Fourier-com base em análise de difração de viver Caenorhabditis elegans

Resumo

Este manuscrito descreve como distinguir diferentes nemátodes usando assinaturas de difração consideravelmente-campo. Comparamos a locomoção de 139 tipo selvagem e 108 "rolo" c. elegans por uma média de frequências associadas a assinatura de difração de Fraunhofer temporal em um único local usando um laser de onda contínua.

Resumo

Este manuscrito descreve como classificar nemátodes usando assinaturas de difração de longe-campo temporal. Um único c. elegans é suspenso em uma coluna de água dentro de uma cubeta do óptica. 632 nm onda contínua aqui vai laser é dirigido através da cubeta usando espelhos de superfície frontais. Uma distância significativa de pelo menos 20-30 cm viajado depois a luz passa através da cubeta garante um padrão de difração (Fraunhofer) consideravelmente-campo útil. As mudanças do padrão de difração em tempo real como o nematódeo nada dentro do feixe de laser. O fotodiodo é colocado fora do centro no padrão de difração. O sinal de tensão proveniente do fotodiodo é observado em tempo real e gravado usando um osciloscópio digital. Este processo é repetido para 139 tipo selvagem e 108 "rolo" c. elegans. Vermes do tipo selvagem exibem um padrão de oscilação rápida na solução. Os vermes "rolo" tem uma mutação em um componente-chave da cutícula que interfere com locomoção macia. Intervalos de tempo que não estão livres de saturação e a inatividade são descartados. É prático dividir cada média por seu máximo para comparar intensidades relativas. O sinal para cada worm é a transformada de Fourier para que o padrão de frequência para cada verme emerge. O sinal para cada tipo de verme é média. Os espectros de Fourier em média para o tipo selvagem e o "rolo" de c. elegans são distintamente diferentes e revelam que as formas de worm dinâmico das duas estirpes worm diferentes podem ser distinguidas usando análise de Fourier. O espectro de Fourier de cada estirpe worm coincidir com um modelo aproximado usando duas formas diferentes de worm binário que correspondem a momentos locomotora. O envelope com a distribuição de frequência em média para vermes reais e modelados confirma o modelo coincide com os dados. Este método pode servir como base para a análise de Fourier para muitas espécies microscópicas, como cada microorganismo terá seu único espectro de Fourier.

Introdução

Este método compara espectros de frequência experimental e modelada a locomoção de c. elegans usando duas linhagens com diferentes padrões locomotora. Os resultados mostram que o espectro de frequência depende de mudanças temporais como o nematódeo nada em uma coluna de água, para que imagens microscópicas clara não são necessários para a análise. Este método permite a análise em tempo real quantitativa e fornece informações complementares para imagens e vídeos obtidos com microscópios tradicionais. Difração de Fraunhofer, também chamada de difração consideravelmente-campo, fornece a base para a obtenção de dados de difração ao vivo^1,2. A intensidade da luz em qualquer ponto no padrão de difração é o resultado da sobreposição de luz de cada ponto do contorno do nematoide³. Como resultado, a intensidade da luz coletada ao longo do tempo carrega informações sobre a locomoção do nemátodo. Analisar o sinal de difração de tempo-dependente pode identificar o movimento característico do mutante correspondente desde analisar todas as frequências envolvidas na locomoção complementa a tradicional análise de vídeo. Neste caso, confirmam-se as diferenças características entre a locomoção do "rolo" e selvagem tipo c. elegans , comparando os espectros de frequência das duas estirpes diferentes do nemátodo do pinheiro.

Algumas características anteriores foram confirmadas através da análise de frequência de sinais de difração, como natação frequências^2,4. Mais importante ainda, este método pode ser usado como um método complementar para microscopia tradicional para observar a locomoção em tempo real na tela do computador, como os dados estão sendo coletados. O espectro de frequência de vermes com padrões distintos de locomotor pode ser quantificado por considerar que o Fourier transforma sinal do sinal de difração.

A natureza multidisciplinar da difração de Fourier-baseado neste trabalho envolve os campos da biologia e da física. Difração por sob amostragem tem sido muito utilizada para investigar estruturas de cristal em biologia⁵ e outros campos. Neste experimento, no entanto, oversampling^6,7 cria o padrão de difração consideravelmente-campo para que o organismo está centralizado no feixe de laser. Sobreamostragem é normalmente usada para lente menos imagem⁸ em conjunto com um algoritmo de recuperação de fase que reconstrói uma imagem do objeto original. Fase de recuperação é difícil de alcançar quando para disseminar está presentes, como é o caso com um nematódeo. A assinatura de difração temporal é suficiente para avaliar frequências chaves do movimento de verme. Esse método é menos desgastante computacionalmente e fornece um caminho óptico para quantificar a locomoção. Esta técnica pode ser facilmente adaptada para a análise de mutações ou condições ambientais que alteram o comportamento.

Protocolo

1. manutenção e crescimento de c. elegans

1. preparar pratos de cultura nematoide.
   1. Encher os pratos de Petri com uma solução de agar e deixá-los para solidificar-se, em seguida, estirpe de semente com uma cultura de Escherichia coli do OP50 ^{9 , 10}.
2. Preparar uma população inicial de nematoides adultos em cada prato, movendo vários vermes adultos para fresco cheio de ágar de Petri com um patch de Escherichia coli. Manter as culturas nematoides a 20 ° C em uma incubadora.
   Nota: Cepas nematoides podem ser obtidas do centro de genoma elegans de Caenorhabditis. Para este estudo, o tipo selvagem, N2, tensão e o OH7547 (otls199 [gato-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) tensão, que exibe um fenótipo de rolo, foram utilizadas.
3. Propagar vermes para culturas futuras.
   1. Remover o Petri prato contendo c. elegans e um habitat não utilizado de Petri da incubadora com temperatura controlada. Colocá-los no palco de um microscópio dissecação.
   2. Acender o queimador de Bunsen e esterilizar a palheta de nematoides platina colocando o metal a chama até brilha vermelho. Permita a escolha arrefecer à temperatura ambiente. Não definir a palheta para baixo ou deixe-a escolher entrar em contato com contaminantes.
   3. Tocar suavemente a ponta da palheta até a borda do círculo de bactérias. Esta substância é pegajosa e fará a colheita individuais nematoides adultos mais fácil.
   4. Transferir até 4 gravid nematoides para uma placa de Petri cheia de ágar nematódeo crescimento médio (NGM) e incube a 20 ° C. Os vermes colocarão ovos que vencerão em quatro dias.
   5. Retornar os nematódeos restantes para a incubadora após mover quatro nematódeos adultos.

2. Configuração óptica ( Figura 1)

1. seguro o hélio-neon laser perto do canto esquerdo atrás de bancada óptica e conectá-lo a uma fonte de poder.
   Nota: O laser ' feixe s deve cumprir os requisitos para sobreamostragem. O c. elegans são aproximadamente 1 mm de comprimento, portanto o feixe de laser deve ter um diâmetro maior que 2 mm, enquanto o incidente sobre o nemátodo do Pinheiro, mas não superior a 5 mm, para que o padrão de difração não é difícil de localizar.
2. Coloque um filtro de densidade neutra entre o laser de hélio-neon e a amostra de tal forma que o feixe de laser percorre o filtro antes de chegar a amostra.
3. Usando alumínio superfície frontal de direção dois espelhos, construir um periscópio, fixando-se o primeiro espelho após o filtro de densidade neutra. Fixe o espelho segundo cerca de 10 cm abaixo o primeiro espelho para dar espaço para orientar o feixe de laser e inserir a cubeta entre os espelhos. Alinhar o raio laser e a cubeta do modo que o feixe de laser percorre verticalmente a cuvete.
   Nota: A distância entre o organismo diffracting o fotodiodo deve ser muito maior do que o organismo em si para alcançar o distante-campo difração. Neste experimento, a distância entre a cubeta para o fotodiodo é de 20 cm.
4. Segura o fotodiodo diretamente em frente ao espelho a segunda com seu sensor de frente para o espelho.
   Nota: A cubeta contendo o nematódeo será colocada entre os dois espelhos utilizando grampos de química. Consulte as seções 4 e 5.
5. Colocar uma cubeta cheio de água para depor. Ajuste a altura do estande. Ajustar as alturas e os ângulos de mirror 1 e mirror 2 de modo que o feixe de laser percorre a cubeta vista perto mas não diretamente o fotodiodo.
6. Use um nível para garantir a forma de bancadas uma superfície nivelada para a cubeta. Se necessário, reajustar os espelhos mais.
7. Conectar o fotodiodo osciloscópio digital usando o cabo USB fornecido com o osciloscópio digital. Conecte o osciloscópio digital para o computador que será usado para gravar e salvar os dados.

3. Instalação do osciloscópio

1. usando o software para o osciloscópio no computador, defina a taxa de amostragem pelo menos 8 Hz para resolver o ciclo de goleada do worm suficientemente.
   Nota: A taxa de amostragem deve ser mais do dobro que das frequências esperadas goleada da espécie para que o teorema de Nyquist ¹¹ é satisfeita.

4. Preparando o verme e a Cuvette para coleta de dados

1. transferir quatro nematoides adultos para um fresco NGM ¹⁰ cheio de ágar Petri prato utilizando um palito fino, achatado fio de platina (ver secção 1.3).
2. Remover uma cubeta descartável de plástico da embalagem, tendo o cuidado de só tocar a cubeta em seus lados estriadas.
3. Uso uma micropipeta para pipetar água destilada para a cubeta até a cubeta é aproximadamente 80% preenchida com água destilada.
   Nota: É importante somente água destilada ou ionizadas buffers como M9 ¹⁰ ou tampão fosfato salino (PBS) ao manusear os nematódeos, como a água da torneira contém compostos de microorganismo-matança.
4. Colocar o prato de Petri contendo o c. elegans, para ser usado em um escopo de dissecação.
5. Usando a picareta platina, retire o prato de Petri um maduro c. elegans e mergulhe a palheta da cubeta, movendo-se a palheta em círculos se necessário para desalojar o nematódeo.
6. Para evitar bolhas, formando-se na cubeta, encher a cubeta com água até que protrai ligeiramente sobre a cubeta ' top s. Encher a cubeta ' cap s inteiramente com água, em seguida, rapidamente, coloque a tampa para a cubeta.
7. Use um pano de limpeza óptico para remover as gotas de água que podem ter derramado sobre e ópticos de limpeza papel para limpar quaisquer pequenas gotículas restantes.

5. Aquisição de dados em tempo real das mudanças de intensidade de padrão de difração

1. ativar o hélio-neon laser e ajustar a configuração de frequência/cor para que produz um feixe vermelho. Ligue o sensor.
   Atenção: Usar um feixe de baixa energia em 632 nm, como c. elegans evitar luz de alta frequência (azul) ¹².
2. Localizar o verme da cubeta. Segurando a cubeta em seus lados estriadas, delicadamente incline a cubeta até nematódeo é aproximadamente no centro da parte da cuvete.
   Nota: A tremer ou inclinando a cubeta violentamente faz com que o worm colidir com as paredes da cubeta. Isso pode danificar o nemátodo do pinheiro.
   1. Lugar da cubeta para depor no sistema óptico, centrando o verme dentro do laser ' feixe s refletida do Mirror 1 Mirror 2. Certifique-se de eliminar luz.
3. Center o verme no feixe de laser.
   1. Coloque o fotodiodo no padrão de difração, de modo que a localização do fotodiodo e o central no máximo o padrão de difração não coincidem.
   2. Ajustar o filtro de densidade neutra para evitar a saturação do fotodiodo. Girando a roda do filtro de densidade neutra regula a intensidade da luz.
      1. Girar a densidade neutra de filtro para que aumenta a tensão de saída a partir do fotodiodo.
         Nota: A saída de tensão é observada usando o software para o fotodiodo digital. O fotodiodo é saturado, se a tensão não muda. Nesse caso, gire o filtro de densidade neutra até que a tensão reduz sem achatamento para fora em uma leitura mínima. Certifique-se de que o sinal de tensão não achatar com as leituras de pico, indicando saturação do fotodiodo. Reduzir a intensidade da luz rodando a roda de filtro de densidade neutra se for observada saturação.
   3. Uma vez que o padrão de difração em movimento é visíveis, coletar dados com o fotodiodo clicando no botão iniciar o software controlando o osciloscópio enquanto monitora o verme ' movimento s. Continuar a tomar medidas, até que o verme se move fora do raio laser e o diffracção padrão desaparece, que normalmente leva cerca de 20 s.
      1. Para a coleta de dados processo clicando no botão de paragem do software para o osciloscópio. Salvar cada julgamento ' dados em formato. csv ou. txt.
4. Repita os passos 5.2-5.3 até pelo menos 50 conjuntos de dados foram coletados para cada fenótipo. Usar animais de oito a dez por julgamento.
5. Se a cubeta é riscado dispose e o worm, e repita a etapa 4. Se o worm é prejudicado na transferência, descartá-lo e lave a cubeta com água destilada antes de repetir a etapa 4 usando a mesma cubeta.
6. Repita o passo 5, usando o OH7547 " rolo " tensão, tendo o cuidado de rotular os dados para indicar a tensão de worm.

6. Espectro de Fourier de dados

1. importar os dados adquiridos em um programa de análise de dados capaz de realizar Discrete Fourier transforma ³.
2. Executar Fourier transforma-se em cada conjunto de dados usando a opção de transform (FFT) de Fourier rápida do software.
3. Média das frequências dos resultados da FFT para cada amplitude para o tipo selvagem N2 vermes.
4. Repita o passo 6.3 usando a Fourier do OH7547 " rolo " vermes.

7. Modelagem do espectro de Fourier

1. programa um modelo binário do nemátodo locomoção (ver programa incluído nos materiais suplementares).
   Nota: Este modelo é uma aproximação áspera, que no primeiro, ele exibe as características proeminentes do movimento de verme. O modelo pode ser refinado como os resultados são comparados com vermes reais. Formas de worm são aproximações usando microscópio imagens ¹³.
   1. Criar quadros sequenciais do modelo binário movendo-se através de pelo menos dois ciclos de worm ( Figura 2a). Veja os vídeos dos materiais suplementares; C Worm vídeo (CWorm.avi) e vídeo W Worm (WWorm.avi).
2. Produzir padrões de difração sequencial. Veja os vídeos dos materiais complementares. C Worm difração vídeo (CWormDiff.avi) e Worm W vídeo (WWormDiff.avi).
   1. De Fourier cada binário quadro da imagem worm. Quanto maior o preenchimento do quadro ao redor do worm, o melhor a resolução da imagem de difração será.
      Nota: O valor absoluto de cada quadro de transformada de Fourier é proporcional para o padrão de difração correspondente ( Figura 2b).
   2. Ajustar o contraste do padrão de difração, mapeando as intensidades do padrão de difração para uma escala logarítmica.
      Nota: As câmeras e os olhos tendem a funcionar em uma escala não-linear. Uma escala logarítmica pode simular como um padrão de difração é normalmente percebido pelo olho humano.
3. Extrair o sinal de difração modelados.
   1. Escolher uma localização fora do centro que corresponde à posição do fotodiodo no padrão de difração.
   2. Adicionar os elementos de matriz vizinhas ao redor a localização do fotodiodo para simular o tamanho do fotodiodo. O tamanho do fotodiodo é tipicamente 0.1% do padrão de difração modelados.
   3. Registro e trama a sequência da magnitude da difração de sinais. Verifique se o sinal é fisicamente razoável (ou seja, no caso de periódica surra, o sinal do fotodiodo deve ser periódico também).
4. Fourier transforma o sinal de difração Obtido em 7.3 e comparar resultados com os dados experimentais.
5. Repetir por várias cepas de verme e comparar.

Resultados

A óptica instalação experimental mostrada na Figura 1 permite o estudo de microorganismos sem ser amarrado a um plano focal. O sinal de goleada do fotodiodo pode ser observado em tempo real na tela do computador, como os dados são coletados. Padrões incomuns será visíveis imediatamente sem ter que analisar um vídeo em detalhes.

Exemplos de movimento modelados worm sequencial e difração correspondente padrões são mostrados na Figura 2. Os padrões de difração modelados qualitativamente assemelham-se padrões experimentais¹ e são uma indicação inicial que as simulações modelo com êxito o nemátodo do pinheiro.

Uma assinatura de difração temporal de amostra dos dois tipos de c. elegans estudada aqui é mostrada na Figura 3. Ele pode ser visto qualitativamente que cada nematoide debulha em diferentes taxas e amplitudes. Algumas das diferenças podem ser quantificadas através de encaixe como foi feito na publicação anterior¹de curva. A discreta de Fourier, no entanto, revela mais detalhes sobre frequências incorporadas:

, (1)

onde F_k é o digital de Fourier (FT) e f_n é o sinal de difração bruto dependente do tempo, com o tempo discreto n a variável e a variável de frequência discreta k. N é o número total de pontos de dados. A média de Fourier digital permite o nematódeo ser identificado pela amplitude do seu espectro de frequência de difração (Figura 4). O espectro de tipo selvagem é dominado por frequências mais baixas do que o espectro do movimento do rolo.

Um modelo que se aproxima o tipo selvagem contra as notas de c. elegans do rolo do tipo selvagem tende a goleia em um movimento de (forma W ou S) forma de onda (Figura 2a), enquanto o rolo tende a favorecer um lado que mais ou menos semelhante a uma forma de C oscilante ( Figura 5). Isto oferece uma explicação para os diferentes espectros. O rolo principalmente formarão um C para um lado enquanto a oscilação W pode ser pensada como dois opostos C movimentos. Por este motivo, o movimento de W é mais complexo, revelando as frequências baixas secundárias mais do que o movimento de C. Este resultado é confirmado no modelo computacional. A forma de W tem uma densidade de frequência muito maior do que a forma de C (Figura 6). Isso é confirmado no FFT na Figura 4 , onde as frequências de rolo são agrupadas mais enquanto não completamente discreta. As estatísticas do rolo são distorcidas desde o rolo pode reverter para locomoção de tipo selvagem temporariamente.

Os espectros de potência suavizados de rolo tipo c. elegans mostra um pico amplo no ~1.5 Hz, enquanto o natação selvagem tipo c. elegans exibe um espectro multimodal (incluindo picos a ~1.0 Hz e Hz 1,75). O fotodiodo (PD) tem um tamanho finito espalhando sobre vários elementos de matriz. Elementos de matriz individual ou pontos sobre o padrão de difração variam em intensidade desde que varia de interferência construtiva e destrutiva; no entanto, as frequências em que variam as intensidades são o mesmo para todos os elementos de matriz, como pode ser visto na Figura 7. Considerando a derivada do tempo EQ. 1, pode ser visto que as flutuações de frequência não depende na matriz da fase, mas somente em flutuações do objeto original:

, (2).

Como o PD se espalha sobre vários elementos de matriz, os locais de pico médio para um perfil de frequência consistente. Algumas variações podem ser esperadas e podem dar pistas sobre a orientação do worm. A distribuição de frequência vai mudar como a marcha das mudanças worm. O modelo atual é um modelo simples que só permite a avaliação dos locais de pico ao invés de alturas ou relativo. Diferentes padrões locomotora média para locais diferentes de pico.

Figura 1. Instalação experimental. As viagens de feixe de laser de baixa potência através do filtro de densidade neutra, é refletida pelo espelho M1 para baixo através da cubeta que contém o worm no espelho M2 e viaja para o fotodiodo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Verme sequenciais formas e padrões de difração correspondente. (um) alguns selecione imagens binárias sequenciais do modelado W forma nematódeos e os padrões de difração sequencial correspondentes (b). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Assinaturas de difração da amostra experimental. Assinaturas de difração coletados para (um) OH7547 "rolo" e (b) N2 selvagem tipo c. elegans , usando um único fotodiodo no padrão de difração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Experimental em média potência espectros de rolo e série de difração de Fraunhofer de tipo selvagem. O show de espectros as frequências presentes na média de Fourier da série tempo gravado com o fotodiodo. Um filtro gaussiano de desvio padrão 0,075 Hz, truncado no 3 desvios-padrão, é usada para a suavização. Observe o pico espectral largo em ~1.5 Hz no espectro do rolo suavizados, comparado com o espectro de multimodal suavizados selvagem tipo (incluindo picos a ~1.0 e 1.75 Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Ilustração de formação difração. Padrões de difração podem ser modelados por pensar em cada segmento de linha como uma linha reta infinitamente pequena (à esquerda). Sobrepondo estas linhas (à direita) demonstra a construção de padrões de difração consideravelmente-campo gerado por um C em forma de nematódeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Simulado de espectros de potência do rolo e série de difração de Fraunhofer de tipo selvagem. (um) C forma e (b) W forma minhocas com o fotodiodo centrado nos elementos de matriz 200 (vertical) e 175 (horizontal). A forma de W mostra uma densidade mais elevada das frequências devido a locomoção mais complexa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Simulado de espectros de potência do rolo e série de difração de Fraunhofer tipo selvagem em locais diferentes do fotodiodo. (um) W forma verme e o verme de forma (b), C para elementos de matriz única em vários locais, simulando vários locais do fotodiodo. Alturas variam por vários locais; no entanto, locais de pico são os mesmos para formas específicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Incluindo os trechos de dados com a inatividade distorcerá os resultados desde frequências mais baixas de artificiais vão ser em média em resultados. Saturar o fotodiodo pode ser reconhecido por picos planos ou picos de "cortar" os dados em bruto. Dividindo cada conjunto de dados bruto por intensidades de pico vai ajudar com a contabilidade para as flutuações na intensidade do laser.

As frequências de pico são um indicador da global se debatendo a frequência; no entanto, o movimento complicado causa interferência em frequências beat no padrão de difração e precisa ser examinado cuidadosamente.

Esse método pode ser usado para investigar a locomoção de outros nematoides. O ambiente pode ser alterado para outro meio. Comprimentos de onda podem ser alterados também. Trabalhando na faixa visível do espectro eletromagnético é mais fácil e mais seguro.

Um modelo mais refinado simulará os espectros de difração mais realisticamente no futuro. Um futuro modelo pode incluir um worm que pode alterar as orientações, que não afetaria a frequência locais mas alturas ou relativo. Um modelo mais realista permitiria uma distribuição probabilística de frequências de goleada, que iria ampliar os picos como os dados experimentais. Uma propagação em frequências explicaria as variações nas frequências de goleada.

A forma atual do worm é bruta, especialmente na região da cabeça e cauda, que deve ser mais cônico do que no modelo atual. Pode ser interessante realizar uma análise detalhada da série hora do sinal desde que pode dar pistas sobre a complexidade da locomoção em diferentes mutantes.

Vale a pena considerar a praticidade de expandir essa técnica para caracterizar vários nematoides simultaneamente. Este método deve ser entendido como um método complementar aos métodos existentes usando microscópios tradicionais. Este método tem a vantagem de não exigir um microscópio durante a aquisição de dados para que o worm pode mover-se fora do plano focal. Os espectros de frequência média mostram claras diferenças no movimento do verme e podem ser quantificados pelos picos de frequência predominante, que é um método novo para quantificar a locomoção da minhoca. Análise de dados de assinaturas de difração está em desenvolvimento e espero que conduzirá a um processo de identificação automatizada de vários mutantes e indivíduos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
Photodiode: SI Amplified Detector	Thorlabs	PDA 100A
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5	Plastic cells may be used as well.
MatLab (Software)	MathWorks	R2016b (9.1.0.441655)	Use the fft command to simulate diffraction
Excel	Microsoft	14.7.1	Used for data analysis of Figure 4
Caenorhabditis elegans Roller	University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)	Strain: OH7547 Genotype: otIs199.	https://cbs.umn.edu/cgc/home
Caenorhabditis elegans Wild Type	University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)	Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate	https://cbs.umn.edu/cgc/home