Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung der Seelenwanderung von Monozyten in menschlichen Endothelzellen Monolagen und ihre anschließende Reifung in Schaumzellen. Dies stellt eine vielseitige Methode, die atherogenen Eigenschaften von Monozyten aus Menschen mit unterschiedlichen Erkrankungen isoliert zu beurteilen und Faktoren im Blut zu bewerten, die diese Neigung erhöhen können.

Zusammenfassung

Koronare Herzkrankheit (KHK) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Arteriosklerose, eine führende Ursache für CAD, ist initiiert von der Seelenwanderung des angeborenen Immunsystems Monozyten zu entzündlichen Websites hinterlegten Lipid namens fetthaltige Streifen, die in Arterienwände des Mediums zu großen Arterien vorhanden sind. Die pathogenen Läsionen in diesem frühen Stadium der Arteriosklerose zeichnet sich die Reifung von Monozyten, die in Arterien zu Schaumzellen oder Lipid-beladene Makrophagen zu migrieren. Beträchtlichen Beweis stützt die Hypothese, das Risiko von Arteriosklerose wird durch chronische Entzündungszustände Begleiterkrankungen wie rheumatoide Arthritis und HIV sowie allgemeine Alterung erhöht, und das dieses Risiko wird durch Monocyte vorhergesagt Aktivierung. Während Maus-Modelle eine gute Plattform bieten, um die Rolle von Monozyten in Atherogenese in Vivozu untersuchen, sie erfordern genetische Veränderung der natürlichen Cholesterin-Stoffwechsel und drastische Veränderung der normalen Maus Diäten, und haben nur begrenzte Eignung für die Studie der atherogenen Einflüsse der menschlichen Comorbid Krankheiten. Dies hat uns motiviert, ein menschlichen in-vitro- Modell zur Messung der atherogenen Potenzials von Monozyten von Individuen mit bestimmten Krankheitszuständen isoliert zu entwickeln. Derzeit sind menschlichen in-vitro- Modelle begrenzt, insofern sie Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung isoliert zu bewerten. Hier beschreiben wir ein Protokoll in der Monozyten aus Patientenblut isolierte transmigrate in menschlichen Endothelzellen in einem Typ-1-Kollagen-Matrix und ihre Neigung zu Schaumzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen Lipid heranreifen wird gemessen. Das Protokoll wurde für die Verwendung von menschlichen Monozyten von Personen mit HIV-Infektion und älteren Menschen, die HIV-nicht infizierten gereinigt validiert. Dieses Modell ist vielseitig und ermöglicht Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewertenden Verwendung entweder Mikroskopie oder Durchflusszytometrie sowie ermöglicht die Beurteilung der atherogenen Faktoren im Serum oder Plasma zu präsentieren.

Einleitung

Monocyte Seelenwanderung ist ein entscheidender Schritt in der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, die zu Thrombosen, Schlaganfall und Herzinfarkt führen kann. Arteriosklerotische Plaques entwickeln sich aus fetthaltige Streifen, in der Regel an den Standorten des geringen oszillierenden Blutflusses in Medium zu großen Arterien, wo hinterlegten Lipid trägt zur endotheliale Aktivierung und lokalisierte Entzündung¹vorhanden. Monozyten rekrutiert, Endothelzellen in fetthaltige Streifen über Monocyte chemotaktische Proteine (z. B. CCL2) und transmigrate in der Intima-². Im Anschluss an Seelenwanderung können Monozyten bilden atherogenen, Lipid-beladene Makrophagen Schaumzellen infolge Lipid-Aufnahme, Lipid-Synthese, Down-Regulierung des Cholesterins Ausfluss oder eine Kombination aus den oben genannten Faktoren genannt. Monozyten können auch Lipide in der Zirkulation zu sammeln und haben einen "schaumigen" Phänotyp, eventuell prädisponierende Zellen für Schaum Zelle Bildung^3,4. Schaumzellen sind das bestimmende Merkmal der fetthaltige Streifen und frühe arteriosklerotische Plaques und ihrer Entstehung wird von Lipid und Entzündungsmediatoren⁵beeinflusst. Monozyten haben alternativ die Möglichkeit, umzukehren transmigrate von der Arterie in die Blutbahn⁶, wodurch Lipid aus der Intima und Handeln zur Erhaltung der Gesundheit der Arterie entfernt.

Bestimmung der Neigung von Monozyten, transmigrate über arteriellen Endothel und Form Schaumzellen in der Intima oder umgekehrt transmigrate und Lipid aus die Plakette zu tragen, ist eine wesentliche Voraussetzung für das Verständnis der Rolle der Monocyte-Aktivierung bei der Erhöhung arteriosklerotische Risiko. Maus-Modellen der CADs wie Atherosklerose sind in Aufklärung Informationen in Echtzeit in Vivo auf fetthaltige Streifen/atherosklerotischen Plaque Entwicklung wichtig. Diese Modelle erfordern jedoch eine genetische Veränderung der natürlichen Verarbeitung Fähigkeiten dieser Tiere in der Regel verbunden mit drastischen Veränderungen in der Ernährung (z. B. das ApoE/Western-Typ-Diät Modell)^7,8, wodurch Cholesterin, Induktion unphysiologischen Anhäufung von zirkulierenden Lipid Ebenen der Antriebsentwicklung Plaque. Diese Modelle können Relevanz für chronische entzündliche menschlichen Erkrankungen wie HIV-Infektion begrenzt haben, die nicht zugeordnet sind erhöhte zirkulierende Cholesterin oder Low density Lipoprotein (LDL) Ebenen. Darüber hinaus Monocyte Biologie Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen, die Prüfung der immunologische Fragen bezüglich der Relevanz der Subpopulationen von Monozyten (z. B. Mittelstufe Monozyten (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ schwierig. Dies ist wichtig, bei der Untersuchung der Mechanismen, die Herz-Kreislauf-Krankheit zu fahren, wie fortgeschrittene Monocyte zählt unabhängig kardiovaskuläre Ereignisse^10,11Vorhersagen. Während Tests existieren, um entweder Monocyte Seelenwanderung oder Schaum Zellbildung isoliert nacheinander zu messen, ist kein in-vitro- Test zur Quantifizierung der beide Aspekte der frühen Atherogenese verwenden die gleichen Zellen aus klinischer Kohorten validiert worden. Transwell Modelle verwenden ein modifizierte Boyden Zweikammer-System, wobei Zellen werden in die obere Kammer geladen und über eine poröse Kunststoff Barriere oder Cell Monolayer in eine untere Kammer, die in der Regel Medien mit Lockstoffgradient^{12 enthält} transmigrate ^{, 13}. während am meisten benutzt für die Analyse von Leukozyten Seelenwanderung, diese Modelle nicht in der Regel einen Layer für die Intima, was zu transmigrated Zellen migrieren in Lösung integrieren und lassen sich nicht für die Messung von Schaum Zelle Bildung oder umgekehrte Seelenwanderung die gleichen Zellen. Modelle von Schaumbildung Zelle machen sich dagegen nicht transmigratory-induzierte Änderungen Monozyten oder Auswirkungen der endotheliale Aktivierung, die dazu beitragen, Schaum-Zelle Bildung¹⁴bekannt ist. Darüber hinaus verursachen diese Systeme Schaum Zellbildung von Makrophagen eingehalten Zellplatten Kultur durch die Zugabe von Sättigung Konzentrationen von exogenen oxidierten Low density Lipoprotein (OxLDL)^15,16, eine wesentliche Induktor von Zelle Schaumbildung. LDL in diesen Modellen verwendeten ist daher oft durch nicht physiologisch relevanten Prozesse wie CuSO₄ Behandlung¹⁷, oxidiert die physiologische Bedeutung der Studien mit diesen Modellen in Frage zu stellen.

Hier beschreiben wir eine Probe, die quantifiziert Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung der gleichen Zellen erfordern nicht die Zugabe von exogenen OxLDL, somit besser modellieren die Rolle von Monozyten in Zelle Schaumbildung. Dieses Modell wurde ursprünglich von Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸entwickelt und weiterentwickelt in unserem Labor ex Vivo Atherogenicity von Monozyten isoliert unter nicht-Aktivierung bewerten Bedingungen von Einzelpersonen mit zugrunde liegenden entzündlichen Erkrankungen Begleiterkrankungen wie z. B. HIV-Infektion¹⁹ sowie Alterung²⁰, sind, die mit einem erhöhten Risiko für Arteriosklerose in Verbindung gebracht. Dieses Modell bietet auch eine Plattform für die Beantwortung der grundlegenden biologischen Fragen die Neigung der verschiedenen Monocyte Teilmengen Form Schaum Zellen²⁰, den Einfluss der endotheliale Aktivierung von Zytokinen wie TNF auf Zelle Schaumbildung¹⁴ , und die wandernden Eigenschaften von Monozyten wie die Tiefe und Geschwindigkeit der Seelenwanderung in Gele¹⁹. Darüber hinaus Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung mit standard-Mikroskopie quantifiziert werden kann, live Cell Imaging, flow Cytometry und Bildgebung Durchflusszytometrie, daher bietet eine vielseitige Methode zur Bewertung der Rolle von Monozyten in Atherogenese.

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Protokoll

Hinweis: alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik von Alfred Hospital Komitee der menschlichen Ethik, Melbourne durchgeführt. Alle Versuche wurden in Klasse II Biosicherheit Schränken durchgeführt, sofern nicht angegeben. " Prewarmed " bezieht sich auf Reagenzien auf 37 ° C in einem Wasserbad erwärmt.

1. Vorbereitung der Typ I faserigem Kollagen Gele: Tag1

1. Prepare polymerisiert Kollagen Gele nacheinander hinzufügen und Mischen von 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM Essigsäure und 1,71 mg/mL Typ I Kollagen faserige in 5 mL Polystyrol Rohr gemäß Tabelle 1.
   Hinweis: Sicherstellen, dass das Kollagen gut durchmischten indem sanft nach oben und unten 5 Mal um die Bildung von Kollagen stoppen Pipettieren ' Taschen ' in der Gel-Mischung. Bereiten Sie 4-6 Gele pro Testbedingung für die Mikroskopie oder 15 Gele pro Testbedingung für Durchflusszytometrie.
2. Nun einmal gemischt, aliquoten 50 µL Kollagen Gel Mischung in jede Vertiefung einer sterilen Plattboden 96-Well-Zellkultur-Platte. Verwenden Sie nicht die äußeren Zeilen und Spalten, sondern füllen Sie diese mit 200 µL 1 X Dubecco ' s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die Gele vor Austrocknung zu schützen. Inkubieren Platten bei 37 °C/5% CO ₂ für 2 h, um das Kollagen zu polymerisieren lassen.
   Hinweis: Legen Sie die Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.
3. Nach Inkubation, überlagern die Gele mit 150 µL 1 x ergänzt M199 (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 5 Tage bis zum ersten Gebrauch.

2. Erweiterung des gespeicherten HUVECS: Tag1

1. Label und Mantel einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit 1 mL von 50 µg/mL Fibronektin in 1 X PBS verdünnt und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
2. Tauwetter Aliquote von kryokonservierten primären menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS, 1.0 x 10 ⁶-Zellen) in 10 mL M20.
   Hinweis: HUVECS sollten bereit sein, wie zuvor ^{21 beschrieben} und bei einem niedrigen Passagenanzahl verwendet (< Abschnitt 4). HUVECS mit menschlichen koronaren Endothelzellen hier ersetzt werden kann.
3. HUVECS in 10 mL M20 Aufschwemmen und Fibronektin beschichtete Teller, Absaugen von überschüssigem Fibronektin vor der Zugabe von Zellen und Kultur zum Zusammenfluss (ca. 5 Tage), Austauschen der Medien am 3. Tag hinzu.

3. Kultivierung von HUVECS Monolayer auf Kollagen Gele: Tag 5

1. am 5. Tag, HUVECS lösen, indem Kultur aus der Petrischale überstand Absaugen und Waschen entfernt Serum-haltigen Medien mit 10 mL serumfreien M199.
2. HUVECS 5 mL 0,05 % Trypsin/0,53 EDTA in M199 hinzu und inkubieren Sie für 1-2 min bei Raumtemperatur, sanft schütteln, bis die Zellen trennen.
3. Einmal gelöst, schnell spülen Petrischale mit 5 mL M20 und übertragen das Medium mit Zellen, die eine 10 mL-Tube.
4. Zentrifuge Proben bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur, Aspirieren überstand, Aufschwemmen Zellen in 200 µL der M20 und zählen von Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
5. Aufschwemmen der Zellen bis 2.0 x 10 ⁵ Zellen/mL in M20, Aspirieren M199 auf die Gele aus der 96-Well-Platte (Schritt 1.3) und jedes Kollagen Gel oben (Schritt 1.2) vorbereitet 100 µL resuspendierte HUVECS (2.0 x 10 ⁴ Zellen) hinzuzufügen. Kultur von Platten für weitere 3 Tage bei 37 °C/5% CO ₂.
   Hinweis: Die Integrität des HUVECS Monolage kann nach 3 Tagen durch Silbernitrat Färbung ²² oder Immunohistochemistry für enge Kreuzung Proteine ²³ zu diesem Zeitpunkt bestätigt werden. Weitere Gele müssen dazu bereit sein.

4. Aktivierung des HUVECS Monolage und Isolation/Aktivierung von Monozyten für Seelenwanderung: Tag 8

1. am 8. Tag, jeder HUVECS monomolekularen Film vor der Zugabe von Monozyten durch Absaugen der M20 aktivieren Medien überlagern die Gele und das Hinzufügen von 100 µL 10 ng/mL menschlichen TNF in M20 pro Gel. Inkubation bei 37 °C/5% CO ₂ für 4 Std.
   Hinweis: Nicht aktivierte HUVECS Bedingungen auch möglicherweise enthalten ggf. als Steuerelemente.
2. Während die 4 h HUVECS Aktivierungsschritt, isolieren Monozyten von PBMCs mit magnetischer Wulst Techniken negativ für Zellen des Herstellers wählen ' Anweisungen. Mindestens 6,5 x 10 ⁶ PBMCs sollte bei diesem Schritt genutzt werden, um zuverlässig wiederherstellen 3.0 x 10 ⁵ Monozyten erforderlich für eine Bedingung, da in der Regel ca. 10-15 % der PBMCs Monozyten ausmachen.
   Hinweis: Um die Wirkung der Monocyte Aktivierung vor Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, können Monozyten in dieser Phase aktiviert werden. Monozyten können von aufgetauten PBMCs bei Bedarf (d.h. gespeicherte Patientenproben) isoliert werden. Monocyte Teilmengen durch FACS Sortierung isoliert zubereitet werden, für die Addition, Gele (Abbildung 1).

5. Transmigration von primären menschlichen Monozyten: Tag 8

1. zur Messung Monocyte Seelenwanderung, TNF-haltigen Medien zu entfernen und waschen Gele zweimal mit 100 µL M199 durch hinzufügen und Entfernen von Medien. Nach waschen, hinzufügen 2.0 x 10 ⁵ frisch isoliert oder aufgetaut und gewaschen kryokonserviert PBMCs oder 5,0 x 10 ⁴ frisch isolierte Monozyten oder gereinigt Monocyte Teilmengen zu HUVECS Monolagen in 100 µL M20. Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO ₂ vorwärts Transmigration von Monozyten in das Gel zu ermöglichen. Es empfiehlt sich, 6 Brunnen für jeden Versuchsbedingung untersucht lassen.
   Hinweis: Um die Wirkung von autologem Serum auf Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, inkubieren Sie Zellen mit M20, enthalten die gewünschte Konzentration von Hitze-inaktivierten Spender Serum und vergleichen mit Bedingungen mit einer gepoolten Humanserum-Kontrolle. Leukozyten als Monozyten können in diesem Stadium hinzugefügt werden. Wenn bestimmte Lipide/Lipid-Arten (z.B., HDL, OxHDL) zu untersuchen, führen Sie alle folgenden Schritte mit serumfreien Medium mit 20-50 µg/mL Lipide.
2. Nach 1 h nach vorne Seelenwanderung, sammeln die nicht transmigrated Zellen durch Waschen Gele zweimal mit 100 µL vorgewärmte 1 mM EGTA mit 1 X PBS-Puffer, und einmal mit 100 µL M199 (gleiche Zentrifugieren Bedingungen), Bündelung der Überstände aus jedem Brunnen desselben Versuchsbedingung (in der Regel 6 Brunnen) zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis. Die nicht transmigrated Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und in 30 µL 1 X PBS Aufschwemmen.
3. Zählen der Zellen in der Überstand zu bestimmen, die Anzahl der nach vorne transmigrated Zellen gesammelt.
4. Der Anteil der vorderen transmigrated Zellen wird wie folgt ermittelt:
   
5. decken die gewaschenen Gele mit transmigrated Zellen mit 100 µL M20 und inkubieren Sie für eine weitere 48 h
6. Nach 48 h, sammeln des Überstands und waschen nicht transmigrated Zellen zweimal mit 100 µL 1 mM EGTA/PBS, Sammlung und Bündelung des Überstands von jedem Zustand wie im Schritt 5.2 vorgewärmt.
   Hinweis: Der Phänotyp der umgekehrte transmigrated Zellen kann auf diese Zellen f getestet werdenAch standard Durchflusszytometrie Fleckenbildung Protokolle.
7. Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen mit 30 µL 1 X PBS-Puffer. Zählen Sie Zellen und bestimmen die Lebensfähigkeit über Trypan blau Färbung.
8. Den Anteil der umgekehrte transmigrated Zellen mithilfe von der folgenden Gleichung ermitteln:
   
   Hinweis: Rechnungswesen für die Gesamtzahl der vorderen transmigrated Zellen eine genauere Angabe der umgekehrte Seelenwanderung gibt, wie es ist unwahrscheinlich, dass vorwärts Seelenwanderung werden 100 %.
9. Für die Analyse von Mikroskopie, beheben die Gele durch Zugabe von 100 µL 2 % Formaldehyd (Endkonzentration) in jede Vertiefung decken die Platten in Aluminium Folie und bis zur Analyse bei 4 ° C lagern. Beheben Sie für Durchflusszytometrie die Zellen nicht in diesem Stadium. Die Protokolle unter für die Mikroskopie (siehe Abschnitt 6) oder Flow-Zytometrie (Abschnitt 7)-Analyse zu sehen.
   Achtung: Formaldehyd ist giftig und ätzend; persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu verwenden. Vorsicht beim Hinzufügen von Formaldehyd, aber dieser Schritt muss nicht durchgeführt werden, unter einem Abzug aufgrund der geringen Konzentration verwendet.

6. Quantifizierung des Schaum-Zellen und Makrophagen durch Mikroskopie (Öl-rot färben O)

1. das Formaldehyd zu entfernen und waschen Sie die Gele mit 100 µL von 50 % (V/V) Methanol für 5 min und dann 100 µL 78 % (V/V) Methanol für 15 min.
   Hinweis: Die Färbung Schritte können durchgeführt werden, auf dem Labortisch und nicht in einem Klasse-II-Biohazard-Schrank.
2. Fleck für Lipid Tröpfchen durch Hinzufügen von 100 µL der frisch zubereiteten 0,2 % (w/V) Öl-rot O (siehe Tabelle der Materialien für Details) für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie überschüssige Flecken durch Waschen die Gele 4 Mal mit 100 µL 78 % (V/V) Methanol, Absaugen und Abwerfen des Überstands nach jeder Wash.
4. Für 15 min bei Raumtemperatur mit 100 µL Giemsa, 01:10 in destilliertem Wasser verdünnt Gegenfärbung.
5. Aspirieren Giemsa Fleck und Gele einmal mit Wasser zu waschen.
6. Um die Gele aus der Platte zu entfernen, die Brunnen mit einer Nadel 21 G mit der Schräge nach außen, um den Rand des Gels Felge.
7. , Die Gele auf einen Objektträger zu montieren Schlag zwei Löcher (Durchmesser von 6,35 mm) in einem 2,54 cm x 1,5 cm Streifen doppelseitiges Klebeband. Das Band zu einem standard Mikroskop-Seite befestigen und Entfernen der Schutzschicht von oben.
   1. Add einen Tropfen Wasser auf die Löcher in das Band mit einer Transferpipette. Übertragen Sie Gele mit einer Pinzette, sanft auf die Löcher in der Band und mit einem Deckgläschen Größe 1,5 Glas werden. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas auf dem Band einzuhalten.
8. Untersuchen mit differential Interferenz Kontrast Hellfeld Mikroskopie mit 40 X Objektiv auf einem inversen Mikroskop.
   1. Bringen die HUVECS Monolayer in den Fokus bei 40 X Vergrößerung und scrollen Sie nach ' in ' Gel, Makrophagen/Schaumzellen in die gesamte Tiefe des Gels zu zählen. Wiederholen Sie für drei unterschiedliche Sichtfelder befindet sich in einer ähnlichen Entfernung vom Rand des Gels um mögliche Randeffekte zu minimieren. Dadurch wird sichergestellt, dass Gel Tiefe ist konsistent zwischen Regionen zählen.
      Hinweis: Gäste Zellen in das Gel entweder als Schaumzellen (definiert als Zellen mit > 1/3 von ihrem Zytoplasma als Öl-rot O gebeizt Lipid-Tropfen) oder Makrophagen innerhalb 2 h nach Montage auf Folien ( Abbildung 2). Zelle Schaumbildung wird ausgedrückt als Prozentsatz der Schaumzellen bezogen auf die Gesamtzahl der migrierten Zellen und wird ausgedrückt als die mediane Grafen in 3 Gesichtsfelder für 6 Gele pro Zustand, daher einen Median von 18 Messungen pro Zustand untersucht. Ein Beispiel für rohe Zellenzahlen von ein typisches Experiment ist in Tabelle 2 gezeigt.
      Hinweis: Eine Zelle als ein Schaum Zelle Vs Makrophagen durch Mikroskopie zu klassifizieren ist subjektiv und kann folglich sein Ermittler-abhängige. In klinischen Studien, wo Experimente über einen längeren Zeitraum hinweg durchgeführt werden, ist es wichtig für alle zählen, geblendet durch eine einzelne Prüfer durchgeführt werden. Schaumzellen und Makrophagen in Gele sind Beispiele in Abbildung 2.

7. Analyse der Transmigrated Zellen durch Flow Cytometry

1. phänotypisch Schaumzellen und Makrophagen, die nach der Transendothelial Migration zu charakterisieren, die Gele durch Zugabe von 100 µL 37 ° C vorgewärmt 1 mg/mL Kollagenase D verdünnt in M199 zu verdauen jedes gut und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C/5% CO ₂.
   Hinweis: Legen Sie die 96-Well-Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.
2. Nach Inkubation, die Gele mit einer Pipettenspitze 200 µL mazeriert und inkubieren Sie für weitere 20 min bei 37 °C/5% CO ₂.
3. Einmal vollständig verdaut, Filter und Pool die verdaute replizieren Gele durch 35 µm Nylon mesh angeschnittene Ärmel FACS-Röhren auf Eis gelegt und waschen mit FACS einmal waschen (siehe Tabelle der Materialien), bei 4 ° C, 300 X g. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL FACS Washington
4. Die resultierenden Zellen mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern inkubieren CD45, einen lebenden/Toten Zelle Marker und Oberfläche/intrazellulären phänotypische oder funktionelle Marker mit standard Flow Cytometry Protokolle.
   Hinweis: Bereiten Sie Kontrolle Rohre für Entschädigung unter Verwendung der entsprechenden Fluorophore und Ig Entschädigung Perlen. Entnommene Zellen können auch auf Glas-Objektträger für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Cytospinning gesammelt werden. Alternativ haben wir erfolgreich gesammelt Zellen unter Verwendung dieses Protokolls zur Beurteilung über bildgebende Durchflusszytometrie.
5. Zellen mit einem Durchflusszytometer zu erwerben, und führen Sie Entschädigung Bedarf.
   Hinweis: Da Schaum Zellen/Makrophagen nicht einzelne Populationen mit Lichtstreuung Eigenschaften bilden und sehr unterschiedlich in Größe und Form können kann, setzen liberale forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Tore um alle migrierten Zellen zu erfassen, wie in gezeigt < starke Klasse = "Xfig" > Abbildung 3A.
6. Nach Übernahme, die Datenanalyse mit Flow Cytometry Software durchführen. Um migrierten Zellen zu identifizieren, markieren Sie zuerst Zellen als negativ für die lebenden/Toten-Marker, wie in Abbildung 3 b gezeigt. Führen Sie dann eine einzelne Zelle Diskriminierung durch die Schaffung einer engen Tor um die Zellen auf einem SSC-Bereich Vs SSC-Höhe Grundstück gezeigt.
7. Wählen Sie CD45 ⁺ Zellen und Tor die großen Bevölkerung von migrierten Zellen in einem FSC/SSC-Grundstück sind die Makrophagen/Schaumzellen.

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Ergebnisse

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung

Monozyten werden hinzugefügt, um das Modell wie in Abbildung 1beschrieben, und sechs Gele sind bereit für jede Bedingung. Monozyten für 6 Gele pro Spender (d.h., 5.0 x 10⁴ Monozyten pro Gel 6 Gele = 3,0 x 10⁵ Monozyten pro Spender) sind zu einem Endvolumen von 600 µL M199 Medien enthält die erforderlich...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine vielseitige und physiologisch relevante Methode für die Bewertung der Atherogenicity von Monozyten aus menschlichen klinischen Kohorten durch die Kombination von Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung. Dieses Modell bietet Vorteile gegenüber alternativen Methoden der Zelle Schaumbildung wie es die Wirkung der Monocyte Seelenwanderung auf Zelle Schaumbildung berücksichtigt und die Messung von reverse Seelenwanderung⁶ neben der inhärenten erm...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)