Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Resumo

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Resumo

Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros. Para análise de polissacarídeo por eletroforese em gel (PACE), material de parede celular vegetal é hidrolisado com glycosyl hidrolases específicas para o polissacarídeo de interesse (por exemplo, mannanases de Medeiros). Géis de poliacrilamida de grande formato são usados para separar lançados oligossacarídeos, que tem sido rotulados fluorescente. Géis podem ser visualizados com um gel modificado sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais). Digitais de oligossacarídeo resultante também podem ser comparadas qualitativamente ou, com replicação, quantitativamente. Enlace e ramificação de informações podem ser estabelecidas usando hidrolases glycosyl adicionais (por exemplo, mannosidases e galactosidases). Enquanto este protocolo descreve um método para analisar a estrutura de glucomannan, pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem glycosyl caracterizadas hidrolases. Alternativamente, pode ser usada para caracterizar o romance glycosyl hidrolases utilizando substratos de polissacarídeo definidos.

Introdução

Polissacarídeo análise por eletroforese em gel (PACE) é um método para a caracterização detalhada dos polissacarídeos^1,2,3. Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros.

Estrutura de polissacarídeos da parede celular de plantas compreensão é necessária que os pesquisadores explorando a biossíntese da parede celular de planta ou o papel de parede da célula vegetal no desenvolvimento da planta. Recentemente, no entanto, composição de parede celular planta tornou-se interessante para um grupo maior de pesquisadores devido o foco sobre o uso de biomassa vegetal (essencialmente a parede celular) como uma matéria-prima para produzir biocombustíveis e bioquímicos⁴. Como exemplo, sacarificação enzimática eficiente deste material requer um entendimento detalhado das estruturas polissacarídeo, para que otimizado coquetéis enzimáticos podem ser selecionados⁵.

RITMO tem várias vantagens sobre métodos alternativos que o tornam ideal para a análise rápida de estruturas complexas glicano. Em primeiro lugar, não requer purificação do polissacarídeo em questão, como é necessário para a solução de ressonância magnética nuclear (NMR) estado⁶. Em segundo lugar, o ritmo pode resolver isómeros estruturais, ao contrário de espectrometria de massa (MS, por exemplo, assistida por matriz laser dessorção/ionização (MALDI) e ionização electrospray (ESI)), que também pode ser um desafio para executar por cromatografia líquida (LC) ⁷. em terceiro lugar, o ritmo é muito sensível, com resolução baixa-picomole, ao contrário da cromatografia de camada fina (TLC) ou a cromatografia em papel. Finalmente, não exige conhecimento caro de equipamento ou especialista, como é o caso de MS, NMR e LC.

O método de ritmo depende da especificidade da glycosyl hydrolase (GH) enzimas, que têm como alvo certas ligações glicosídicas em uma mistura de polissacarídeos. Quando a enzima GH atua na cadeia de polissacarídeo, revela um redução final que pode então ser quimicamente derivatizado, neste caso com uma etiqueta fluorescente. A mesmo porção da amostra é processada portanto indetectável por esse método. Oligossacarídeos etiquetados são então separados em um gel do acrilamido do grande-formato por eletroforese. Isso dá excelente resolução de moléculas muito semelhantes, por exemplo, os trissacarídeos Glc-homem-homem e homem-Glc-Glc terá um diferente R_f.

RITMO tem sido amplamente utilizado para caracterizar estruturas de xilana diferentes em toda a espécie de planta⁸, para identificar os mutantes glycosyltransferase em Arabidopsis^6,9,10,11 , para realizar ensaios de glycosyltransferase⁹e para caracterizar o romance GH atividades^12,13. Recentemente, também usamos isso para caracterizar Medeiros de parede celular de levedura (Mahboubi e Mortimer, em preparação). Aqui nós descrevemos um método para caracterizar a estrutura de glucomannan da parede celular vegetal, com base em anteriores relatórios^11,14.

Protocolo

1. colheita de Material vegetal

1. colher material de planta fresco (~ 20 mg) e, imediatamente, submirja em etanol a 96% (v/v) e incubar a 70 ° C por 30 min; isto desativa qualquer parede celular presentes enzimas degradantes. Para material seco, comece pela etapa 2.
   Cuidado: O álcool etílico é inflamável.
   Nota: Uma única folha de haste ou Roseta irá fornecer material suficiente para análise. No entanto, menos erros surgirem se uma maior quantidade de tecido é agrupada e analisada desde que isto é mais fácil para pesar e lidar com.
2. Registrar cuidadosamente o tipo de tecido e grau de desenvolvimento, como estrutura de polissacarídeo varia com os dois. Por exemplo, com Arabidopsis thaliana (usado aqui), fase o tecido de acordo com os métodos de Boyes et al ¹⁵
   Nota: Este protocolo, usamos a metade inferior da haste da inflorescência, onde a primeira síliqua é totalmente alongada mas não amarelamento.

2. preparação de álcool insolúvel resíduo (ar)

1. preparar ar, seguindo o método de Mortimer et al ⁹ ou outro método semelhante, a fim de produzir um pó falta de açúcares solúveis, como sacarose e amido.

3. Alíquotas e pré-tratamento de ar

Nota: A quantidade exata de ar necessária para cada amostra dependerá do (a) a abundância do polissacarídeo de interesse no material e (b) o tamanho médio dos oligossacarídeos, lançado pela o GH. O método adiciona uma molécula fluorescente ao final de cada oligossacarídeo, reduzindo assim o número de oligossacarídeos determina a sensibilidade do experimento. Como uma diretriz, para glucomannan no tronco de Arabidopsis digerido com GH5/GH26 (como descrito), 500 µ g é recomendado ¹¹, Considerando que para xilana em tronco de Arabidopsis digerido com GH11, recomenda-se 100 µ g como em Mortimer ' estudo s ³.

1. pesa ar (10-15 mg) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar H ₂ O a uma concentração final de 2 mg/mL. Vórtice para conseguir uma suspensão mesmo. Se isto é problemático, usar um homogeneizador de vidro para ajudar neste processo.
Tubos
2. alíquota 500 µ g em microcentrífuga. Alíquotas utilizando uma centrífuga a vácuo a seco (veja a Tabela de materiais) durante a noite em 30 ° C.
3. Pré-tratamento de ar com 1 M de NaOH (20 µ l) por 1h à temperatura ambiente; isto de acetylates os polissacarídeos e incha as microfibrilhas de celulose, rompendo a estrutura de biomassa e permitindo o acesso de GH.
   Nota: Este passo pode ser ignorado para polissacarídeos purificados. Cuidado – ácido/base forte.
   1. Incluem uma alíquota para um controle de ar não-enzimática (tratados da mesma forma como todas as amostras, exceto passo 4.1. é excluído).
4. Adicionar 200 µ l de H ₂ O e 20 µ l 1m HCl para neutralizar. Teste que o pH é ~ 6-7, removendo 1 µ l e mancha-lo em tiras de papel indicador de pH.
5. De amónio de 1m adicionar 50 µ l de tampão de acetato, pH 6.0 (ou qualquer que seja o pH é apropriado para o GHs utilizado no estudo) e H ₂ O para dar um volume total de 500 µ l.
   Nota: Acetato de amônio é usado desde que sublima-se após a secagem, e então não adiciona sal adicional à amostra. Um excesso de sal pode levar a banda-forma pobre e resolução sobre o gel ritmo.

4. Hidrólise do ar com Glycosyl Hydrolases (GHs)

Nota: como mencionado na discussão, a pureza do GHs é crítica. Use somente heterologously expressado, afinidade purificado de enzimas. Após o recebimento de cada lote do fabricante, hidrolisar alíquotas definidas de substrato (por exemplo, 500 µ g ar) com o aumento da quantidade de GH durante a noite (por exemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unidades / µ l). Quando há um excesso de GH, a impressão digital ritmo vai olhar idêntico. Um excesso de enzima é necessário para entregar um resultado reprodutível, porque deve estar certo de que a reação de hidrólise aproxima-se o ponto de extremidade.

Controle

1. Adicionar uma quantidade pré-determinada (veja acima), de mannanases (GH5 e GH26 ¹¹) para as alíquotas de ar no buffer da etapa 3.5, bem como um positivo (30 µ g de glucomannan konjac) e um controle negativo não-ar (mistura de enzima em um tubo vazio). Vórtice e em seguida girar brevemente para recolher a mistura de reação no fundo do tubo.
2. Incubar durante uma noite a 37 ° C (ou a temperatura apropriada para o GH de escolha), com agitação suave (~ 100 rpm).
3. Parar a reação incubando a 95 ° C por 20 min.
   Nota: Tampas de Cap podem ser usadas para selar os tubos de microcentrífuga flip-top.
   1. Centrífuga usando uma microcentrífuga de bancada superior na velocidade máxima por 10 min e reter sobrenadante.
4. Resuspenda o pellet em 250 µ l H ₂ O, centrífuga como acima e reter sobrenadante.
5. Combinar ambos os sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo (veja a Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 3 h ou durante a noite sem aquecimento).

5. Elaboração de normas Oligosaccharide

1. estoque de 1 mM de preparar soluções em H ₂ O da manose (homem), mannobiose (homem ₂), mannotriose (Man ₃), mannotetraose (homem ₄), mannopentaose (homem ₅) e mannohexaose (homem ₆), todos os β, 1-4 ligados. Alíquota e loja a-20 ° C até necessário.
2. Preparar 3 diferentes concentrações de um homem mistura de _1-6, combinando 1 µ l (padrão S1), 2 µ l (S2) ou 5 µ l (S3) de todos os seis.
3. Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 1 h).

6. Derivitization de oligossacarídeos

1. Prepare uma solução stock de formigas de 0,2 M (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonic) em H ₂ O: ácido acético 17:3. Estoque quente a 60 ° C para dissolver completamente o sólido. Loja a-20 ° C, protegido da luz, por 2-3 meses.
2. Prepare uma solução stock de 0,2 M de 2-picolina borano (2-PB) em DMSO. Isto é extremamente higroscópico, resuspenda então imediatamente todo o pó em cima do recibo em DMSO. Alíquota e loja a-20 ° C durante 1-2 anos. Descongelar as alíquotas como necessária (loja a 4 ° C, durante 2 semanas e em seguida descarte).
3. Preparar o buffer de derivatização de H ₂ O: ácido acético: DMSO às 17:03:20.
4. Para cada amostra, adicionar 5 µ l de formigas, 5 µ l de 2-PB e 10 µ l de tampão de derivatização. Spin brevemente para coletar no fundo do tubo, vórtice completamente e em seguida girar rapidamente novamente. Veja a Figura 1 para descrição de reação.
5. Amostras de incubar durante a noite a 37 ° C, protegido da luz.
6. Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 2 h).
7. Ressuspender amostras e padrão em ureia de 3M 100 µ l. Loja a-20 ° C, protegida da luz até necessária.

7. Gel de preparação do ritmo

Nota: montagem do equipamento de fundição de gel vai depender da marca. Aqui, nós use um sistema de eletroforese vertical (ver Tabela de materiais), equipado com placas de vidro de 18 x 24 cm e 1,5 mm espaçadores.

1. Montar equipamento de fundição de gel pelo fabricante ' instruções de s.
Buffer de ritmo
2. make x 10 (1 M Tris-borato pH 8,2) como segue: Adicionar 121,14 g de Tris-Base a ~ 400 mL de H ₂ O e misture para dissolver. Ajustar o pH a 8.2 por adição de ácido bórico sólido (cerca de 60 g) e em seguida fazem o volume até 1 L.
3. Fazer um 10% (p/v) de amônio persulfato (APS) estoque em H ₂ O. alíquota e armazenar em alíquotas de degelo-20 ° C. uma vez, armazenar a 4 ° C e descartar depois de 2 semanas.
4. Fazer e despeje o gel de resolução. Para os equipamentos acima, 1 gel equivale a 50 mL. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture H ₂ O (20,2 mL), 5 mL x 10 ritmo de tampão, 24,6 mL 40% acrilamida/Bis-acrilamida (29:1 acrylamide:Bis). (Atenção: tóxico).
   1. Adicionar 200 µ l de APS e 20 µ l de N, N, N, N´-tetrametil-etilenodiamina (TEMED). Inverta suavemente para misturar (para evitar a introdução de bolhas de ar). Despeje o gel usando um serológicos ou outra pipeta de grande volume, a ~ 4 cm abaixo do topo das placas de vidro. Preste atenção para a possibilidade de ficar preso no gel de bolhas de ar. Se eles fazer, parar de derramar e inclinação/torneira o gel para soltá-los.
5. Sobrepor o gel com isopropanol (inflamável de precaução :) ou, cuidadosamente, com H ₂ Allow O. gel para polimerizar (20-30 minutos) e, em seguida, despeje a camada superior. Se isopropanol foi usado, em seguida, lave 2 x com H ₂ O. Dry qualquer excesso de líquido usando papel mata-borrão.
6. Fazer e despeje o gel de empilhamento. Misture 6,8 mL H ₂ O, 1 mL de tampão de ritmo x 10, 2,8 mL acrilamida/Bis-acrilamida (PRECAUÇÃO: tóxico), 80 µ l APS e 8 µ l de TEMED em um tubo de centrífuga de 15 mL. Inverter para misturar e sobrepor em cima do gel de resolução polimerizado. Introduza cuidadosamente os pentes, evitando armadilhas bolhas de ar sob os dentes do pente.
Gel de
7. permitir a polimerizar (20-30 min), embrulhe em tecido úmido e em seguida em filme plástico e armazenar a 4 ° C até necessária. Loja com os pentes no lugar.
   Nota: Ritmo géis podem ser armazenados por um período máximo de 2 semanas (embora menos de 1 semana é o ideal), se eles são mantidos húmidos.

8. Executando um ritmo Gel

1. usar um marcador permanente para rotular as posições bem no vidro, que ajudarão a manter o controle de ordem de carregamento, e na identificação de onde os poços são uma vez que o pente é removido.
2. Remover o pente. Encher os poços com buffer de ritmo 1 x.
3. Usar um 10 µ l micro-seringa carregar 2 µ l de padrões e amostras em poços. Evite usar as pistas mais externa, que tendem a executar amostras mal.
4. Montar a câmara superior do aparato gel de execução e colocar o gel em um tanque de refrigeração (~ 10 ° C) execução (10 ° C), contendo 1 x ritmo buffer. Encha a câmara superior com buffer de ritmo 1 x.
5. Ligue o poder e executar o gel a 200 V (constante V) por 30 minutos e depois aumento da tensão de 1000 V para 1 h 40 min. Proteger os geles de luz (por exemplo, envolvendo tanques em sacos de lixo preto).
   Nota: Verificar os géis ~ 5 min depois de ligar a tensão e depois mais 5 min. depois de um aumento da tensão de 1.000 V. Se a bateria é incapaz de manter a tensão, então provavelmente existe um vazamento de reserva. Remova o gel do tanque. Volte a montar a câmara superior, cuidadosamente verificando o posicionamento de todas juntas. Um chip grande na borda superior da placa de vidro pode impedir a placa formando uma boa vedação com a junta. Isso geralmente pode ser temporariamente resolvido adicionando uma gota de agarose fundido de 5% (p/v) para a parte lascada do vidro, antes de adicionar a câmara superior.

9. Visualizando um gel de ritmo

Nota: Use um gel sistema equipado com lâmpadas de UV de ondas longas no transiluminador e um filtro de emissão para a câmera que é apropriado para o fluoróforo, aqui 530 nm de imagem. Alternativamente, um scanner a laser também pode ser utilizado, conforme descrito em Goubet ².

1. Certifique-se de gel sistema de imagem é livre de poeira, limpando-a com tecido úmido fiapos.
2. Remover o gel do tanque de ritmo e ver os brevemente, enquanto que o gel é ainda nas placas de vidro (< 80 ms) para determinar se a frente de tintura é ainda no gel.
3. Abrir o gel usando uma ferramenta de cunha e enquanto o gel é ainda na placa de um vidro, use um cortador de pizza para remover tanto o gel de empilhamento e, se a frente de tintura é ainda no gel, parte inferior do gel.
4. Coloque a superfície do transiluminador ~ 5 mL H ₂ O e depois transferir o gel diretamente sobre o transiluminador. Definir o filtro de UV 605 e ative o transiluminador UV de ondas compridas (ver Tabela de materiais) usando o software.
   Nota: O formigas fluoróforo usado aqui tem uma excitação/emissão de 353/520 nm.
5. Tirar várias fotos em vários tempos de exposição (por exemplo, 100 ms a 10 s). Certifique-se de que a luz UV é desligada entre imagens clicando no botão de luz de UV (para desligá-lo) para evitar a degradação da fluorescência. Garantir que pelo menos 2 das imagens não saturadas bandas (o gel software de imagem irá indicar isto).
6. Salve arquivos como imagens de alta-resolution.tif.
   Nota: Imagens podem ser analisadas usando o software fornecido com o sistema de imagem de gel, ou usando o software de análise de imagem livremente disponíveis, tais como ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Consulte a seção de resultados para uma discussão de quantificação.

Resultados

Aqui, nós mostramos um gel de ritmo de exemplo executado por protocolo, juntamente com descrições para ajudar com a interpretação de dados e solução de problemas, e este é seguido por um guia geral para sucesso ritmo gel de interpretação^13,16. Um gel representativo de um ritmo padrão ensaio do conteúdo de parede celular Medeiros é mostrado na Figura 2e é descrito a faixa por faixa.

Normas
Faixas 1, 2 e 3 mostram uma escada de oligossacarídeos adquiridos comercialmente (homem₁- homem₆) em 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentração. Ao receber um lote novo de um oligossacarídeo comercial, é importante verificar a pureza em um gel. Muitos oligossacarídeos, particularmente tetrasacccharides e mais, pode ter uma contaminação significativa com oligossacarídeos de outros graus de polimerização (DPs), como mostrado aqui para homem₆ (marcados com *). Enquanto dosar um gel, é importante ter pelo menos 3 concentrações dos padrões, uma vez que é necessário para calcular a curva padrão. Cálculo da curva padrão também pode ser útil para garantir que a reação de derivatização é essencialmente na conclusão. Padrões de concentrações conhecidas permitem comparações entre géis e são um controle útil para separação de qualidade e qualidade de derivatização.

Controlo positivo
Lane 4 mostra uma digestão mananase de glucomannan konjac. Glucomannan konjac é disponível comercialmente, e enquanto não tem a mesma estrutura que, por exemplo, encontrados em Arabidopsis, serve dois propósitos. Em primeiro lugar, é um controle importante para a digestão enzimática. O pesquisador deve estabelecer como um substrato comercial digerido com seus GHs de escolha parece quando digerido a conclusão (ou seja, um grande excesso de GH é adicionado para a reação). Se no futuro as experiências altera o padrão, isso pode indicar uma perda de atividade ou contaminação da unidade populacional de GH. Em segundo lugar, ele serve como um controle para a reação de derivatização na presença de sais de enzima e o tampão. Se as normas de boas aspecto, mas o controle positivo é pobre, então isso pode indicar que um componente da reação de hidrólise é inibitório para a derivatização.

Haste de Arabidopsis tipo selvagem (WT) ar + mananase cocktail (GH5 + GH26)
5 Lane mostra a impressão digital de ritmo de um tronco de Arabidopsis WT (compare com referências^11,14).

csla9 Haste de Arabidopsis ar + mananase cocktail (GH5 + GH26)
6 Lane mostra mostra a impressão digital de ritmo da haste de um Arabidopsis plantar falta o major Medeiros sintase¹¹-tronco. Compare o WT e controlo negativo impressões digitais. Enquanto a maioria do Medici está ausente nesta fábrica, permanece uma quantidade pequena, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzida para todos os derivados de mananase oligossacarídeos isto é sintetizado pelas sintases Medeiros adicionais (CSLA2, 3)¹¹.

Controle negativo - enzima apenas
8 Lane mostra bandas no gel que não são específicas de que derivam dos contaminantes o mananase cocktail e devem ser excluídas da análise (marcados com *).

Controle negativo - WT somente AIR
9 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).

Controle negativo- csla9 Somente AIR
10 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).

Pinho de madeira ar + mananase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 7 mostra a impressão digital de ritmo de madeira de pinho, que contém galactoglucomannan. Isto claramente tem um padrão diferente de oligossacarídeos liberados de Arabidopsis, devido à sua estrutura diferente.

Controle negativo - pinho somente AIR
Lane 11 mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).

Interpretar um gel de ritmo é relativamente simples, mas requer a conscientização dos pontos seguintes. De dados robusto, é recomendável efectuar ritmo pelo menos 3 independentemente crescido biológica Replica, e recomenda-se realizar pelo menos 2 repetições de técnicas em cada replicar biológica. Os controles descritos são essenciais para a interpretação, como faixas não específicas devam ser excluídos. Também recomendamos carregar amostras em uma ordem diferente em replicar geles, para excluir os efeitos que resultam de iluminação desigual pelo transiluminador. Exata interpretação requer análise das bandas que não estão saturados. Como algumas impressões de oligossacarídeo podem conter ambos os polissacarídeos abundância muito alta e baixa, recomendamos analisar várias exposições do gel mesmo. Os padrões podem ser usados para normalizar entre diferentes imagens.

Para alguns tipos de experimentos, pode ser desejável para quantificar a quantidade de polissacarídeo em preparação o ar. Enquanto é possível quantificar de um gel de ritmo, exige o conhecimento da identidade molecular exata de cada oligossacarídeo lançado pelo GHs e onde ele está localizado no gel o ritmo. Isso atualmente não é totalmente conhecido por Medeiros, mas foi determinado para outros polissacarídeos , por exemplo, xilana³. Os padrões fornecem uma maneira de normalizar entre géis, mesmo quando a quantificação não está sendo executada e assim ajudará em qualquer análise qualitativa ou semi-quantitativa.

Identificar a estrutura de oligossacarídeos individuais pode ser conseguido usando coquetéis de GHs. Sequential adição de mais GHs pode revelar detalhes sobre o estabelecimento de vínculos e substituições dos oligossacarídeos liberados (por exemplo, adição de β - 1,4 - glicosidase que age na extremidade não redutora irá revelar quais oligossacarídeos na mistura contenham esse recurso). As enzimas disponíveis incluem galactosidases, glucuronidases e glucosidases (consulte o banco de dados CAZy¹⁶ para obter informações adicionais); Ver Hogg, d. et al . ¹⁷ como exemplo.

O protocolo acima pode ser usado para caracterizar a atividade do GHs desconhecidos. Neste caso, uma biomassa definida, tais como Arabidopsis haste ou konjac glucomanano, deve ser usada para a tela o GHs desconhecido¹³.

Figura 1 : Isto mostra o esquema para o fluorescente derivatização de oligossacarídeos com formigas. Modificado da Goubet². clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Gel de ritmo representativo mostrando a impressão digital Medeiros de Arabidopsis, pinheiros e um mutante de Arabidopsis (csla9) que tem comprometido a biossíntese de Medeiros. AlR foi hidrolisada com um cocktail de mananase e oligossacarídeos liberados foram derivatizados com um fluoróforo. Os oligossacarídeos foram separados por eletroforese em gel com base no tamanho, forma e carga. Uma escada de manno-oligossacarídeos (Man1-6) é mostrada para ajudar a identificar mobilidades relativas dos oligossacarídeos, lançados, e uma hidrólise de Medeiros purificado (derivado de konjac) é mostrada como um controle positivo. * = faixas não específicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

RITMO é um método simples para caracterizar a estrutura de polissacarídeos. Pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem conhecidas GHs com atividade caracterizada, ver inúmeros exemplos na literatura^1,6,9,11. TT também foi aplicado para a caracterização do romance GHs^12,13,18 e glycosyltransferases⁹, fazendo uso de substratos de polissacarídeo definidos e aceitadores.

Resultados reprodutíveis, interpretáveis são dependentes em três etapas-chave. Primeiro, o GHs usado deve ser livre de contaminar as atividades. Isto é melhor alcançado usando apenas heterologously expressa, afinidade purified enzimas. Em segundo lugar, para a maioria dos experimentos, é importante que a hidrólise enzimática de substratos é na conclusão. Isso garantirá que a mesma biomassa hidrolisada com o GH mesmo dá a mesma impressão em cada experimento. Finalmente, deve haver um excesso de fluoróforo na reação de derivatização. Isso garante que as extremidades reduzindo disponíveis são rotuladas em perto de 100%. Isso resultará em alta reprodutibilidade dos resultados, bem como os dados quantitativos.

Gel e reagente de qualidade são essenciais para garantir os dados podem ser reproduzidos. Buffers de má qualidade, especialmente de pH incorreto, bolhas no gel de ar, e amostras com excesso de sal podem todos afetam fator resolução e retenção dos oligossacarídeos. No entanto, inclusão dos controles recomendados descritos na seção de protocolo e resultados permitirá solução de problemas.

RITMO é limitado pela sua capacidade de identificar oligossacarídeos. Para algumas experiências, uma impressão digital simples é tudo que é necessário. Contudo, para verdadeiramente dosar a quantidade de glucomannan em uma amostra de ar, por exemplo, a identidade de todos os oligossacarídeos lançados seja necessária, que é um processo demorado. Isto é mais simples para menos polissacarídeos complexos como xilana³. Uma vez que existem alguns padrões de oligossacarídeo comercialmente disponível, pode não ser sempre possível ou desejável para identificar todas as bandas. Neste caso, o ritmo pode fornecer dados muito elogioso para espectrometria de massa (ou seja, MALDI-CID⁹ ou ESI-MS⁷e NMR⁶). Para esses métodos, muitas vezes é útil fazer uma preparação em grande escala, separados por cromatografia de exclusão de tamanho e em seguida analisar cada fração por ambos ritmo antes da MS ou NMR. Enquanto tem sido relatado que bandas podem ser extirpadas e identificadas por MALDI-CID, na prática, constatámos que isso tem uma baixa taxa de sucesso (possivelmente devido a interações dos oligossacarídeos, etiquetados com o gel do acrilamido quando exposto à luz UV).

A outra limitação importante do ritmo é a taxa de transferência. Para ter boa qualidade, géis interpretáveis com os controles apropriados, cada gel terá somente ~ 10 amostras experimentais, e um pesquisador pode esperar para executar géis de ritmo ~ 4 por dia. Recentemente, uma versão do ritmo utilizando eletroforese capilar (CE) tem sido desenvolvido,¹⁹, que permite a preparação de amostras em placas de 96 poços. Ele tem sido usado com sucesso para caracterizar as atividades de enzima glycosyltransferase e polissacarídeo estruturas^6,19, ainda requer acesso a uma máquina de CE, o que pode ser caro para comprar e manter.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose	Sigma-Aldrich	CAS 3458-28-4
Mannobiose	Megazyme	CAS: 14417-51-7
Mannotriose	Megazyme	CAS: 28173-52-6
Mannotetraose	Megazyme	CAS: 51327-76-5
Mannopentaose	Megazyme	CAS: 70281-35-5
Mannhexaose	Megazyme	CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)	Megazyme	P-GLCML
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid	(Molecular probes) Thermo	A350
2-picoline borane	TCI	B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)	Bio-rad	1610146
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit	Hoefer	SE660 kit	18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath	Hoefer	RCB20-plus 115v	Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System	Syngene	05-GBOX-CHEMI-XRQ	Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack	Thermo	EC1000XL	1000V
Vacuum centrifuge(Speedvac)	Savant	SPD131
Vertical Gel electrophoresis system	Hoefer	SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)	VWR	21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)	VWR	21008-951
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys)	Syngene