Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Resumo

Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.

Resumo

Doença arterial coronariana (DAC) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Aterosclerose, dos principais causa de CAD, é iniciada pela transmigração de monócitos imunes inatas para sites inflamatórias de lipídio depositado chamado estrias gordurosas, que estão presentes nas paredes arteriais de médio para grandes artérias. A principal característica patogênica de lesões nesta fase inicial da aterosclerose é a maturação dos monócitos que migram em artérias para formar células de espuma ou macrófagos carregados de lipídios. Considerável evidência suporta a hipótese de que o risco de aterosclerose é aumentado por condições inflamatórias crônicas que acompanham doenças como artrite reumatoide e HIV, bem como o envelhecimento geral, e que esse risco é predito por monócitos ativação. Enquanto rato modelos fornecem uma boa plataforma para investigar o papel dos monócitos no atherogenesis na vivo, eles exigem alteração genética do metabolismo do colesterol natural e alteração drástica de dietas de rato normal e tem limitado a sua aptidão para o estudo das influências aterogênico doenças comórbidas humana. Isto motivou-na desenvolver um modelo humano em vitro para medir o potencial aterogênico de monócitos isoladas de indivíduos com doença definidos Estados. Atualmente, modelos humanos em vitro limitando em que avaliam a formação de células transmigração e espuma monócito em isolamento. Aqui descrevemos um protocolo em que monócitos isolados do paciente sangue transmigrar através de células endoteliais humanas em uma matriz de colágeno tipo 1, e sua propensão para amadurecer-se em células de espuma na presença ou ausência de lipídios exógenos é medido. O protocolo foi validado para o uso de monócitos humanos purificado de indivíduos com infecção pelo HIV e idosos indivíduos HIV infectado. Este modelo é versátil e permite monócito transmigração e espuma formação de célula a ser avaliada usando qualquer microscopia ou citometria de fluxo, bem como permitindo a avaliação de factores aterogênico presentes no soro ou plasma.

Introdução

Transmigração de monócito é um passo crucial no desenvolvimento da placa de ateroma que pode levar à trombose, derrame e infarto do miocárdio. Ateroma desenvolve de listras gordas, geralmente presentes em locais de fluxo sanguíneo oscilatório baixo em meio às grandes artérias, onde depositada lipídica contribui para ativação endotelial e localizadas inflamação¹. Os monócitos são recrutados para células endoteliais em listras gordas através de proteínas Quimiotáticos de monócitos (tais como CCL2) e transmigrar para o íntima². Após a transmigração, monócitos podem formar macrófagos aterogênico, lipid-laden chamados espuma de células em consequência da absorção de lipídios, síntese de lipídios, para baixo-regulamento de efluxo de colesterol ou uma combinação dos fatores acima. Os monócitos também podem acumular lipídeos na circulação e têm um fenótipo 'espumoso', possivelmente predisponentes células de espuma celular formação^3,4. Células de espuma são a característica definidora de listras gordas e estágios iniciais de ateroma e sua formação é influenciada pela lipídico e mediadores inflamatórios⁵. Alternativamente, os monócitos têm a capacidade de reverter transmigrar da artéria para a corrente sanguínea⁶, eliminando lipídico da íntima e agindo para manter a saúde das artérias.

Determinar a propensão dos monócitos para transmigrar através de endotélio arterial e forma as células de espuma em íntima, ou reverter transmigrar e transportar lipídios fora a placa, é um requisito-chave para compreender o papel da ativação de monócitos no aumento risco de aterosclerose. Modelos de mouse de CADs como aterosclerose são importantes na elucidação de informações em tempo real na vivo no desenvolvimento de placa aterosclerótica/raia gordurosos. No entanto, estes modelos requerem uma alteração genética do colesterol natural processamento habilidades destes animais geralmente associada a alterações drásticas na dieta (por exemplo, o modelo de dieta/ApoE-Western-tipo)^7,8, desse modo, induzindo a acumulação não-fisiológica de lipídios em circulação os níveis que desenvolvimento de placa de carro. Estes modelos podem ter limitada relevância para inflamatórias humanas condições crônicas tais como a infecção pelo HIV que não estão associados com aumento níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou colesterol de circulação. Além disso, as diferenças em biologia monócito entre humanos e ratos fazem os testes imunológicos perguntas sobre a relevância de subpopulações de monócitos (tais como intermediários monócitos (CD14 +⁺CD16⁺))⁹ é difícil. Isto é importante quando se estudar os mecanismos de condução doença cardiovascular como contagens de monócitos intermediário independente preveem eventos cardiovasculares^10,11. Enquanto os ensaios existem para medir sequencialmente de qualquer formação monócito transmigração ou espuma de célula isoladamente, sem ensaio em vitro foi validado para quantificar os dois aspectos do atherogenesis início, usando as mesmas células de coortes clínicas. Transwell modelos utilizam um sistema de duas câmaras Boyden modificado pelo qual as células são carregados na câmara superior e transmigrar através de uma barreira de plástico porosa ou monocamada de células em uma câmara inferior que normalmente contém mídia com quimiotático^{12 , 13}. enquanto amplamente utilizado para a análise de transmigração de leucócitos, estes modelos não incorpora geralmente uma camada representando a íntima, resultando em células transmigra migrando em solução e não permitem a medição de célula de espuma formação ou reversa transmigração das mesmas células. Por outro lado, modelos de formação de célula de espuma não representam qualquer alteração induzida por transmigratory monócitos ou efeitos de ativação endotelial, que é conhecido por contribuir para a formação de célula¹⁴de espuma. Além disso, estes sistemas induzem espuma formação de células de macrófagos aderiu às placas de cultura de células através da adição de saturar as concentrações de lipoproteína de baixa densidade oxidada exógenos (RJ)^15,16, um indutor de chave de formação de célula de espuma. LDL usada nestes modelos é muitas vezes oxidado por processos não fisiologicamente-relevantes como CuSO₄ tratamento¹⁷, portanto, questionando a importância fisiológica de estudos usando estes modelos.

Aqui descrevemos um ensaio que quantifica a transmigração de monócitos e formação de célula de espuma das mesmas células que não requer a adição de RJ exógeno, assim, melhor modelagem o papel dos monócitos na formação de células de espuma. Este modelo foi originalmente desenvolvido pelo Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸e foi ainda mais refinado em nosso laboratório para avaliar ex vivo a caracterizações de monócitos isolados sob não-ativação condições de indivíduos com condições inflamatórias subjacentes que acompanham doenças como HIV infecção¹⁹ bem como envelhecimento²⁰, que estão associados com um risco aumentado de aterosclerose. Este modelo também fornece uma plataforma para responder questões biológicas básicas sobre a propensão de subconjuntos diferentes monócito forma espuma células²⁰, a influência da ativação endotelial por citocinas como TNF na formação de célula de espuma¹⁴ e as propriedades migratórias de monócitos, tais como a profundidade e a velocidade de transmigração em géis¹⁹. Além disso, formação de células de transmigração e espuma de monócito pode ser quantificada usando microscopia padrão, vive a imagem latente da pilha, citometria de fluxo imagem e citometria de fluxo, portanto, fornecendo um método versátil para avaliar o papel de monócitos em atherogenesis.

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Protocolo

Nota: todos os experimentos utilizando amostras biológicas humanas foram realizados com aprovação ética do Alfred Hospital humano Comitê de ética, Melbourne. Todos os experimentos foram realizados em classe II biossegurança armários a menos que especificado. " Prewarmed " refere-se aos reagentes aquecidos a 37 ° C em banho-maria.

1. preparação do tipo I fibroso colágeno géis: dia 1

1. preparar polimerizado gel de colágeno sequencialmente adicionando e misturando 35,7 mM NaOH, 0.71 x M199, 4,58 mM de ácido acético e 1,71 mg/mL colagénio tipo I fibroso em um poliestireno 5ml tubo, conforme tabela 1.
   Nota: Certifique-se que o colágeno é bem misturado, pipetando suavemente e descer 5 vezes para evitar a formação de colágeno ' bolsos ' a mistura de gel. Preparar o gel de 4-6 por condição de teste para microscopia ou 15 géis por condição de teste para citometria de fluxo.
2. Uma vez bem misturadas, alíquota de 50 μL de mistura de gel de colágeno em cada poço de uma placa estéril cultura de tecidos de 96 poços fundo chato. Não use o exterior de linhas e colunas, mas preenchê-las com 200 µ l de 1 x Dubecco ' tampão s fosfato salino (PBS) para proteger os géis de dessecação. Incubar as placas a 37 °C/5% CO ₂ por 2 h permitir que o colágeno polimerizar.
   Nota: Coloque as placas diretamente nas prateleiras de metal limpa na incubadora para garantir a distribuição de calor mesmo.
3. Após a incubação, sobrepor os géis com 150 µ l de 1 x M199 completados (ver Tabela de materiais) e incube por 5 dias até o uso.

2. Expansão de armazenados HUVEC: 1 dia

1. rótulo e casaco um diâmetro de 10 cm de Petri com 1 mL de 50 µ g/mL de fibronectina diluído em 1X PBS e incubam à temperatura ambiente durante 10 min.
2. Thaw alíquotas de umbilical humana primária criopreservado veia células endoteliais (HUVEC, 1,0 x 10 ⁶ células) em 10 mL M20.
   Nota: HUVEC deve ser preparado como descrito anteriormente a ²¹ e usado em um número de passagem baixa (< passagem 4). HUVEC pode ser substituído por células endoteliais coronarianas humana aqui.
3. Resuspenda HUVEC M20 de 10 ml e adicionar ao prato revestido de fibronectina, por aspiração de fibronectina em excesso antes da adição de células e a cultura de confluência (cerca de 5 dias), substituindo os meios de comunicação no dia 3.

3. Cultivo HUVEC monocamada em gel de colágeno: dia 5

1. no dia 5, desanexar HUVEC aspirar o sobrenadante do prato de Petri de cultura e lavando afastado mídia contendo soro com 10 mL de soro livre M199.
2. Adicionar 5 mL 0,05% tripsina/0,53 EDTA in M199 HUVEC e incubar durante 1-2 min à temperatura ambiente, agitando suavemente até que as células desanexar.
3. Uma vez separada, rapidamente lave o tubo de ensaio com 5 mL M20 e transferir a mídia contendo células para um tubo de 10 mL.
4. Amostras de centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 200 µ l de M20 e contar células usando um hemocytometer.
5. Ressuspender as células para 2,0 x 10 ⁵ células/mL em M20, aspirar o M199 sobre o gel da placa de 96 poços (etapa 1.3) e adicionar 100 µ l de ressuspensão HUVEC (2,0 x 10 ⁴ células) para cada gel de colágeno preparado acima (etapa 1.2). Placas de cultura por mais 3 dias a 37 °C/5% CO ₂.
   Nota: A integridade da monocamada HUVEC pode ser confirmada depois de 3 dias por nitrato de prata coloração ²² ou imuno-histoquímica para junção apertada proteínas ²³ nesta fase. Géis adicionais devem estar preparados para essa finalidade.

4. Ativação de HUVEC monocamada e isolamento/ativação de monócitos para transmigração: dia 8

1. no dia 8, ativar cada monocamada HUVEC antes da adição de monócitos aspirando o M20 mídia sobrepondo os géis e adicionar 100 µ l de 10 ng/mL TNFa humana em M20 por gel. Incubar a 37 °C/5% de CO ₂ para 4 h.
   Nota: As condições não está ativado HUVEC podem também ser incluídas se necessário como controles.
Técnicas para selecionar negativamente para as células de acordo com o fabricante de esferas de monócitos
2. durante o 4 h HUVEC etapa da ativação, isolada de PBMC usando magnético ' instruções s. Um mínimo de 6,5 x 10 ⁶ PBMCs deve ser usado nesta etapa para recuperar confiantemente 3.0 x 10 ⁵ monócitos, necessários para uma condição, como os monócitos normalmente representam aproximadamente 10-15% de PBMC.
   Nota: Para avaliar o efeito da ativação de monócitos, antes da formação de células de transmigração e espuma de monócitos, monócitos podem ser ativados nesta fase. Os monócitos podem ser isolados de PBMC descongelado se necessário (ou seja, as amostras de pacientes armazenadas). Subconjuntos de monócitos isolados por FACS classificação podem ser preparados por adição de géis (Figura 1).

5. Transmigração de monócitos humanos primários: dia 8

1. para medir a transmigração de monócitos, remover mídia contendo TNFa e lave o gel duas vezes com 100 µ l M199 adicionando e removendo mídia. Lavagem, a seguir adicionar 2,0 x 10 ⁵ recém isoladas ou descongelado e lavado criopreservado PBMCs ou 5.0 x 10 ⁴ recentemente isolados de monócitos ou purificado subconjuntos de monócitos de monocamadas HUVEC em 100 µ l M20. Incube durante 1 h a 37 ° C e 5% CO ₂ para permitir a transmigração para a frente de monócitos no gel. É melhor permitir que 6 poços para cada condição experimental examinados.
   Nota: Para avaliar o efeito do soro autólogo na formação de células de transmigração e espuma, incubar as células com M20 contendo a concentração desejada de soro inativado por calor e comparar com as condições com um controle em pool de soro humano. Leucócitos, além de monócitos podem ser adicionados nesta fase. Se investigar o impacto da espécie de lípidos/lipídios específicos (por exemplo, HDL, oxHDL), executar todas as etapas seguintes com mídia livre de soro contendo lipídios de 20-50 µ g/mL.
2. Após 1 h de transmigração para diante, coletar as células não-transmigra lavando gel duas vezes com 100 µ l de 1mm escaldada EGTA em PBS 1x e uma vez com 100 µ l M199 (mesma Centrifugue condições), reunindo os sobrenadantes de cada poço do mesmo condição experimental (geralmente 6 poços) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo. Centrifugar as células não transmigra a 4 ° C, 300 x g durante 5 min e Resuspenda em 30 µ l 1X PBS.
3. Contar as células coletadas no sobrenadante para determinar o número de células transmigra para diante.
4. a percentagem de células transmigra para a frente é determinado como segue:
   
5. cobrir o lavado géis contendo células transmigra com 100 µ l M20 e incube por um mais h. 48
6. Após 48 h, recolher o sobrenadante e células não-transmigra de lavar duas vezes com 100 µ l pré-aquecido 1mm EGTA/PBS, recolha e partilha o sobrenadante de cada condição como na etapa 5.2.
   Nota: O fenótipo das células transmigra reversos pode ser ensaiado com estas células fcitometria de fluxo padrão seguindo protocolos de coloração.
7. Centrífuga células a 4 ° C, 300 x g durante 5 min e ressuspender as células em 30 µ l 1X PBS. Contar as células e determinar a viabilidade através de coloração azul trypan.
8. Determinar a percentagem de células transmigra inversa usando a seguinte equação:
   
   Nota: contabilidade para o número total de células transmigra para frente dá uma indicação mais precisa de transmigração reversa como é improvável transmigração direta será 100%.
9. Para análise por microscopia, corrigir os géis adicionando formol de 2% 100 µ l (concentração final) para cada poço, cobrir as placas em alumínio da folha e armazenar a 4 ° C até análise. Por citometria de fluxo, não corrigi as células nesta fase. Consulte os protocolos abaixo para microscopia (secção 6) ou análise de fluxo cytometry (secção 7).
   Atenção: O formaldeído é tóxico e corrosivo; Use equipamentos de proteção individual (EPI). Tenha cuidado ao adicionar formol, no entanto, esta etapa não precisa ser executada em uma coifa devido a baixa concentração utilizada.

6. Quantificação de células de espuma e macrófagos pela microscopia (óleo-vermelho O Stain)

1. remover o formaldeído e lavar os géis com 100 µ l de metanol a 50% (v/v) por 5 min e depois 100 µ l 78% (v/v) metanol durante 15 min.
   Nota: As coloração etapas podem ser executadas na bancada do laboratório e não em um gabinete de classe II Biohazard.
2. Mancha para gotículas lipídicas por adicionar 100 µ l de acabadas 0,2% (p/v) O óleo-vermelho (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes) por 1h à temperatura ambiente.
3. Remover a mancha excesso lavando os géis 4 vezes com 100 µ l de metanol de 78% (v/v), aspiração e descartar o sobrenadante após cada lavagem.
4. Counterstain para 15 min à temperatura ambiente com 100 µ l de Giemsa, diluído 01:10 em água destilada.
5. Aspire a mancha de Giemsa e lave o gel uma vez com água.
6. Para desanexar os geles da placa, a borda dos poços, usando uma agulha 21G, com o bisel voltado para fora, ao redor da borda do gel.
7. Para montar o gel em uma corrediça do microscópio, fazem dois furos (6,35 mm de diâmetro) em uma tira de 2,54 cm x 1,5 cm de fita dupla-face. Fixe a fita para um lado do microscópio padrão e remover a camada protetora da parte superior.
   1. Adicionar uma gota de água para os orifícios na fita usando uma pipeta de transferência. Usando uma pinça, gentilmente transferi géis para os orifícios na fita e cobrir com uma lamela de vidro 1,5 de tamanho. Pressione suavemente a lamela para aderem à fita.
8. Examine com microscopia de campo claro contraste interferência diferencial usando 40 objectivo de X em um microscópio invertido.
   1. Trazer a monocamada HUVEC em foco em 40 X ampliação e rolagem ' em ' o gel, contagem de células de macrófagos/espuma ao longo de toda a profundidade do gel. Repita por três distintas campos de vista localizada a uma distância similar da borda do gel para minimizar possíveis efeitos de borda. Isso garantirá que gel de profundidade é consistente entre as regiões de contagem.
      Nota: Marcar células no gel como células de espuma (definidas como células contendo > 1/3 de seu citoplasma, como O óleo-vermelho manchado gotículas lipídicas) ou macrófagos até 2 horas de montagem em lâminas ( Figura 2). Formação de célula de espuma é expresso como a porcentagem de células de espuma em relação ao número total de células migradas e é expresso como as contagens de mediana em 3 campos de visão examinaram para 6 géis por condição, portanto, uma mediana de 18 medições por condição. Um exemplo da contagem de células cru de um experimento típico é mostrado na tabela 2.
      Nota: Classificando uma célula como um macrófago de vs de célula de espuma por microscopia é subjetivo e, consequentemente, pode ser dependente do investigador. Em estudos clínicos, onde são realizados experimentos durante um período prolongado de tempo, é importante para a contagem de todos ser executada cegado por um único investigador. Exemplos de células de espuma e macrófagos em géis são fornecidos na Figura 2.

7. Análise de células transmigra por citometria de fluxo

1. para fenotipicamente caracterizar células de espuma e após transendothelial migração de macrófagos, digerem os géis adicionando-se 100 µ l de 1 mg/mL de 37 ° C pré-aquecido colagenase D diluído em M199 para cada um bem e incubar durante 20 min a 37 °C/5% CO ₂.
   Nota: Coloque as placas de 96 poços diretamente nas prateleiras de metal limpa na incubadora para garantir a distribuição de calor mesmo.
2. Após a incubação, macerar os géis usando uma ponta de pipeta de 200 µ l e incubar por um adicional de 20 min a 37 °C/5% CO ₂.
3. Uma vez totalmente digerido, filtro e piscina os digerido géis replicar através de 35 µm de nylon malha tampados tubos de FACS colocados no gelo e lave uma vez com FACS lavar (veja a tabela dos materiais) a 4 ° C, 300 g de x. Ressuspender as células em 100 µ l de FACS Wash.
4. Incubar as células resultantes com fluoróforo conjugado anticorpos específicos para CD45, um marcador de célula viva/morta e superfície/intracelular marcadores fenotípicos ou funcionais de interesse usando protocolos de citometria de fluxo padrão.
   Nota: Preparar controle tubos para compensação usando o apropriado fluorophores e contas de compensação do Ig. Extraído de células também podem ser recolhidas em lâminas de vidro para microscopia de imunofluorescência por cytospinning. Alternativamente, nós recolhemos com sucesso células usando esse protocolo para avaliação através de citometria de fluxo de imagem.
5. Adquirir células usando um citômetro de fluxo e realizar a compensação conforme necessário.
   Nota: Como células de espuma/macrófagos não podem formar populações individuais usando as propriedades de dispersão de luz e podem diferir consideravelmente em tamanho e forma, definir scatter frente liberal (FSC) e portões de dispersão (CCD) de lado a fim de capturar todas as células migradas, conforme mostrado no < classe forte = "xfig" > figura 3A.
6. Após aquisição, realizar a análise de dados utilizando o software de citometria de fluxo. Para identificar células migradas, primeiro selecione as células como negativa para o marcador de mortos/viver como mostrado na Figura 3B. Em seguida, executar uma discriminação de célula única, criando um portão apertado ao redor das células mostrado uma trama vs CCD-altura do SSC-área.
7. Selecione CD45 ⁺ células e portão grande população de células migradas presentes em uma trama FSC/SSC como estas são as células de macrófagos/espuma.

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Resultados

Quantificar a transmigração de monócito

Os monócitos são adicionados ao modelo conforme descrito na Figura 1, e seis géis preparam-se para cada condição. Monócitos para 6 géis por doador (ou seja, 5,0 x 10⁴ monócitos por gel gel 6 = 3,0 x 10⁵ monócitos por doador) são resuspended para um volume final de 600 µ l de M199 mídia contendo os ...

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Discussão

O protocolo descrito aqui oferece um método versátil e fisiologicamente relevante para avaliar as caracterizações de monócitos de coortes clínicos humanos, combinando ambos transmigração de monócitos e formação de célula de espuma. Este modelo oferece vantagens sobre métodos alternativos de formação de célula de espuma, pois leva em consideração o efeito da transmigração de monócitos na formação de célula de espuma e permite a medição da transmigração reversa⁶ além da ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)