Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

Riepilogo

Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.

Abstract

Questo manoscritto descrive un mezzo per arricchire i progenitori neurali dalla popolazione delle cellule stromali del midollo (MSC) e quindi di indirizzarli al destino cellulare di Schwann. Abbiamo sottoposto a MSC topi e umani situazioni ipossiche transitorie (ossigeno 1% per 16 h) seguito da espansione come neurosfere su substrato di basso affinamento con fattore di crescita epidermica (EGF) / fattore di crescita fibroblastico base (bFGF). Le neurosfere sono state seminate in plastica di coltura tissutale rivestita con poli-D-lisina e laminina e coltivate in un cocktail gliogenico contenente β-Heregulin, bFGF e fattore di crescita derivato da piastrine (PDGF) per generare cellule simili a cellule Schwann (SCLC). Gli SCLC sono stati indirizzati verso l'impegno di destino mediante cocultura per 2 settimane con neuroni gangliali radici dorsali purificati (DRG) ottenuti da E14-15 ratti incinte Sprague Dawley. Le cellule Schwann mature dimostrano persistenza nell'espressione S100β / p75 e possono formare segmenti di mielina. Le celle generate in questo modo hanno potenziale aPplicazioni nel trapianto di cellule autologhe dopo lesioni del midollo spinale, così come nella modellazione delle malattie.

Introduzione

Il trapianto di progenitori neurali e dei loro derivati ​​dimostra la promessa come strategia di trattamento a seguito di lesioni traumatiche ^{1 e 2} e neurodegenerazione ^{3 , 4} . Prima dell'applicazione clinica, è essenziale assicurare: i) un metodo per accedere e espandere ad una fonte autologa di cellule staminali / progenitori e ii) un mezzo per indirizzarli a tipi di cellule mature, rilevanti ³ . Il nostro interesse per la terapia cellulare per lesioni del midollo spinale ci ha portato a cercare una fonte di cellule autologhe robuste e robuste di progenitori neurali dai tessuti adulti.

Una sottopopolazione di MSC provengono dalla cresta neurale e sono facilmente accessibili dalla cavità del midollo. Queste cellule sono progenitori neurali che possono generare neuroni e glia ⁵ . I modelli animali di ischemia cerebrale dimostrano che l'ipossia promuove la prol Iferazione e multipotenza di progenitori neurali all'interno del cervello ⁶ . Questa è stata la base per l'utilizzo di precondizionamento ipossico come mezzo di espansione su progenitori neurali derivanti dal midollo.

Il trapianto di cellule Schwann nel midollo spinale favorisce la rigenerazione ² . Le SCLC possono essere generate da MSC mediante l'integrazione con fattori gliogenici (β-Heregulin, bFGF e PDGF-AA) ma dimostrano instabilità fenotipica. Al ritiro dei fattori di crescita, essi ritornano a un fenotipo tipo fibroblasto ⁷ . L'instabilità fenotipica è indesiderabile nel trapianto cellulare a causa del rischio di differenziazione aberrante e di carcinogenesi. Poiché i precursori di cellule di Schwann sono associati a fasci dell'assone all'interno del nervo periferico embrionale ⁸ , ci sono stati condotti SCLC di coculture con neuroni embrionali DRG purificati ^{7 ,}Ass = "xref"> 9. Le cellule Schwann mature risultanti sono fate-committed e dimostrano la funzione in vitro ^{7 , 9} e in vivo ¹⁰ .

Il nostro protocollo per l'arricchimento dei progenitori neurali da MSC è semplice ed efficiente e porta ad un aumento del numero di cellule per i successivi dosaggi. La derivazione di cellule Schwann fatte tramite destino attraverso la piattaforma di coculture consente lo studio della differenziazione gliale e la generazione di cellule Schwann stabili e funzionali per una possibile applicazione clinica.

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Protocollo

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite in stretta conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvata dal comitato per l'uso degli animali vivi per l'insegnamento e la ricerca, Li Ka Shing Facoltà di Medicina dell'Università di Hong Kong. I campioni di midollo osseo umano sono stati ottenuti dalla cresta iliaca di donatori sani dopo aver ottenuto il consenso informato. I protocolli sono stati approvati dal consiglio di revisione istituzionale, l'Università di Hong Kong.

1. Preparazione delle Culture MSC di Rat

1. Raccolta di MSC dal femore
   1. Autoclave tutti gli attrezzi di dissezione ( cioè forbici di dissezione fine , forbici a punta smussate e pinze dentate) a 180 ° C per almeno 2 ore prima dell'uso.
   2. Preparare il mezzo di crescita MSC composto da una minima modifica essenziale di media alfa (αMEM) integrata con 15% di siero fetale fetale (FBS) e penicillina / streptomicina (P / S, 1% v / v).
   3. Sacrifichi giovani ratti maschi Sprague Dawley (200-250 g di peso corporeo) da sovradosaggio di pentobarbitone (240 mg / kg di peso corporeo, intraperitoneale).
      NOTA: I campioni di midollo da diversi ratti devono essere trattati separatamente.
   4. Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulire bene l'addome e gli arti inferiori con il 70% di etanolo.
   5. Togliere la pelle e il tessuto sottocutaneo sulle cosce mediali utilizzando forbici e forbici di dissezione eccellenti. Rimuovere i muscoli della coscia circonferenzialmente fino a quando il femore è esposto. Continuare questo proximally e distally fino a quando le articolazioni del ginocchio e dell'anca sono viste. Disarticolare il femore attraverso l'articolazione dell'anca e del ginocchio mediante forbici a taglio a punta smussata.
      NOTA: non trascinare il femore per esporre la cavità del midollo in questa fase. Trasferire i femori intatti a una cappa di coltura del tessuto a flusso laminare per ulteriori trattamenti.
   6. Utilizzare forbici a taglio tagliente a punta per tracciare le estremità distali e prossime del femore attraverso la metafisi.
   7. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo conico da 50 ml. Inserire una siringa da 21 g, 10 ml contenente salina fosfata tamponata (PBS, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7,4) nel canale femorale esposto e sciacquare il contenuto di midollo nel tubo conico ripetutamente.
      NOTA: Circa 20 ml di PBS vengono usati per irrigare ogni femore. Se il colore del contenuto di fiamma rimane macchiato di sangue e torbido, è possibile utilizzare un volume maggiore.
   8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 480 xg per 5 min. Scartare il surnatante. Resuspendere il pellet di cellule in 10 ml di mezzo di crescita MSC. Piattare le cellule su un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Posizionare i piatti di coltura tissutale in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO ₂ ). Registrare il giorno iniziale della placcatura come giorno 0.
      NOTA: In tutti i passaggi che comportano la centrifugazione, impostare il freno per la massima decelerazione.
2. Costituzione ed espansione delle colonie MSC
   NOTA: Questo protocollo rElie sull'adesione plastica della coltura tissutale come mezzo per selezionare per MSC dall'interno della cavità del midollo ¹¹ . Il contenuto di midollo osseo è permesso di aderire alla plastica della coltura tissutale per 2 giorni.
   1. Il giorno 2, sciacquare le piastre di coltura tre volte con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Sostituire il PBS con 10 ml di mezzo di crescita MSC dopo il risciacquo. Lavare le cellule con PBS e ricostituire con supporto di crescita MSC ogni 3 giorni.
      NOTA: Le colonie MSC devono essere visibili entro il giorno 6-7 ( Figura 2A ).
   2. Passaggio delle cellule entro il giorno 10 rimuovendo il mezzo di crescita e sciacquando le cellule con PBS. Aggiungere 1,5 ml di reagente di dissociazione enzimatica ricombinante e incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 3 mL di mezzo di crescita MSC per neutralizzare la reazione. Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 xg per 5 min.
   3. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocytometro dopo una appropriata diluizione in PBS.
   4. Le cellule sono state passate ad una densità di 40.000 cellule / cm ² in una piastra di coltura da 10 cm nel mezzo di crescita MSC.
      NOTA: I MSC del gatto dovrebbero raggiungere confluenza del 80-90% entro 2 giorni dal passaggio ( Figura 2B ). Le celle possono essere passate come descritto nel punto 1.2.2 per un massimo di 8 passaggi. Le MSC possono essere caratterizzate da mezzi di immunocitochimica e dalla loro capacità di differenziazione dei trilinei ( Figura 3 ) ¹² . Solo le colture MSC tra i passaggi 3 e 8 sono soggette a successivi precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali. MSC di maggior numero di passaggio adottano una morfologia appiattita ( Figura 2C ) e non producono un numero sufficiente di progenitori neurali. Queste culture devono essere scartate.

2. Preparazione di Culture BMSC umane

1. Diluire 1 mL di aspirato midollo osseo umano con 9 mL di mezzo di crescita MSC e piastrarloCellule su un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Mantenere le colture in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO ₂ ).
2. Rimuovere il mezzo dopo 2 giorni e sciacquare delicatamente le colture tre volte con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Dopo il risciacquo finale, rimuovere il PBS e sostituirlo con 10 ml di mezzo di crescita MSC. Riempire il mezzo di crescita dopo ogni 3 giorni di coltura dopo il risciacquo di PBS.
   NOTA: Le colonie MSC devono essere visibili entro il giorno 6-7. Il numero di colonie può variare tra i soggetti.
3. Passaggio delle cellule al giorno 10, come descritto nel passaggio 1.2.2. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocytometro dopo una appropriata diluizione in PBS. Seme le cellule passate ad una densità di 40.000 cellule / cm ² su una piastra di coltura da 10 cm nel mezzo di crescita MSC.
   NOTA: I MSC umani ( Figura 2D ) dimostrano una morfologia simile a MSC del ratto e allo stesso modo dovrebbero raggiungere confluenza 80-90% entro 2 giorni dal passaggio. Dovrebbero essere charaCterizzati mediante immunocitochimica e la loro capacità di differenziazione dei trilinei ¹² . Come per i MSC del ratto, MSC umani che sono tra il passaggio 3 e 8 sono soggetti a successivi precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali.

3. Precondizionamento ipossico

1. Smontare i componenti della camera di ipossia ( cioè, base, coperchio, vassoi) dopo aver rilasciato il morsetto dell'anello e pulire le singole parti con 70% di etanolo. Posizionare i componenti della camera all'interno di un cappuccio di coltura del tessuto flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.
2. Prima di precondizionare ipossidi, rimuovere il mezzo e sciacquare le colture di ratto e umano MSC (sezioni 1 e 2) con 10 ml di PBS. Sostituire il PBS con 10 ml di mezzo di crescita MSC integrato con 25 mM HEPES.
   NOTA: I MSC coltivati ​​su piatti da 10 cm dovrebbero avere raggiunto la confluenza del 80-90% prima di essere sottoposti a precondizionamento ipossico.
3. Posizionare il culAll'interno della camera di ipossia. Riassemblare i componenti della camera e serrare il morsetto dell'anello. Spurgare una miscela di gas del 99% N ₂ /1% O ₂ nella camera con una portata di 10 L / min per 5 min.
4. Sigillare le estremità di collegamento della camera di ipossia per assicurarsi che non vi sia perdita di gas. Posizionare la camera all'interno dell'incubatore cellulare (37 ° C, 5% CO ₂ ) per 16 h.
5. Al termine del precondizionamento ipossico, rimuovere le culture dalla camera in preparazione per la successiva cultura arricchita dei progenitori neurali.

4. Cultura arricchimento progenitrice neurale

1. Preparare un mezzo progenitore neurale costituito da F12 (DMEM / F12) modificato con B27 (2% v / v), fattore di crescita di fibroblasti di base (bFGF, 20 ng / mL), fattore di crescita epidermico (EGF, 20 ng / mL) e P / S (1% v / v).
2. Staccare i precursori ipossici ratto / umani MSC, come descritto nel punto 1.2.2.Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 xg per 5 min. Quantificare le cellule all'interno del pellet usando un emocytometro dopo adeguata diluizione in PBS.
3. Resuspendere le cellule nel mezzo progenitivo neurale e il seme a bassi attaccamenti, piatti a 6 pozzetti ad una densità di 6.000 cellule / cm ² . Posizionare la coltura in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO ₂ ) per 12 giorni. Replenish 75% del medium progenitor neurale ogni 3 giorni.
   NOTA: i grandi gruppi cluster non aderenti dovrebbero essere osservati entro il giorno 6-7. Al giorno 10-12 si possono osservare neurosfere con diametro ≥ 100 μm ( Figura 4 ). I MSC precondizionati ipossici dovrebbero produrre più neurosfere rispetto ai MSC coltivati ​​in condizioni normossiche ⁹ .
4. Raccogli le neurosfere nel giorno 12 aspirandole in una pipetta da 10 ml e trasferendole in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare le neurosfere a 250 xg per 5 min.
   NOTA: le neurosfere possono essereCaratterizzato per il giorno 12 per marcatori progenitrici neurali, come Nestin e GFAP ⁷ .

5. La generazione di cellule Schwann impegnate nel destino mediante Coculture con i neuroni DRG

1. Preparazione dei neuroni DRG purificati
   1. Autoclave tutti gli strumenti di dissezione ( cioè forbici di dissezione, pinze, due pinze a microdissezione e forbici a microdissezione) a 180 ° C per almeno 2 ore prima dell'uso.
   2. Pannelli di coltura di tessuti a 6 pozzetti con poli-D-lisina (PDL, 10 μg / mL in PBS) a 4 ° C per una notte. Rimuovere il PDL e risciacquare con 1,5 ml di PBS per pozzetto.
   3. Procedere con il rivestimento delle lastre con laminina (10 μg / mL in PBS) a 37 ° C per 2 ore. Sciacquare le piastre con 1,5 ml di PBS per pozzetto.
   4. Preparare il mezzo di mantenimento del neurone DRG, composto da un mezzo neurobasale integrato con B27 (2% v / v), L-glutamina (1% v / v), fattore di crescita del nervo (NGF, 20 ng / mL) e P / S % V / v).
   5. Preparare il mezzo di purificazione del neurone DRG, composto da un mezzo neurobasale integrato con B27 (2% v / v), L-glutamina (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodeossiridina (FDU, 10 Μg / mL) ed uridine (10 μg / mL).
   6. Ratti in stato di gravidanza durante il giorno di gestazione 14-15 con overdose di pentobarbital (240 mg / kg di peso corporeo, intraperitoneale).
   7. Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulire completamente l'addome con il 70% di etanolo.
   8. Tagliare la parete addominale inferiore dell'animale longitudinalmente usando le forbici e le pinze per disseccare bene. Identificare e rimuovere l'utero utilizzando forbici di dissezione. Tagliare la parete uterina per esporre ed estrarre gli embrioni. Trasferire gli embrioni in un piatto di coltura sterile da 10 cm riempito con PBS. Posizionare il piatto culturale sul ghiaccio.
   9. Trasferire l'embrione destinato alla dissezione in un piatto di coltura sterile da 10 cm riempito con PBS (temperatura ambiente) e posizionarlo sotto un microscopio di dissezione. Avere l'embrione in posizione positiva.
      NONE: Il midollo spinale bianco e le DRG allegate possono essere viste sull'aspetto dorsale dell'embrione, attraverso la sua pelle traslucida.
   10. Inserire le pinze di microdissezione lungo entrambi i lati del midollo spinale e utilizzare una dissezione sbarrata per iniziare a separare il midollo spinale dal tessuto molle circostante. Tagliare il midollo spinale dall'animale usando le pinze di microdissezione lungo l'apertura del collo e la coda della coda. Eseguire ulteriormente la dissezione sbarrata sull'aspetto ventrale del cavo per liberarlo dal tessuto molle circostante.
   11. Utilizzare pinze a microdissezione per rimuovere il tessuto molle residuo sull'aspetto dorsale del midollo spinale liberato.
       NOTA: In questa fase, rimangono solo il midollo spinale, le radici nervose e DRG allegate.
   12. Staccare le DRG individuali dalle loro radici nervose di collegamento utilizzando pinze di microdissezione. Utilizzare una penna pipetta attaccata ad una punta da 1 ml per trasferire le DRG in un tubo centrifugo sterile da 1,5 ml contenente PBS.
       NOTA: Per ogni tubo da 1,5 ml, un massimo diPossono essere alloggiati 100 DRG.
   13. Centrifugare i DRG a 250 xg per 5 min e risospenderli in reattivo ricombinante di dissociazione delle cellule enzimatiche (200 μL per tubo). Incubare (37 ° C, 5% CO ₂ ) per 10 min. Centrifugare le DRG a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere nel mezzo di manutenzione del neurone DRG. Dissociare il pellet con una triturazione delicata usando una punta di pipetta da 200 μL. Quantificare le cellule all'interno del pellet usando un emocitometro dopo una diluizione appropriata.
   14. Seed le cellule ad una densità di 5.000 cellule / cm ² in piastre a 6 pozzetti PDL / laminin-rivestite in 1,5 ml di supporto di mantenimento del neurone DRG per pozzetto. Dopo due giorni di coltura, rimuovere il supporto di manutenzione del neurone DRG, risciacquare con PBS e sostituirlo con il mezzo di purificazione dei neuroni DRG.
       NOTA: Per ogni ciclo di purificazione, trattare le colture DRG con il medium di purificazione per 2 giorni, seguita da 1 giorno di incubazione nel supporto di manutenzione. Dopo 3-4 cicli di purificazione, il rimÈ previsto ovale di tutti gli endogeni glia ⁷ . Ci vogliono circa 14 giorni. Le colture purificate provano positivi per il marcatore neuronale TUJ1 e sono assenti per l'espressione S100β ( Figura 5 ).
2. Generazione di cellule simili a cellule Schwann
   1. Preparare il mezzo di induzione ialico composto da αMEM integrato con β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) e P / S (1% v / v).
   2. Piastra le neurosfere preparate nella sezione 4 in piastre a 6 pozzetti PDL / lamina rivestite ad una densità di 5-10 sfere per cm ² in 1,5 ml di mezzo induttivo gliale per pozzetto. Sostituire il mezzo di induzione degli gliali ogni 2 giorni dopo il risciacquo delle cellule con PBS.
      NOTA: le cellule di neurosfere seminate sono viste a migrare all'esterno al giorno 2. Al giorno 7, le cellule migratorie hanno un aspetto più ridotto e dovrebbero dimostrare l'immunopositività per la cellula SchwannMarcatori p75 neurotrofina recettore (p75) e S100β ⁷ . Queste cellule sono denominate SCLC.
3. Cocultura di SCLC con neuroni DRG
   1. Preparare il mezzo di coculture costituito da un mezzo di mantenimento dei neuroni DRG (fase 5.1.4) e da un mezzo di induzione ialico (fase 5.2.1) con un rapporto volume / volume di 1: 1.
   2. Preparare il mezzo di manutenzione della cellula di Schwann composto da DMEM / F12 integrato con FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL) e P / S (1% v / v).
   3. Rimuovere il mezzo di coltura dal 7 giorno SCLCs, sciacquarli con PBS e incubarli con 0,5 mL / pozzetto di reagente di dissociazione enzimatica ricombinante a 37 ° C per 5 min. Resuspendere gli SCLC in mezzo di coculture.
   4. Quantificare le cellule utilizzando un emocytometro dopo una diluizione appropriata.
   5. Seme le SCLC su colture di neuroni DRG purificate ad una densità di 1.000 cellule / cm ² . Conservare le coculture per 14 giorni, con sostituzione media ogni 2 giorni.
      NOTA: Durante la coltura, SCLC ha acquisito la morfologia tipo mandrino tipica delle cellule Schwann mature ( Figura 6 ). Queste cellule persistono nel loro fenotipo dopo il ritiro dei fattori di crescita e sono in grado di assoniare mieloni in vitro e in vivo ^{7 , 10} . La positività dei marcatori cellulari di Schwann ( es., P75 e S100β) deve essere monitorata mediante immunofluorescenza.
   6. Al termine della cocultura, le cellule di Schwann impegnate nel passaggio, come descritto nel passaggio 1.2.2. Utilizzare 0,5 ml di reagente di dissociazione per pozzetto. Quantificare le cellule utilizzando un emocytometro dopo una diluizione appropriata.
   7. Resuspendere le cellule Schwann impegnate nel destino nel mezzo di manutenzione della cella di Schwann ad una densità di 10.000 cellule / cm ² . Le cellule di semi in PDL / laminin-rivestite piastre a 6 pozzetti per immunofluorescenza.
      NOTA: le coculture contengono inevitabilmente MSC che hanno adottato un fibroblastoDestino cellulare ⁷ . Queste cellule sono passate insieme a cellule di Schwann fatte a seguito del completamento della cocultura. Le cellule Schwann che si trovano in cima a questo substrato di fibroblasto possono essere facilmente staccate e ulteriormente estese dopo il risciacquo con "getti freddi" di PBS (4 ° C), come è stato descritto altrove ¹³ . Le cellule di Schwann impegnate nel destino possono essere estese in un mezzo di manutenzione per un mese.

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Risultati

Una panoramica delle tappe chiave del nostro protocollo è illustrata nella Figura 1 . In sintesi, MSC ratto e umano sono selezionati per aderenza alla plastica della coltura tissutale. I MSC espanditi sono precondizionati con ipossia e sono quindi soggetti a condizioni di formazione della neurosfera. Le neurosfere sono placcate e consentite di differenziarsi in SCLC. Le SCLC vengono coculturate con i neuroni DRG purificati per generare cellule Schwann impeg...

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Discussione

È fondamentale preservare la "gamba" dei MSC prima dell'arricchimento dei progenitori neurali attraverso precondizionamento ipossico e cultura della neurosfera. Dalla nostra esperienza, MSC multipotenti possono essere identificati in modo affidabile dalla loro morfologia simile a fibroblasti. Al contrario, i MSC che hanno adottato una morfologia piu 'appiattita e quadrangolare, con fibre di stress sospettose prominenti, non adottano facilmente i destini delle cellule neurali e vanno scartate. In gener...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Neurobasal medium	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
Epidermal growth factor (EGF)	Thermofisher scientific	PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)	Millipore	NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)	Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her)	Millipore	01-201
Uridine	Sigmaaldrich	U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)	Sigmaaldrich	F0503
Poly-D-lysine (PDL)	Sigmaaldrich	P7886-1G
Laminin	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
Penicillin / streptomycin (P/S)	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
10 cm plate for adherent culture	TPP	93100	Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture	TPP	92006	Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture	Corning	3471	Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1)	BD Biosciences	555593
anti-human CD73	BD Biosciences	550256
anti-human/rat STRO-1	R&D Systems	MAB1038
anti-human nestin	R&D Systems	MAB1259
anti-human CD45	BD Biosciences	555480
anti-rat CD90(Thy-1)	BD Biosciences	554895
anti-rat CD73	BD Biosciences	551123
anti-rat nestin	BD Biosciences	MAB1259
anti-rat CD45	BD Biosciences	554875
Anti-S100β	Dako	Z031101
Anti-p75	Millipore	MAB5386
Anti-GFAP	Sigmaaldrich	G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
Anti-Human nuclei	Millipore	MAB1281
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES buffer	Sigmaaldrich	H4034-100G