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摘要

我们描述了一项协议, 以测量单核细胞在人的内皮单分子膜的轮回, 并随后成熟成泡沫电池。这提供了一种通用的方法来评估的动脉粥样硬化性质的人单核细胞分离的不同疾病的情况下, 并评估血液中的因素, 可能会提高这种倾向。

摘要

冠状动脉疾病 (CAD) 是全球发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化是 CAD 的一个主要原因, 它是由先天免疫单核细胞的轮回所引发的, 它被称为脂肪条纹的脂质的炎症部位, 它们存在于中到大动脉的动脉壁上。动脉粥样硬化早期病变的主要致病特征是单核细胞的成熟, 它会迁移到动脉形成泡沫或脂质巨噬细胞。大量的证据支持这样的假说: 动脉粥样硬化的风险是由慢性炎症性疾病, 如类风湿关节炎和 HIV, 以及一般的老化, 以及这种风险是由单核细胞预测激活.尽管鼠标模型提供了一个很好的平台来研究单核细胞在动脉粥样硬化体内的作用, 但它们需要对天然胆固醇代谢进行基因改变和对正常小鼠饮食的剧烈改变, 并且对人类共疾病的动脉粥样硬化影响研究。这促使我们开发了一个人的体外模型, 以测量孤立于定义疾病状态的个体的单核细胞的动脉粥样硬化潜能。目前, 人类的体外模型是限制的, 他们评估单核细胞的轮回和泡沫形成的孤立。在这里, 我们描述了一个协议, 其中单核细胞从病人的血液刺字跨人的内皮细胞膜到1型胶原基质, 他们的倾向成熟成泡沫细胞存在或没有外源性脂质测量。该议定书已得到验证, 用于使用从艾滋病毒感染者和老年艾滋病毒感染者身上纯化的人单核细胞。这个模型是多才多艺的, 并且允许单核细胞的移居和泡沫形成被评估使用显微镜或流式细胞仪并且允许评估动脉粥样硬化因素存在于血清或血浆。

引言

单核细胞轮回是动脉粥样硬化斑块发展的关键一步, 可能导致血栓、中风和心肌梗塞。动脉粥样硬化斑块发育的脂肪条纹, 一般目前在低振荡血流在中到大的动脉, 在那里沉积脂质有助于内皮细胞活化和局部炎症1。单核细胞通过单核趋蛋白 (如 CCL2) 和刺字进入内膜2, 被吸收到脂肪条纹中的内皮。在轮回之后, 单核细胞可能形成动脉粥样硬化的、脂质的巨噬细胞, 称为脂质的摄取、脂质合成、胆固醇外流调节或上述因素的综合作用的结果。单核细胞也可以在循环中积聚脂质, 并有一个泡沫状的表型, 可能是发泡细胞形成的诱因3,4。泡沫细胞是脂肪条纹和早期动脉粥样硬化斑块的决定性特征, 其形成受脂质和炎症介质的影响5。另外, 单核细胞有能力逆转刺字从动脉进入血流6, 从而消除脂质从内膜和行动, 以保持健康的动脉。

确定单核细胞在动脉内皮刺字的倾向, 在内膜内形成泡沫细胞, 或逆转刺字并携带脂质, 是了解细胞活化在增加动脉粥样硬化风险。小鼠模型的 cad, 如动脉粥样硬化是重要的阐明 real-time在体内信息的脂肪条纹/动脉粥样硬化斑块的发展。然而, 这些模型需要基因改变这些动物的自然胆固醇处理能力通常加上剧烈的改变饮食 (如载脂蛋白/西方型饮食模式)7,8, 从而,诱导 non-physiological 积累的循环脂水平, 推动斑块的发展。这些模型可能与慢性炎症性人类疾病的相关性有限, 如 HIV 感染, 而不与增加循环胆固醇或低密度脂蛋白 (LDL) 水平有关。此外, 人与小鼠之间单核细胞生物学的差异, 使得对单核细胞亚群 (如中间单核细胞 (CD14++CD16+)) 的相关性的免疫学问题的测试,9困难.这是重要的, 当研究的机制驱动心血管疾病作为中间单核细胞计数独立预测心血管事件10,11。虽然化验存在顺序测量单核细胞的轮回或泡沫形成的隔离, 没有体外试验已验证, 以量化两方面的早期动脉粥样硬化使用相同的细胞从临床组。Transwell 模型利用一个改进的博伊登两室系统, 其中细胞被加载到顶部室和刺字跨多孔塑料屏障或细胞单层到一个较低的会议厅, 通常包含具有趋化因子12的媒体,13. 虽然广泛用于分析白细胞的轮回, 但这些模型一般不包含一层代表内膜, 导致轮回细胞迁移到溶液中, 不允许测量泡沫细胞相同细胞的形成或反向轮回。相反, 泡沫细胞形成的模型不解释任何 transmigratory 引起的单核细胞的改变或内皮激活的影响, 这是已知的贡献泡沫电池形成14。此外, 这些系统诱导泡沫细胞形成从附着在细胞培养板上的饱和浓度的外源氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)15,16, 一个关键的诱导剂泡沫细胞的形成。这些模型中使用的 LDL 通常被 non-physiologically 相关的过程 (如丘索4治疗17) 所氧化, 因此, 使用这些模型来质疑研究的生理学重要性。

在这里, 我们描述了一个定量分析, 量化单核细胞的轮回和泡沫细胞的形成, 不需要添加外源性 oxLDL, 从而更好地模拟单核在泡沫细胞形成中的作用。这个模型最初是由威廉. 穆勒教授 (西北大学, 芝加哥)18开发的, 并且在我们的实验室中得到了进一步的改进, 以评估ex 体内atherogenicity 下单核细胞在 non-activating 下的分离与患动脉粥样硬化的风险增加相关的疾病, 如 HIV 感染19以及衰老的20的患者的条件。该模型还提供了一个平台, 回答基本的生物学问题的倾向, 不同的单核细胞亚群形成泡沫电池20, 细胞因子, 如 TNF 对泡沫细胞形成的影响, 内皮激活14, 以及在凝胶中轮回的深度和速度等单核细胞的迁移特性19。此外, 单核细胞的轮回和泡沫形成可以量化使用标准显微镜, 活细胞成像, 流式细胞仪和成像流式细胞仪, 因此, 提供了一个多用途的方法来评价单核在动脉粥样硬化的作用。

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研究方案

注意: 所有使用人体生物样本的实验都是在墨尔本的阿尔弗雷德医院人类伦理委员会的伦理批准下进行的。所有实验均在第二类生物安全柜中进行, 除非指定。#34;P rewarmed 和 #34; 指在水中加热到37和 #176 的试剂; C.

1. i 型纤维状胶原凝胶的制备: 1 天

  1. 通过依次添加和混合35.7 毫米氢氧化钠、0.71 x M199、4.58 mm 乙酸和1.71 毫克/毫升 i 型纤维胶原制成5毫升聚苯乙烯制备聚合胶原凝胶管按 表 1 .
    注意: 为了阻止胶原蛋白和 #39;p ockets 和 #39 的形成, 在凝胶混合物中, 确保胶原蛋白混合, 并轻轻移5倍。每测试条件为4-6 凝胶显微镜或15凝胶每测试条件流式细胞仪.
  2. 一次好的混合, 分50和 #181; 胶原凝胶混合物, 每一个不育的 flat-bottomed 96-良好的组织培养板。不要使用外部行和列, 但用200和 #181 填充这些数据; 1x Dubecco 和 #39 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 以保护凝胶免受干燥。在37和 #176 孵育板; C/5%co 2 用于2小时, 以允许胶原蛋白聚合.
    注意: 将板材直接放在孵化箱的清洁金属架上, 以确保均匀的热量分配.
  3. 以下孵育, 用150和 #181 覆盖凝胶; L 1x 补充 M199 (见 材料表 ), 孵育5天直到使用.

2。扩展存储的内皮: 1 天

  1. 标记和涂上10厘米直径的培养皿, 1 毫升50和 #181; 在 1x PBS 中稀释的 g/毫升纤维连接蛋白, 室温下孵育10分钟.
  2. 解冻等分的人脐静脉内皮细胞 (内皮, 1.0 x 10 6 细胞) 在10毫升 M20.
    注: 内皮应按先前描述的 21 编写, 并在低通道数 (和 #60; 段落 4) 中使用。内皮可替换为人冠状动脉内皮细胞.
  3. 重内皮在10毫升 M20, 并添加到纤维连接蛋白涂层碟, 在增加细胞之前, 吸取过多的纤维连接蛋白, 和文化汇合 (约5天), 取代媒体在3天.

3。胶原凝胶培养内皮单层: 5 天

  1. 在5天, 从培养皿中吸取培养基分离内皮, 然后用10毫升无血清 M199 洗去含血清的培养基.
  2. 在 M199 中添加5毫升0.05% 胰蛋白酶/0.53 EDTA, 内皮, 室温下孵育1-2 分钟, 轻轻晃动, 直到细胞分离.
  3. 一旦分离, 用5毫升 M20 快速冲洗培养皿, 并将含有细胞的培养基传送到10毫升管.
  4. 在室温下离心取样 300 x g, 吸气上清, 重细胞在200和 #181; L M20, 用例计数细胞.
  5. 将单元格重为 2.0 x 10 5 M20 中的单元格/mL 从96井板 (步骤 1.3) 中吸取凝胶上的 M199, 并添加100和 #181; 悬浮内皮 (2.0 x 10 4 细胞) 对上述每种胶原凝胶 (步骤 1.2)。文化板材在3天在37和 #176; C/5%co 2 .
    注: 内皮单层的完整性可在3天后经硝酸银染色后确认为 22 或在本阶段对紧密接合蛋白 23 进行免疫组化。必须为此目的准备额外的凝胶.

4。内皮单分子膜的活化和分离/细胞活化: 8 天

  1. 在天 8, 激活每个内皮单层之前, 通过吸取 M20 介质覆盖凝胶和添加100和 #181; L 的 10 ng/毫升人 TNF 和 #945; 在 M20 每凝胶。孵育在37和 #176; C/5%co 2 为 4 h.
    注意: 如果需要, 非激活的内皮条件也可能包含在控件中.
  2. 在 4 h 内皮激活步骤中, 使用磁珠技术将单核细胞从 PBMCs 中分离出来, 按照制造商和 #39 的指示对电池进行负选择。在此步骤中, 至少应使用 6.5 x 10 6 PBMCs, 以便可靠地恢复一个条件所需的 3.0 x 10 5 单核细胞, 因为单核细胞通常占约10-15% 的 PBMCs.
    注意: 为了评估单核细胞在单核轮回和泡沫形成前的作用, 在这个阶段可以激活单核。单核细胞可以从解冻 PBMCs, 如果需要 ( 即 , 储存的病人样本) 隔离。可为除凝胶 ( 图 1 ) 而准备的单核细胞群分类分离。

5。初级人类单核细胞的轮回: 8 天

  1. 测量单核 M199, 清除 TNF 和 #945;-含培养基和洗涤凝胶两次与100和 #181; 通过添加和移除媒体, 我对此表示满意....。在洗涤之后, 增加 2.0 x 10 5 新鲜地被隔绝的或解冻和洗涤的被保存的 PBMCs 或 5.0 x 10 4 新孤立单核细胞或纯化单核细胞亚群到内皮单分子膜在100和 #181; M20孵育1小时, 在37和 #176; C 和 5% CO 2 , 允许单核细胞向凝胶中的前向轮回。最好是让6口井为每一个实验条件检查.
    注: 为了评估自体血清对轮回和泡沫细胞形成的影响, 孵育细胞的 M20 含有所需的热灭活供血的浓度, 并与人类血清控制的条件进行比较。在这个阶段, 除了单核细胞之外, 还可以添加白血球。如果调查特定脂质/脂类 ( 如 、高密度脂蛋白、oxHDL) 的影响, 请执行所有以下步骤, 其中含有20-50 和 #181 的无血清培养基; 克/毫升脂.
  2. 经过1小时的前向轮回, 通过洗涤凝胶两次收集 non-transmigrated 细胞与100和 #181; l prewarmed 1 毫米 EGTA 在 1x PBS, 和一次与100和 #181; M199 (相同的离心条件), 汇集清从每个井实验条件 (通常6口井) 变成1.5 毫升离心管在冰上。离心 non-transmigrated 细胞在4和 #176; C, 300 x g 为 5 min 和重在30和 #181; L 1x PBS.
  3. 计数上清中收集的单元格以确定正向轮回单元格的数量.
  4. 向前轮回单元格的百分比按以下方式确定:
    figure-protocol-3178 figure-protocol-3245 figure-protocol-3312
  5. 覆盖已清洗含有轮回细胞的凝胶100和 #181; L M20 和孵育 48 h.
  6. 48 小时后, 收集上清液和冲洗 non-transmigrated 细胞两次, 100 和 #181; L prewarmed 1 毫米 EGTA/PBS, 收集和汇集的上清从每个条件的步骤 5.2.
    注: 反转轮回细胞的表型可在这些细胞上测试ollowing 标准流式细胞仪染色协议.
  7. 4 和 #176 的离心细胞; 30 和 #181 中的5分钟和重细胞 300 x g; 1x PBS计数细胞, 通过台盼蓝染色确定生存能力.
  8. 使用下列公式确定反向轮回单元格的百分比:
    figure-protocol-3719
    注意: 对正向轮回单元的总数量进行核算, 可以更准确地显示反向轮回, 因为它不太可能向前轮回100%.
  9. 通过显微镜进行分析, 通过增加100和 #181 来固定凝胶, 并将2% 甲醛 (最终浓度) 对每一个井, 盖在铝箔和存储在4和 #176; C 直到分析。对于流式细胞术, 不要在这个阶段修复细胞。见下面的协议显微镜 (6 节) 或流式细胞仪 (第7节) 分析.
    注意: 甲醛有毒, 腐蚀性强;使用个人防护设备 (PPE)。在添加甲醛时应注意, 但是, 由于使用的浓度较低, 此步骤不需要在油烟罩中执行.

6。泡沫细胞和巨噬细胞的显微定量 (油红色 O 染色)

  1. 取出甲醛, 用100和 #181 清洗凝胶; 50% (v/v) 甲醇为5分钟, 然后100和 #181; l 78% (v/v) 甲醇为 15 min.
    注: 染色步骤可在实验室工作台上进行, 而不是在第二类生物危害柜中进行.
  2. 添加100和 #181 的脂液滴染色; 新准备的 0.2% (w/v) 油红色 O (参见 材料表 详细信息), 在室温下为1小时.
  3. 用100和 #181 洗涤凝胶4次, 去除多余的污渍; 78% (v/v) 甲醇, 每次洗涤后, 抽吸和丢弃上清液.
  4. Counterstain 在室温下为15分钟, 100 和 #181; L 姬姆萨, 稀释1:10 的蒸馏水.
  5. 吸姬姆萨渍, 用清水冲洗一次凝胶.
  6. 将凝胶从盘中分离出来, 用21克针将油井边缘化, 斜面朝向外, 围绕凝胶边缘.
  7. 要在显微镜滑轨上安装凝胶, 请在 2.54 cm x 1.5 厘米的双面胶带上打两个孔 (直径 6.35 mm)。将胶带固定在标准显微镜一侧, 从顶部取下防护涂层.
    1. 使用传输吸管向磁带中的孔添加一滴水。使用镊子, 轻轻地转移凝胶到磁带上的孔和盖1.5 大小的玻璃片。轻轻地按片, 将其粘附到磁带上.
  8. 在倒置显微镜下使用40X 目标进行差分干涉对比亮场显微镜检查.
    1. 使内皮单层在40X 放大和滚动 #39; 进入和 #39; 凝胶, 计数巨噬细胞/泡沫细胞在整个凝胶的深度。重复三不同的视野位于类似的距离, 从凝胶边缘, 以尽量减少可能的边缘效果。这将确保凝胶深度在计数区域之间保持一致.
      注: 将凝胶中的细胞作为泡沫细胞 (被定义为含有和 #62 的细胞; 1/3 的细胞质为油红色 O 染色的脂滴) 或2小时内在幻灯片上的安装 ( 图 2 )。泡沫细胞的形成被表达为相对于迁移细胞总数的泡沫细胞的百分比, 并表示为每条件6凝胶的3个视场中的中位数, 因此每个条件的18测量中位数。典型实验中的原始单元格计数的示例如 表 2 所示.
      注: 显微镜下对细胞作为泡沫细胞与巨噬细胞的分类是主观的, 因此可以依赖于研究者。在临床研究中, 实验是在较长时间内进行的, 对所有计数都是很重要的。在 图 2 中提供了凝胶中的泡沫细胞和噬细胞的例子.

7。流式细胞术对轮回细胞的分析

  1. 型 transendothelial 迁移后的泡沫细胞和巨噬细胞的特征, 通过增加100和 #181 来消化凝胶; L 37 和 #176; C prewarmed 1 毫克/毫升胶原酶 D 稀释在 M199每个井和孵化20分钟, 在37和 #176; C/5%co 2 .
    注: 将96井板直接放在孵化箱的清洁金属架上, 以确保均匀的热量分配.
  2. 以下孵育, 使用200和 #181 浸渍凝胶; L 吸管尖和孵育20分钟, 在37和 #176; C/5%co 2 .
  3. 一旦完全消化, 过滤和池的消化复制凝胶通过35和 #181; m 尼龙网格盖在冰上, 并清洗一次与外地资产管制署洗涤 (见 材料表 ) 在4和 #176; C, 300 x g. 重100和 #181 的细胞;洗涤.
  4. 使用标准流式细胞仪协议, 通过特定于 CD45 的荧光共轭抗体、活/死细胞标记和表面/细胞内表型或功能性标记来孵育产生的细胞.
    注: 使用适当的荧光和 Ig 补偿珠准备补偿用管。提取的细胞也可以收集到玻片的免疫荧光显微镜 cytospinning。另外, 我们已经成功地收集了使用该协议的细胞, 通过成像流式细胞仪进行评估.
  5. 使用流式细胞仪获取单元格, 并根据需要执行补偿.
    注: 因为泡沫细胞/巨噬细胞可能不会形成单个群体使用光散射特性, 并可能在大小和形状上有很大差异, 设置自由向前散射 (FSC) 和侧散射 (SSC) 门, 以捕获所有迁移的细胞, 如图所示强类 = "xfig" > 图 3A .
  6. 在获得后, 使用流式细胞仪软件进行数据分析。若要标识迁移的单元格, 请首先选择 "活/死" 标记的单元格为负数, 如 图 3B 所示。接下来, 通过在 ssc 区域与 ssc 高度图上显示的单元格周围创建一个紧密的栅极来执行单细胞判别.
  7. 选择 CD45 + 单元格和门在 FSC/SSC 图中存在的迁移细胞的主要种群, 因为这些是巨噬细胞/泡沫电池.

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结果

量化单核细胞轮回

单核细胞被添加到模型中, 如图 1所述, 每个条件都准备了六凝胶。单核细胞为6凝胶每个施主 (即, 5.0 x 104单核细胞每凝胶6凝胶 = 3.0 x 105单核细胞每个施主) 是悬浮到最后的容量600µL 的 M199 媒体含有所需的血清/分离脂质。细胞 (i. e, 100 µL 每凝胶...

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讨论

这里描述的协议提供了一个多才多艺的和生理学相关的方法来评估的 atherogenicity 单核细胞从人的临床组, 结合单核的轮回和泡沫形成。这种模式提供了比其他泡沫细胞形成的方法的优势, 因为它考虑到单核细胞的轮回对泡沫形成的影响, 并允许测量反向轮回6除了固有的在外源性因素存在或缺乏的情况下, 单核细胞倾向于成熟成泡沫。此外, 内皮活化的作用也被考虑到, 因为我们已?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者衷心感谢 Prof. 和 Dr. 克莱尔 Westhorpe 的工作, 因为他们在开发早期的迭代模型中扮演了关键的角色。作者还要感谢 AMREP 流式细胞仪核心的分单核分子子集和阿尔弗雷德医院传染病组的临床研究护士招募艾滋病毒 + 个人的一些研究。作者衷心感谢伯内特研究所收到的维多利亚运营基础设施支持计划的这项工作的贡献。TAA 得到 RMIT 大学校长博士后奖学金的支持。这项工作得到了澳洲项目补助金1108792授予 AJ 和 AH。传统知识得到 nih 资助 nih K08AI08272、nih/NCATS 补助金 UL1TR000124。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Gel preparation reagents
NaOHSigma-Aldrich221465-500G0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100ML20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen IR&D Systems3442-050-01Type I Fibrous Collagen
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
M199Life Technologies11150-059M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVECPrimary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cellsPrimary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTABDH Merck10093.5VEthylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTASigma-AldrichE3889-500GEthylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTAGibco25300-0540.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamineGibco25030-081L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin Gibco15140-122Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serumGibco16010-142New born calf serum: New Zealand origin
FibronectinSigma-AldrichF1056-1MGFibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)Gibco14200-075Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNFGibcoPHC3015Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoproteinMerck MilliporeLP2-2MGLow-density lipoprotein (LDL)
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy
1 or 2% formaldehydePolysciences40181 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanolAjax Finechem318-2.5L GL50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stainSigma-AldrichO0625-25GDilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slidesMikro-GlassS41104AMKTwin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slipsMenzel-GläserMENCS224015GP22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape3M Scotch4011Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stainMerck Millipore1.09204.0500Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punchHand-held single hole punch (6.35 mm punch)
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry
Collagenase DRoche Diagnostics11088858001Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubesBD Biosciences35223535 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stainLife TechnologiesL34959Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS washPrepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasticware
96 well plateNunclon167008Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri DishTPP93100Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubesEppendorf0030 125.150Eppendorf tubes
Transfer pipetteSamco Scientific222-20SSterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

参考文献

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