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Resumo

O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.

Resumo

Um esferoide (um agregado multicelular) é considerado como um bom modelo de tecidos vivos no corpo humano. Apesar do avanço significativo nas culturas esferoide, uma rede vascular perfusable nos esferoides permanece um desafio crítico para a cultura a longo prazo, necessário para manter e desenvolver as suas funções, tais como expressões de proteína e morfogênese. O protocolo apresenta um novo método para integrar uma rede vascular perfusable dentro o spheroid em um dispositivo microfluidic. Para induzir uma rede vascular perfusable no spheroid, brotos de angiogênico ligados ao microcanais foram guiados para o spheroid utilizando angiogênico fatores de fibroblastos de pulmão humano cultivados no spheroid. Os brotos angiogênico alcançou o spheroid, fundiu-se com as células endoteliais co cultivadas no spheroid e formaram uma rede vascular contínua. A rede vascular poderia perfundir o interior o spheroid sem quaisquer fugas. A rede vascular construída pode ser mais usada como uma rota para o fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos de produtos, imitando a circulação de sangue vivo em. O método fornece uma plataforma nova em cultura de esferoide em direção a melhor recapitulação dos tecidos vivos.

Introdução

Mudando de uma cultura de monocamada (bidimensional) para uma cultura tridimensional é motivada pela necessidade de trabalhar com modelos de cultura que imitam as funções celulares de vida tecidos1,2,3. Substratos de plástico lisos e duro comumente utilizados na cultura de pilha não se assemelham a maioria dos ambientes extracelulares no corpo humano. Na verdade, muitos estudos demonstram que arquitetura de tecido-específica de recriar de cultura tridimensional, pistas mecânicas e bioquímicas e comunicação célula-célula, que não tenham sido observados na cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.

Um agregado multicelular ou esferoide, é uma das técnicas mais promissoras para perceber esta cultura tridimensional9,10. As células secretam a matriz extracelular (ECM) e podem interagir com os outros no spheroid. Embora alguns outra bioengenharia aproxima-se13,11,12,14, tais como célula de empilhamento, replicar com sucesso a complexidade espacial do corpo humano, essas abordagens têm apenas dois ou três tipos de células para a facilidade de análise e focada em apenas uma função de órgãos-alvo. Em contraste, as células em esferoides são expostas a ambientes de cultura diferente, dependendo de suas posições no spheroid devido à oferta heterogênea de nutrientes, oxigênio e parácrina e autócrina sinalização moléculas no spheroid. Esse recurso de esferoides imita parcialmente na vivo condição de cultura e ativar as células em esferoides para criar tecido muito mais complexo, organizado estruturam em vitro do que aquelas cultivadas em empilhamento tecido9, 15 , 16. note que se um esferoide é composto por um único tipo de células, a função das células o spheroid não é uniforme, devido ao ambiente heterogêneo no spheroid. Nos últimos anos, as culturas de esferoide permitido células-tronco pluripotentes células-tronco embrionárias (CES), induzidas (iPSCs) ou células-tronco tecido-residente para imitar na vivo do desenvolvimento sequências e recriar miniórgãos como o cérebro de17, fígado18e rim19,20.

Apesar dos progressos significativos nas técnicas de cultura de esferoide, cultivo esferoides grandes por muito tempo ainda é problemático. Em um tecido tridimensional, células precisam ser localizado dentro de 150-200 µm de um vaso sanguíneo devido a quantidade limitada de oxigênio e nutrientes21. Redes vasculares dentro o spheroid são necessárias para recapitular a troca de substâncias entre o sangue e os tecidos em vivo. Para conseguir isso, outros grupos têm co culto células endoteliais com alvo células22,23,24 ou induziu a diferenciação de células pluripotentes em células de CD31 positivo20. No entanto, as estruturas de embarcação-como relatadas não têm as extremidades abertas da lumina para fornecer oxigênio e nutrientes para o centro do spheroid. Para simular a função vascular para nutrir as células na cultura tridimensional, em aberto e perfusable rede vascular deve ser desenvolvida no spheroid.

Durante os últimos anos, alguns grupos de pesquisa no campo microengineering relataram métodos para construir uma rede vascular perfusable, formada espontaneamente em um dispositivo microfluidic utilizando factores angiogênico das células de fibroblastos cocultured25 ,26. Estas redes vasculares têm uma morfologia semelhante às suas contrapartes na vivo e podem ser remodelados por fatores ambientais, tornando-os adequados para imitar funções vasculares em uma cultura de esferoide. O propósito do presente protocolo é construir uma rede vascular perfusable em um esferoide usando uma plataforma de microfluidic27. O dispositivo microfluidic é modificado o dispositivo anteriormente relatados25 para que um esferoide pode ser incorporado. Direcionando a secreção angiogênico das células de fibroblastos em um esferoide de células endoteliais em microcanais, angiogênico brotos dos microcanais anastomosadas com o spheroid e formou uma rede vascular perfusable. Este método permite uma entrega direta de uma vasta gama de substâncias, tais como moléculas fluorescentes e grânulos de micrômetro-escala para o interior de um esferoide, que fornece o quadro para uma cultura de tecidos de longo prazo com redes vasculares.

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Protocolo

1. a fabricação do molde Microfluidic dispositivo

  1. Desenha o padrão do dispositivo microfluidic usando software disponível comercialmente (Clewin5 ou AutoCAD 2016, etc.). Para a função do Clewin5, consulte o manual do usuário (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    Nota: O arquivo de projeto está disponível no arquivo complementar 1.
  2. Transferir o arquivo de projeto para um gerador de padrão micro e carregar a ferramenta com uma máscara de cromo revestida com o fotorresiste positivo.
  3. Expor o fotorresiste positiva na área padrão usando um gerador de padrão micro.
  4. Desenvolver o fotorresiste positiva usando o desenvolvedor (Tabela de materiais) e enxaguar a máscara com água desionizada (DI).
  5. Usando o ácido de cromo (Tabela de materiais), condicione o cromo na área exposta onde o fotorresiste positivo foi removido. Enxague a máscara com água.
  6. Remova o restante o fotorresiste a máscara usando acetona.
    Nota: A máscara de transparência pode ser uma alternativa para a máscara de Cr.
  7. Preparar uma bolacha de silicone limpa (4 polegadas, P(100)) e rotação casaco hexamethyldisilazane (HMDS) a 3.000 rpm por 30 s.
  8. Softbake HMDS por 5 min a 120 ° C e esfriar a bolacha por 5 min à temperatura ambiente.
  9. Spincoat o fotorresiste negativo (tabela de materiais) a 500 rpm para 10 s e 1.200 rpm por 30 s.
    Nota: A condição de revestimento de rotação deve produzir as camadas fotorresiste com uma espessura de aproximadamente 100 µm sobre as bolachas, depois fotolitografia.
  10. Prebake o negativo fotorresiste por 45 min a 95 ° C e esfriar a bolacha para 60 min à temperatura ambiente.
  11. Verifique a intensidade da luz UV em cada experimento e calcular o tempo de exposição para uma dose de energia de exposição total de 250 mW/cm2. Coloque a Fotomáscara (etapa 1.1-1.6) sobre a bolacha e expô-los à luz UV.
  12. Postbake o negativo fotorresiste por 1 min a 65 ° C e a 5 minutos a 95 ° C. Permita a bolacha refrigerar para baixo por 1 min à temperatura ambiente.
  13. Desenvolva a camada negativa fotorresiste por 15 min no banho primeiro desenvolvedor (Tabela de materiais) e a 2 min no segundo banho. Enxágue a bolacha no primeiro banho isopropanol (IPA) por 10 s e no segundo banho IPA por 10 s.
  14. Hardbake o negativo fotorresiste por 30 min a 200 ° C e esfriar a bolacha por 5 min à temperatura ambiente.
  15. Medir a espessura da camada de fotorresiste negativo usando um gerador de perfil de superfície.
  16. Colocar a bolacha num exsicador ligado a uma bomba de vácuo e adicionar 200 µ l de silano (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Ligue a bomba durante 10 minutos, desligá-lo e continuar a bolacha no exsicador para 4 h.

2. etapas a fabricação e a montagem de camadas PDMS

  1. Conversão do pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) (PDMS base: agente de cura = 10:1 (w/w)) e desgaseificar em uma câmara de vácuo para 2h.
  2. Cura PDMS a 80° C em um forno ventilado de ar durante a noite.
  3. Retire o PDMS do wafer de silício.
  4. Socar a 1A de buracos - 3B (Figura 1) e a cultura de esferoide bem. Use um soco de 2 mm de diâmetro para furos 1A - 3B e um diâmetro de 1 mm um soco para o spheroid bem.
  5. Limpe a laje PDMS e uma lamela de vidro (24 mm × 24 mm) com fita adesiva, por várias vezes furando e descascando a fita. Em seguida, tratar a laje PDMS com plasma de ar para 40 s (40 mW, 50 sccm).
  6. Ligação da laje PDMS para o deslizamento da tampa de vidro para expulsar quaisquer bolhas de ar da superfície entre a laje PDMS e a lamínula e cura a 80 ° C, durante pelo menos 12 h.

3. spheroid preparação

Nota: No estudo, proteína fluorescente vermelha expressando umbilical humano veia células endoteliais (RFP-HX) e expressar a proteína verde fluorescente HX (GFP-HX) é usados no esferoide e microcanais, respectivamente, para distinguir a origem do HX após a construção de uma rede vascular perfusable. Se a origem do HX não é necessário, sem rótulo HX é suficientes para o experimento.

  1. Descongelar o RFP-HX (3,0 × 105 células/frasco) e fibroblastos de pulmão humano (fan) (1,0 × 106 células/frasco) e adicioná-los em 10 mL de meio para células endoteliais e células de fibroblastos, respectivamente (Tabela de materiais). Cultura-os em um prato de 100mm no 37 ° C e 5% de CO2 por 2-3 dias para sub confluente RFP-HX e hLFs. Esta preparação renderá ~ 200 esferoides.
  2. Desanexar a RFP-HX e hLFs de pratos com 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e parar a reação de tripsina com 4 mL de DMEM contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.
  3. Após a centrifugação a 220 x g, durante 3 min, remover o sobrenadante e ressuspender o RFP-HX e hLFs a endotelial médio concentrações de final de célula em 2,5 × 104 e 1,0 × 105 células/mL, respectivamente.
  4. Delicadamente adicione 200 µ l de suspensão de célula (5.000 células para RFP-HX) e 20.000 células por hLFs por alvéolo em uma placa de 96 poços, com superfície de ligação ultra baixo.
  5. Incube a placa de 96 poços em 37 ° C e 5% de CO2 por um período de 2 a 4 dias.
    Nota: Uma vez que o diâmetro de esferoide depende o período de cultura e o número de célula inicial da placa de 96 poços, pode ser controlado por estes dois parâmetros.

4. célula semeadura no dispositivo Microfluidic

Nota: A Convenção de nomenclatura para os furos, canais e o esferoide bem são demonstrados na Figura 1. Definimos o dia 0 como o dia quando a célula colheita no dispositivo microfluidic terminar. Diagrama esquemático de prazos das experimentais é mostrado na Figura 2.

  1. Carregamento de esferoide − 1 dia)
    Nota: O passo seguinte deve ser executado no gelo para evitar gelificação de colágeno e fibrina.
    1. Dissolva o fibrinogênio em solução salina tamponada fosfato (PBS) para uma concentração final de 2,80 mg/mL.
    2. Prepare o colágeno neutralizado (3,0 mg/mL de PBS) de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Combine 107,2 µ l da solução de fibrinogênio (2,80 mg/mL), 8,0 µ l de colágeno neutralizado (3,0 mg/mL) e 3,6 µ l de aprotinina (5 U/mL) por reação em um tubo. Esta solução é rotulada "mestre mistura solução" (MS).
      Nota: O volume é suficiente para carregar um esferoide. Se houver mais de um esferoide, multiplique cada volume pelo número de esferoides.
    4. Dissolva a trombina em PBS para uma concentração final de 50 U/mL.
      Nota: Alíquotas de 50 trombina U/mL (20 µ l/tubo) são armazenadas em 30 ° C e são descongeladas antes de cada experimento.
    5. Coloque a placa de 96 poços, contendo os esferoides dentro da armário de biossegurança.
    6. Prepare dois pratos de Petri 35mm dentro do armário, com um prato no gelo (prato 1) e o outro prato sobre a bancada (prato 2) a biossegurança. Pipeta 99 µ l de MS no centro do prato 1 (Figura 3a) para formar uma gota.
    7. Apare as pontas de 2 amarelo (10-100 µ l) e 3 limpar pontas de pipetas (1-100 µ l) para a coleção de esferoides da placa de 96 poços, mistura de trombina com MS, precisa coleção dos esferoides, injetando os esferoides o dispositivo e injetando o dispositivo de mídia , respectivamente. O tamanho dos poros da ponta deve ser ligeiramente maior que o diâmetro dos furos 1A - 3B dos canais 1 e 3 ou o spheroid bem no canal 2 para um confortável apto.
      Nota: Daqui em diante, a menos que indicado o contrário, use as pontas de pipeta cortadas nesta etapa. A fotografia de dicas de corte está disponível na Figura 4.
    8. Coletar um esferoide com 100 µ l do meio da placa de 96 poços e adicioná-lo ao prato 2 (Figura 3a).
    9. Pega o spheroid com volume mínimo de mídia do prato 2. Mantendo a pipeta na posição vertical, o spheroid deve avançar para a parte inferior da ponta da pipeta por gravidade. Ejete o spheroid tocando a ponta da pipeta para o menisco do MS gota no prato 1 (Figura 3a).
      Nota: Os passos seguintes 4.1.10 & 4.1.11 devem ser realizados rapidamente.
    10. Adicione 1 µ l de trombina (50 U/mL) e misture delicadamente com a ponta da pipeta amarelo.
    11. Com a pipeta, situada a 7 µ l, pegar o spheroid e lentamente coloque-o dentro do poço de esferoide (Figura 3b).
    12. Incube por 15 min a 37 ° C para a gelificação de fibrina.
    13. Lentamente injete endotelial médio dos buracos 1A e 3A e preenchimento canais 1 e 3 com mídia (20 ~ 30 µ l/canal).
    14. Coloque o dispositivo em um prato de 100mm com um Kimwipe molhado para evitar a evaporação de mídia do dispositivo (Figura 3C).
    15. Coloque o dispositivo em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h remover as bolhas na interface entre a mídia e a fibrina.
  2. Dia 0) HX carregando
    1. Descongelar o GFP-HX (3,0 x 105 células/frasco) e adicioná-los à 10 mL do meio de endotelial. Cultura-os em um prato de 100mm no 37 ° C e 5% CO2 por 2-3 dias para chegar a subconfluência. Um prato de sub confluente GFP-HX é suficiente para a preparação de dispositivos de 8-10.
    2. Desanexar GFP-HX de pratos com 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e parar a reação de tripsina com 4 mL de DMEM contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.
    3. Após a centrifugação a 220 x g, durante 3 min, resuspenda o GFP-HX a endotelial médio no 5.0 x 106 células/mL.
    4. Injetar suspensão de células de HX no canal 1 através do buraco 1B (20 µ l/canal).
    5. O dispositivo microfluidic 90° de inclinação, coloque-o no lado e incubar a 37 ° C por 30 min garantir que o HX adere a fibrina no canal 2.
      1. Confirme a penhora de HX sobre a fibrina. Quando o número de HX anexado na interface entre o gel e o médio não é suficiente, a vasculatura pode ser desconectada na raiz vascular após alguns dias de cultura de dispositivo (Figura 5). No protocolo, a taxa de sucesso da perfusão é > 50%.
    6. Repita as etapas 4.2.4 e 4.2.5 para canal 3.
    7. Células de cultura em um prato de 100mm com um Kimwipe úmido a 37 ° C e 5% CO2 por 7-14 dias.
  3. 1 dia ~) troca de mídia
    1. Metade dos meios de comunicação nos canais 1 e 3 troca todos os dias.

5. núcleos de coloração

  1. Prepare o paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.
  2. Remova a mídia dos canais 1 e 3 e adicionar 20 µ l de 4% PFA por canal. Para substituir a solução em 4% PFA, repetição removendo a solução do dispositivo e adicionar 4% PFA três vezes.
  3. Incube o dispositivo a 4 ° C durante a noite.
  4. Remover 4% PFA do dispositivo e lavagem dos canais três vezes com PBS.
  5. Adicione 20 µ l de 10 µ g/mL a tintura fluorescente (Tabela de materiais) por canal para manchar os núcleos celulares. Para trocar a solução no dispositivo, repita removendo a solução do dispositivo e adicionando 10 µ g/mL a tintura fluorescente três vezes.
  6. Armazene o dispositivo em 4 ° C por 24 h.

6. fluido perfusão de um esferoide

  1. Prepare o spheroid após cultivo para mais de 7 dias no dispositivo a 37 ° C e 5% de CO2 para a conclusão de um percurso vascular contínuo.
  2. Remova o meio de 3B, 1B, 3A e 1A de buracos.
  3. Introduzir 10 µ l de solução de 10 µM de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran em PBS em buracos 1A e 1B.
  4. Monitore o fluxo de microbeads ou tintura FITC sob um microscópio invertido.

7. quantificação de comprimento Sprout

Nota: O software de ver. 1,49 ImageJ é usada para todas da análise da imagem neste estudo.

  1. Sobrepor as imagens dos dias de GFP-HX 0, 1, 3, 5 e 7.
  2. Subtrai a posição da ponta da vasculatura do dia 0 na mesma posição para imagens tiradas nos dias 1, 3, 5 e 7.
  3. Determine o crescimento da ponta vascular da posição de raiz (Figura 6). A distância entre a ponta vascular e raiz foi definida como o comprimento do broto neste estudo (Figura 7b).

8. quantificação dos ângulos Vascular

Nota: Ângulo Vascular foi definido como o ângulo consistia por ângulo vascular, raiz e centro do spheroid (Figura 7C).

  1. Binarize as imagens fluorescentes do spheroid coculture contendo RFP-HX e medir a posição de "centroide" pela função de análise no ImageJ. Neste estudo, a posição de medida "centroide" é definida como o centro do spheroid (Figura 6).
  2. Determine a posição das pontas vasculares e raízes na mesma maneira na etapa 7.
  3. Medir os ângulos vasculares usando a função de análise no software ImageJ.

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Resultados

A Figura 1 mostra um design e fotografia do dispositivo microfluidic. Tem três canais paralelos, no qual o canal 2 contém o spheroid bem. Canais 1 e 3 são usados para a cultura HUVEC e canal 2 é para o spheroid. Cada canal é separado por microposts trapezoidal projetado para padrão de PDMS. Os microposts impedir o hidrogel no canal 2 de vazamento nos canais 1 e 3 por tensão superficial e permitir a troca de substâncias entre o esferoide e HX em microc...

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Discussão

Relatórios anteriores mostram que hLFs secretam um coquetel de fatores angiogênico múltiplos, tais como angiopoietina-1, angiogenin, fator de crescimento de hepatócito, transformando o fator de crescimento-α, fator de necrose tumoral e algumas proteínas da matriz extracelular29, 30. Este ensaio baseia-se na secreção de hLFs em um esferoide coculture, que é a limitação da técnica angiogênico. Portanto, é fundamental para uma formação vascular est?...

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Divulgações

O autor declara que eles não têm nenhum concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela crista JST (número de concessão JPMJCR14W4), sociedade para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI (número de concessão 25600060, 16K 16386), o centro de inovação programa do MEXT e JST, projeto focado no desenvolvimento de tecnologia de avaliação de chave de Agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED, Mizuho Fundação para a promoção das Ciências. Microfabrication foi apoiado pela Universidade de Kyoto Nano tecnologia Hub.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
A chromium mask coated with AZP 1350.CLEAN SURFACE TECHNOLOGYCBL2506Bu-AZP
Micro pattern generatorHeidelberguPG101
MF CD-26 developerRohm and haas electronic materials-Developer in protocol 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24Chromium etchant in protocol 1.5
AcetonWako012-00343
Silicon WaferCanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-Negative photoresist in protocol 1.9
UV ExposureNanometric Technology IncLA310s
SU-8 DeveloperMicroChemY020100Developer for the negative photoresist in protocol 1.13
2-propanolWako163-04841
Surface profilerVeecoVeeco Dektak XT-S
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaneSigma448931
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
Biopsy Punch (1.0mm) Kai IndustriesBP-10F
Biopsy Punch (2.0mm) Kai IndustriesBP-20F
Plasma SystemFemto ScienceCOVANCE
Cover glassMATSUNAMI GLASSC024241
Culture DishesIwaki1000-035
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial CellAngio ProteomiecAP-0001RFP
Normal Human Lung FibroblastsLonzaCC-2512
Endothelial Cell Growth MediumLonzaCC-3162
Fibroblast Growth Media KitsLonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific11965092
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific26140079
Penicillin-Streptomycin SolutionWako168-23191
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol RedWako204-16935
PBS (Phosphate Buffered Salts)Takara bioT900
96-well plateSumitomo bakelite631-21031
1000ul ChipNIPPON GeneticsFG-402
200ul  ChipNIPPON GeneticsFG-301
10ul ChipNIPPON Genetics37650
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificModel 370
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial CellAngio ProteomiecAP-0001GFP
Fibrinogen from bovine plasmaSigmaF8630
Aprotinin from bovine lungSigmaA6279
Collagen ICorning354236
Thrombin from bovine plasmaSigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5
Paraformaldehyde SolutionWako163-25983
Inverted Fluorescence MicroscopeOLYMPUSIX71
Degital CCD CameraOLYMPUSORCA-R2
Confocal Laser Scanning Biological MicroscopeOLYMPUSFV1000
Inverted Fluorescence MicroscopeOLYMPUSIX-83
Fluorescein isothiocyanate-dextranSigmaFD70S

Referências

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