e PDGF-AA), mas demonstram instabilidade fenotípica. Após a retirada dos fatores de crescimento, eles retornam a um fenótipo tipo fibroblastos ⁷ . A instabilidade fenotípica é indesejável no transplante de células devido ao risco de diferenciação aberrante e carcinogênese. À medida que os precursores de células de Schwann estão associados a feixes de axônios dentro do nervo periférico embrionário ⁸ , fomos conduzidos a SCLC de cocção com neurônios DRG embrionários purificados ^{7 ,}Ass = "xref"> 9. As células Schwann maduras resultantes são comprometidas com o destino e demonstram função in vitro ^{7 , 9} e in vivo ¹⁰ .

Nosso protocolo para o enriquecimento de progenitores neurais dos MSCs é simples e eficiente e resulta em um aumento no número de células para ensaios subseqüentes. A derivação das células de Schwann com destino às células através da plataforma coculante permite o estudo da diferenciação glial e para a geração de células Schwann estáveis ​​e funcionais para a aplicação clínica potencial.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados em estrita conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê de Uso de Animais Vivos para Ensino e Pesquisa, Faculdade de Medicina Li Ka Shing, da Universidade de Hong Kong. As amostras de medula óssea humana foram obtidas da crista ilíaca de dadores saudáveis ​​após o consentimento informado. Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional, a Universidade de Hong Kong.

1. Preparação de Culturas de MSC de Rato

1. Colheita de MSCs do fêmur
   1. Autoclave todas as ferramentas de dissecação ( isto é, tesoura de dissecação fina , tesoura de corte com ponta sem corte e pinça dentada) a 180 ° C durante pelo menos 2 h antes da utilização.
   2. Preparar o meio de crescimento de MSC compreendendo uma modificação de meio-alfa essencial mínima (αMEM) suplementada com 15% de soro de bovino fetal (FBS) e penicilina / estreptomicina (P / S, 1% v / v).
   3. Sacrifique jovens ratos machos Sprague Dawley (200-250 g de peso corporal) por overdose de pentobarbitone (240 mg / kg de peso corporal, intraperitoneal).
      NOTA: As amostras de medula de diferentes ratos devem ser processadas separadamente.
   4. Coloque os animais sacrificados em posição supina. Limpe cuidadosamente o abdômen e os membros inferiores com etanol a 70%.
   5. Remova a pele e o tecido subcutâneo sobre as coxas medianas usando tesouras e fórceps de dissecação fina. Remova os músculos das coxas circunferencialmente até o fêmur ser exposto. Continue assim proximalmente e distalmente até as articulações do joelho e do quadril serem vistas. Disarticule o fêmur através da articulação do quadril e do joelho usando tesoura de corte de ponta sem corte.
      NOTA: Não transecte o fêmur para expor a cavidade da medula nesta fase. Transfira fósforos intactos para um capuz de cultura de tecido laminar para processamento posterior.
   6. Use tesouras de corte de ponta sem corte para transpor as extremidades distal e proximal do fêmur através da metáfise.
   7. Coloque um filtro celular de 70 μm sobre um tubo cônico de 50 mL. Insira uma seringa de 21 G, 10 mL contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS, Na2 HPO ₄ 10 mM, pH 7,4) no canal femoral exposto e elimine o conteúdo da medula no tubo cônico por lavagem repetida.
      NOTA: Aproximadamente 20 mL de PBS são utilizados para libertar cada fêmur. Se a cor do conteúdo lavado permanece manchada de sangue e turva, pode-se usar um volume maior.
   8. Recolher as células por centrifugação a 480 xg durante 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 10 mL de meio de crescimento MSC. Coloque as células em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Coloque os pratos de cultura de tecidos em uma incubadora de células (37 ° C, 5% de CO ₂ ). Registre o dia inicial do chapeamento no dia 0.
      NOTA: Em todas as etapas envolvendo centrifugação, ajuste o freio para desaceleração máxima.
2. Estabelecimento e expansão de colônias MSC
   NOTA: Este protocolo éElias na aderência plástica de cultura de tecido como um meio para selecionar MSCs dentro da cavidade da medula ¹¹ . O conteúdo de medula óssea é permitido para aderir ao plástico de cultura de tecidos durante 2 dias.
   1. No dia 2, enxágue as placas de cultura três vezes com 10 mL de PBS para remover células não aderentes. Substitua o PBS por 10 mL de meio de crescimento MSC após lavagem. Lavar as células com PBS e reabastecer com MSC meio de crescimento a cada 3 dias.
      NOTA: as colônias MSC devem estar visíveis no dia 6-7 ( Figura 2A ).
   2. Passar as células no dia 10, removendo o meio de crescimento e enxaguando as células com PBS. Adicionar 1,5 mL de reagente de dissociação de células enzimáticas recombinantes e incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicione 3 mL de meio de crescimento MSC para neutralizar a reação. Recolher as células isoladas por centrifugação a 250 xg durante 5 min.
   3. Quantifique as células dentro da pastilha usando um hemocitómetro após uma diluição apropriada em PBS.
   4. Células passadas por sementes a uma densidade de 40 000 células / cm2 numa placa de cultura de 10 cm em meio de crescimento MSC.
      NOTA: Os MSC de ratos devem chegar a uma confluência de 80-90% no prazo de 2 dias após a passagem ( Figura 2B ). As células podem ser passadas como descrito no passo 1.2.2 para até 8 passagens. Os MSCs podem ser caracterizados por meio da imunocitoquímica e sua capacidade de diferenciação de trilineagem ( Figura 3 ) ¹² . Somente as culturas do MSC entre as passagens 3 e 8 estão sujeitas ao pré-condicionamento hipóxico e ao enriquecimento dos progenitores neurais. Os MSC de maior número de passagem adotam uma morfologia achatada ( Figura 2C ) e não produzem um número suficiente de progenitores neurais. Essas culturas devem ser descartadas.

2. Preparação de Culturas Humanas de BMSC

1. Diluir 1 mL de aspirado da medula óssea humana com 9 mL de meio de crescimento MSC e prender oCélulas em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Manter as culturas em uma incubadora de células (37 ° C, 5% de CO ₂ ).
2. Remova o meio após 2 dias e enxágue suavemente as culturas três vezes com 10 mL de PBS para remover células não aderentes. Após o enxágüe final, remova o PBS e substitua-o por 10 mL de meio de crescimento MSC. Reabasteça o meio de crescimento após cada 3 dias de cultura após o enxaguamento de PBS.
   NOTA: as colônias MSC devem estar visíveis no dia 6-7. O número de colônias pode variar entre os indivíduos.
3. Passe as células no dia 10, como descrito no passo 1.2.2. Quantifique as células dentro da pastilha usando um hemocitómetro após uma diluição apropriada em PBS. Semear as células passadas a uma densidade de 40.000 células / cm2 em uma placa de cultura de 10 cm em meio de crescimento MSC.
   NOTA: Os MSCs humanos ( Figura 2D ) demonstram uma morfologia semelhante aos MSCs de ratos e também devem atingir uma confluência de 80-90% no prazo de 2 dias após a passagem. Eles deveriam ser charadasCterizados por meio da imunocitoquímica e sua capacidade de diferenciação trilineage ¹² . Tal como acontece com os MSC de ratos, os MSC humanos que estão entre a passagem 3 e 8 estão sujeitos ao pré-condicionamento hipóxico e ao enriquecimento dos progenitores neurais.

3. Pré-condicionamento hipóxico

1. Desmonte os componentes da câmara de hipoxia ( isto é, base, tampa, bandejas) depois de liberar o grampo do anel e limpe as peças individuais com um etanol a 70%. Coloque os componentes da câmara dentro de um capuz de cultura de tecido laminar para esterilização sob luz UV durante 15 min.
2. Antes do pré-condicionamento hipóxico, remova o meio e enxágue as culturas de ratos e humanos MSC (seções 1 e 2) com 10 mL de PBS. Substituir o PBS por 10 mL de meio de crescimento MSC suplementado com 25 mM de HEPES.
   NOTA: Os MSCs cultivados em pratos de 10 cm devem ter atingido 80-90% de confluência antes de serem sujeitos a pré-condicionamento hipóxico.
3. Coloque o culPratos dentro da câmara de hipoxia. Volte a montar os componentes da câmara e aperte o grampo do anel. Lavar uma mistura gasosa de 99% de N2 / 1% de O2 na câmara a uma taxa de fluxo de 10 L / min durante 5 min.
4. Selar as extremidades de conexão da câmara de hipoxia para garantir que não haja vazamento de gás. Coloque a câmara dentro da incubadora celular (37 ° C, 5% de CO ₂ ) durante 16 h.
5. Após a conclusão do pré-condicionamento hipóxico, remova as culturas da câmara em preparação para a subsequente cultura de enriquecimento progenitor neural.

4. Cultura de enriquecimento de progenitores neurais

1. Preparar o meio progenitor neural composto pelo meio de águia modificado de Dulbecco / mistura de nutrientes de presunto F12 (DMEM / F12) suplementado com B27 (2% v / v), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF, 20 ng / mL), fator de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng / mL) e P / S (1% v / v).
2. Descarte os MSCs de rato / humanos humanos pré-condicionados hipóxicos, conforme descrito no passo 1.2.2.Recolher as células isoladas por centrifugação a 250 xg durante 5 min. Quantifique as células dentro da pastilha usando um hemocitômetro após diluição apropriada em PBS.
3. Ressuspender as células no meio progenitor neural e semente em placas de pouca fixação, de 6 poços com uma densidade de 6.000 células / cm ² . Coloque a cultura em uma incubadora de células (37 ° C, 5% de CO ₂ ) durante 12 dias. Reabasteça 75% do meio progenitor neural a cada 3 dias.
   NOTA: Clusters de células não aderentes podem ser observados no dia 6-7. No dia 10-12, podem ser observadas neurosferas com diâmetro ≥ 100 μm ( Figura 4 ). Os MSCs pré-condicionados hipóxicos devem produzir mais neuroesferas em comparação com MSCs cultivados ^em condições normoxicas ⁹ .
4. Colecione neurosferas no dia 12, aspirando-as para uma pipeta de 10 mL e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as neurosferas a 250 xg por 5 min.
   NOTA: Neurospheres podem serCaracterizado no dia 12 para marcadores de progenitores neurais, como nestin e GFAP ⁷ .

5. Geração de células Schwann comprometidas com o destino via Coculture com DRG Neurônios

1. Preparação de neurónios de DRG de rato purificado
   1. Autoclave todas as ferramentas de dissecação (por exemplo, tesoura de dissecção, fórceps, duas pinças de microdissecção e tesoura de microdissecagem) a 180 ° C durante pelo menos 2 h antes da utilização.
   2. Cubra placas de cultura de tecidos de 6 poços com poli-D-lisina (PDL, 10 μg / mL em PBS) a 4 ° C durante a noite. Remova o PDL e enxague com 1,5 mL de PBS por poço.
   3. Proceda com o revestimento das placas com laminina (10 μg / mL em PBS) a 37 ° C durante 2 h. Enxaguar as placas com 1,5 mL de PBS por poço.
   4. Preparar o meio de manutenção do neurônio DRG, composto de meio neurobasal suplementado com B27 (2% v / v), L-glutamina (1% v / v), fator de crescimento nervoso (NGF, 20 ng / mL) e P / S (1 % V / v).
   5. Preparar o meio de purificação de neurônio DRG, composto de meio neurobasal suplementado com B27 (2% v / v), L-glutamina (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodeoxiuridina (FDU, 10 Μg / mL) e uridina (10 μg / mL).
   6. Sacrifique ratos grávidas no dia gestacional 14-15 por overdose de pentobarbital (240 mg / kg de peso corporal, intraperitoneal).
   7. Coloque os animais sacrificados em posição supina. Limpe bem o abdômen com etanol a 70%.
   8. Corte a parede abdominal inferior do animal longitudinalmente usando tesouras e fórceps de dissecação fina. Identifique e remova o útero usando tesouras de dissecação. Corte a parede uterina para expor e extrair os embriões. Transfira os embriões para um prato de cultura esterilizado de 10 cm preenchido com PBS. Coloque o prato de cultura sobre gelo.
   9. Transfira o embrião destinado à dissecção para um prato de cultura estéril de 10 cm preenchido com PBS (temperatura ambiente) e posicione-o sob um microscópio de dissecação. Tenha o embrião em posição propensa.
      NÃOE: A medula espinal esbranquiçada e os DRG anexados podem ser vistos sobre o aspecto dorsal do embrião, através da sua pele translúcida.
   10. Insira fórceps de microdissecção ao longo de cada lado da medula espinhal e use dissecação sem corte para começar a separar a medula espinhal do tecido mole circundante. Corte a medula espinhal livre do animal usando fórceps de microdissecção ao longo da abertura do pescoço e do topo da cauda. Execute uma dissecção brusca sobre o aspecto ventral do cordão para liberá-lo dos tecidos moles circundantes.
   11. Use fórceps de microdissecção para remover o tecido mole residual sobre o aspecto dorsal da medula espontânea liberada.
       NOTA: Nesta fase, apenas a medula espinhal, raízes nervosas e DRG anexado devem permanecer.
   12. Descarte DRGs individuais de suas raízes nervosas conectando usando fórceps microdissecentes. Use uma caneta de pipeta anexada a uma ponta de 1 mL para transferir os DRGs para um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL contendo PBS.
       NOTA: Para cada tubo de 1,5 mL, um máximo de100 DRGs podem ser acomodados.
   13. Centrifugar os DRGs a 250 xg durante 5 min e ressuspendê-los no reagente recombinante de dissociação das células enzimáticas (200 μL por tubo). Incubar (37 ° C, 5% de CO ₂ ) durante 10 min. Centrifugar os DRGs a 250 xg durante 5 min, remover o sobrenadante e ressuspender no meio de manutenção do neurônio DRG. Dissociar o sedimento por trituração suave usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Quantifique as células dentro da pastilha usando um hemocitómetro após uma diluição apropriada.
   14. Elimine as células a uma densidade de 5.000 células / cm2 em placas de 6 poços revestidas por PDL / laminina em 1,5 mL de meio de manutenção de neurônio DRG por poço. Após dois dias de cultura, remova o meio de manutenção do neurônio DRG, enxágue com PBS e substitua-o pelo meio de purificação do neurônio DRG.
       NOTA: Para cada ciclo de purificação, trate as culturas DRG com meio de purificação por 2 dias, seguido de 1 dia de incubação em meio de manutenção. Após 3-4 ciclos de purificação, o remOval de toda a glia endógena é esperado ⁷ . Isso deve demorar cerca de 14 dias. As culturas purificadas testam positivamente o marcador neuronal TUJ1 e estão ausentes para a expressão de S100β ( Figura 5 ).
2. Geração de células de células de Schwann
   1. Preparar o meio de indução glial composto de αMEM suplementado com β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) e P / S (1% v / v).
   2. Placa as neurosferas preparadas na seção 4 em placas de 6 poços revestidas por PDL / laminina com uma densidade de 5-10 esferas por cm2 em 1,5 mL de meio de indução glial por poço. Substitua o meio de indução glial a cada 2 dias após o enxágüe das células com PBS.
      NOTA: As células de neurônios semeados são vistas para migrar para fora no dia 2. No dia 7, as células migratórias têm uma aparência afunilada e devem demonstrar imunopositividade para a célula de SchwannReceptor de neurotrofina marcadores p75 (p75) e S100β ⁷ . Essas células são referidas como SCLCs.
3. Cocultura de SCLC com neurônios DRG
   1. Prepare o meio de coculhamento composto de meio de manutenção de neurônio DRG (passo 5.1.4) e meio de indução glial (passo 5.2.1) a uma relação volume-volume de 1: 1.
   2. Preparar o meio de manutenção de células de Schwann composto por DMEM / F12 suplementado com FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL) e P / S (1% v / v).
   3. Remova o meio de cultura do SCP do dia 7, enxágüe-os com PBS e incube-os com 0,5 mL / poço de reagente de dissociação de células enzimáticas recombinantes a 37 ° C durante 5 min. Ressuspender os SCLCs em meio de cultivo de coque.
   4. Quantifique as células usando um hemocitômetro após uma diluição apropriada.
   5. Elimine os SCLCs em culturas de neurônio DRG purificadas a uma densidade de 1.000 células / cm2. Mantenha as coculturas por 14 dias, com substituição média a cada 2 dias.
      NOTA: Durante a cocultura, as SCLCs adquiriram a morfologia semelhante a um fuso que é típica das células maduras de Schwann ( Figura 6 ). Estas células persistem no seu fenótipo após a retirada dos fatores de crescimento e são capazes de mielinizar axônios in vitro e in vivo ^{7 , 10} . A positividade dos marcadores de células de Schwann ( ie, p75 e S100β) deve ser monitorada por imunofluorescência.
   6. Após a conclusão da cocultura, coloque as células Schwann comprometidas com o destino, como descrito no passo 1.2.2. Use 0,5 mL de reagente de dissociação por poço. Quantifique as células usando um hemocitômetro após uma diluição apropriada.
   7. Ressuspender as células de Schwann comprometidas com o destino no meio de manutenção de células de Schwann a uma densidade de 10 000 células / cm ² . Células de sementes em placas de 6 poços revestidas de PDL / laminina para imunofluorescência.
      NOTA: Cocultures inevitavelmente contêm MSCs que adotaram um fibroblastosDestino celular ⁷ . Essas células são passadas junto com as células Schwann comprometidas com o destino após a conclusão da cocultura. As células de Schwann que se encontram sobre este substrato de fibroblasto podem ser facilmente separadas e expandidas após o enxágüe com "jatos frios" de PBS (4 ° C), como já foi descrito em outro lugar ¹³ . As células Schwann comprometidas com o destino podem ser expandidas em meio de manutenção por 1 mês.

Resultados

Uma visão geral das etapas-chave do nosso protocolo está ilustrada na Figura 1 . Em resumo, os MSC de ratos e humanos são selecionados por aderência ao plástico de cultura de tecidos. Os MSC expandidos são pré-condicionados com hipoxia e estão sujeitos a condições de formação de neurosfera. Neurospheres são banhados e permitidos para se diferenciar em SCLCs. Os SCLCs são cultivados com neurônios DRG purificados para gerar células Schwann comp...

Discussão

É essencial preservar a "cautela" dos MSCs antes do enriquecimento de progenitores neurais através de pré-condicionamento hipóxico e cultura da neurosfera. De nossa experiência, os MSCs multipotentes podem ser identificados de forma confiável por sua morfologia semelhante a fibroblastos alongada. Em contraste, os MSCs que adotaram uma morfologia quadrangular mais achatada, com fibras proeminentes de estresse citoesquelético, não adotam prontamente os destinos das células neurais e devem ser descartado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Neurobasal medium	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
Epidermal growth factor (EGF)	Thermofisher scientific	PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)	Millipore	NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)	Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her)	Millipore	01-201
Uridine	Sigmaaldrich	U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)	Sigmaaldrich	F0503
Poly-D-lysine (PDL)	Sigmaaldrich	P7886-1G
Laminin	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
Penicillin / streptomycin (P/S)	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
10 cm plate for adherent culture	TPP	93100	Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture	TPP	92006	Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture	Corning	3471	Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1)	BD Biosciences	555593
anti-human CD73	BD Biosciences	550256
anti-human/rat STRO-1	R&D Systems	MAB1038
anti-human nestin	R&D Systems	MAB1259
anti-human CD45	BD Biosciences	555480
anti-rat CD90(Thy-1)	BD Biosciences	554895
anti-rat CD73	BD Biosciences	551123
anti-rat nestin	BD Biosciences	MAB1259
anti-rat CD45	BD Biosciences	554875
Anti-S100β	Dako	Z031101
Anti-p75	Millipore	MAB5386
Anti-GFAP	Sigmaaldrich	G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
Anti-Human nuclei	Millipore	MAB1281
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES buffer	Sigmaaldrich	H4034-100G