Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Resumo

Citometria de fluxo em combinação com o cluster visual oferece um método fácil de usar e rápido para o estudo de biofilmes aquáticos. Pode ser usada para a caracterização do biofilme, detecção de mudanças na estrutura da comunidade de biofilme e detecção de partículas abióticas incorporado no biofilme.

Resumo

Biofilmes são consórcios dinâmicos de microorganismo que desempenham um papel fundamental nos ecossistemas de água doce. Alterando a sua estrutura de comunidade, biofilmes respondem rapidamente às mudanças ambientais e podem ser usados assim como indicadores da qualidade da água. Atualmente, biofilme avaliação baseia-se principalmente na integrativo e funcionais pontos de extremidade, como atividade fotossintética ou respiratória, que não fornecem informações sobre a estrutura da comunidade de biofilme. Visualização computacional e citometria de fluxo oferecem um método alternativo, sensível e fácil de usar para avaliação da composição da Comunidade, particularmente da parte photoautotrophic de biofilmes de água doce. Ela exige apenas a preparação da amostra básica, após o qual a amostra inteira é executada através do citômetro de fluxo. As informações de ópticas e fluorescentes de célula única são usadas para visualização computacional e interpretação biológica. Suas principais vantagens sobre outros métodos são a velocidade de análise e a natureza de alta-informação-conteúdo. Citometria de fluxo fornece informações sobre as várias características de celular e biofilme em uma única medição: granulometria, densidade, pigmento, conteúdo, conteúdo abiótico no biofilme e informações taxonômicas grosseiras. No entanto, ele não fornece informações sobre a composição do biofilme sobre o nível de espécie. Vemos o alto potencial na utilização do método para monitoramento ambiental dos ecossistemas aquáticos e como uma avaliação de biofilme inicial passo que informa a jusante detalhadas investigações por métodos complementares e mais detalhados.

Introdução

Biofilmes são consórcios dinâmicos de microorganismo que desempenham um papel fundamental nos ecossistemas de água doce, desde a produção primária, ciclagem de nutrientes e purificação de água para influenciar a distribuição de microrganismos e sua biodiversidade do ecossistema ¹. quando biofilmes são expostos a mudanças nas condições ambientais ou de estressores, tais como produtos químicos, sua estrutura de comunidade desloca rapidamente no sentido mais tolerante espécie^2,3. Sua alta sensibilidade transforma biofilmes em sistemas modelo atraente para monitoramento ambiental⁴, no entanto, nenhum dos métodos atuais é perfeitamente adequado para rastrear na verdade a dinâmica de uma comunidade de biofilme em uma maneira rápida e fácil.

O comumente usado conjunto de métodos para caracterizar biofilmes consiste a medição de pontos de extremidade funcionais e estruturais. A nível de toda a Comunidade, atividade fotossintética e respiratória, bem como a atividade de enzimas extracelulares fornece informações sobre o estado funcional do biofilme^{5,6,7,8 ,9}. Acumulação de biomassa é usada como um indicador para o crescimento global do biofilme. Mudanças estruturais são medidas atualmente ou usando a identificação de espécies tradicionais com microscopia de luz ou com técnicas baseadas em nucleotídeos (por exemplo, desnaturação de eletroforese em gel de gradiente (DGGE), espaçador intergênica ribosomal automatizado análise (ARISA), metagenômica)^10,11,12. Esses métodos fornecem informações mas são demorados para executar, ou exigem conhecimento específico ou ainda em desenvolvimento. Finalmente, novos métodos para a avaliação de substâncias poliméricas extracelulares (EPS)^13,14 e o biofilme arquitetura¹, ao mesmo tempo sensível, são de baixa produtividade e ainda não foram desenvolvidos para efeitos de controlo.

É evidente que para uma completa caracterização de biofilmes de água doce, é necessário combinar diversos métodos, que fornecem insights sobre a função de biofilme, composição e arquitetura. Para monitoramento ambiental, por outro lado, um método rápido e sensível que é capaz de detectar alterações no biofilme e permitir a interpretação biológica básica das mudanças a nível estrutural e funcional é necessário.

Temos desenvolvido um novo método para caracterização da comunidade microbiana do componente fototróficas de biofilmes de fluxo (perifíton), que é rápido o suficiente para fins de fiscalização e ao mesmo tempo fornece informações suficientes sobre a comunidade de biofilme estrutura para permitir a interpretação biológica¹⁵. Ele é baseado na citometria de fluxo de célula única (FC) de amostras de biofilme e juntamente com visualização computacional e fornece informações sobre propriedades óticas e fluorescentes do biofilme sobre o nível de célula única.

O fluxo de trabalho após a amostragem de biofilme consiste em preparação da amostra na forma de sonication, fixação e baseado no tamanho de filtragem das amostras seguidas por avaliar a amostra por citometria de fluxo. Os dados adquiridos fornecem informações sobre as várias características de celulares em uma única medida: granulometria, densidade, teor de pigmento, abiótico conteúdo (por exemplo, microplastics) no biofilme. Este conjunto de dados é que analisado através de visualização computacional usando visual vizinho estocástico incorporação (viSNE)¹⁶, que permite rápida e fácil interpretação dos dados. Embora algumas semanas são necessárias para configurar e otimizar o método, uma vez configurado, leva apenas algumas horas da coleta das amostras de biofilme para interpretação dos resultados.

As principais vantagens do método apresentado sobre os outros são a velocidade de análise e conteúdo de informação de alta. Além disso, as amostras podem ser armazenadas durante várias semanas após a coleta, sem perda da sua óptica e propriedades de fluorescência. Isso pode ser muito útil quando a caracterização de um grande número de amostras é necessária, tais como a amostragem de grandes estudos ou programas de Biomonitoramento, mas também pode fornecer uma quantidade substancial de informações em pequenos estudos exploratórios.

O protocolo apresentado baseia-se na análise do fluxo cytometric de biofilmes fototróficas (perifíton) coletado de diferentes locais de um fluxo. Muitos passos do protocolo, por exemplo, a seleção de locais adequados para fins de fiscalização, dependem os objetivos da pesquisa e, portanto, não podem ser prescritos. Outros permitem menos liberdade e exigem que o protocolo é seguido de perto, isto torna-se clara no Protocolo detalhado abaixo.

O protocolo começa com a seleção de sites para monitoramento ambiental baseado em biofilme. O próximo passo é configurar o citômetro de fluxo (FC), para que suas medidas permitem discriminação entre diferentes organismos fototróficas vivendo em biofilmes no ambiente monitorado. Isto é realizado através da recolha de amostras de biofilme de sites, identificando as propriedades fluorescentes de diferentes espécies presentes no biofilme e Configurando o citômetro de fluxo com lasers e filtros que permitem a medição com o apropriado óptica comprimentos de onda. Uma vez que o FC foi o set-up, os biofilmes podem ser coletadas de sites periodicamente, as propriedades ópticas e fluorescentes das partículas presentes no biofilme medida por citometria de fluxo e os dados analisados pelo visual de cluster única. Para melhor interpretação dos resultados, é possível construir uma base de referência FC de espécies locais de biofilme-vivo e seus fenótipos e usar o banco de dados para identificar diferentes taxonomias nos dados de FC. Validação é possível através de fluorescência-baseado classificação dos identificados aglomerados de células únicas usando FACS e baseado em microscopia identificação taxonômica das espécies presentes. Um esquema do protocolo é dada na Figura 1.

Protocolo

1. o ecossistema seleção e amostragem de biofilme

1. Selecione um ecossistema aquático de interesse e encontrar locais de amostragem, onde crescem biofilmes. Partes rasas de um riacho com lento ao fluxo de água médio e um leito rochoso para fixação de biofilme são adequadas^17,18.
2. Opcional: Se o site não tem suficiente superfícies para fixação do biofilme, ou para diminuir a variabilidade de biofilmes dentro de um site, coloque substratos artificiais para fixação de biofilme (por exemplo, lâminas de vidro, telhas cerâmicas) no site, garantindo que Eles são colocados na mesma direção em relação ao fluxo de água e profundidade semelhante e intensidade da luz¹⁹.
3. Para determinar as condições ambientais no local de amostragem, uso de instrumentos portáteis para medir a intensidade de luz, temperatura da água, condutividade, oxigênio e pH acima do superfície biofilme é a amostra de. Ao longo da amostragem, tome medidas repetidas (3 – 5) para calcular valores médios.
4. Opcional: Tirar amostras de água para determinar a causa da água parâmetros de química (dissolvido carbono orgânico (DOC), K⁺, Na⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Cl^–, F-, SO₄^{2 -}, PO₄^{2 -} , Não^2-₃, SiO₄^-4).
5. Usando luvas de proteção, colete pedras comparáveis (em tamanho, forma e tipo) de cada site (ou substratos artificiais). As pedras devem ser expostas ao fluxo semelhante e as condições de luz¹⁸.
6. Filtre água suficiente fluxo do site 0,22 μm filtros, para que fique pronto para todas as amostras coletadas (por exemplo, 15 mL, por exemplo).
7. Use uma escova macia para remover o biofilme de substrato para um balão (escova até todos biofilme é removido) com 15 mL de filtrado de fluxo de água²⁰.
8. Corrigi as amostras em 0,01% paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído²¹.

2. determinação dos parâmetros de fluxo ideal-cytometric (FC)

1. Transferência de subamostras para um microscópio de luz (usando um 40 X / 0,75 objetivo; se necessário use um objectivo de óleo de 100 × 1.3) e identificar as espécies presentes em amostras^22,23.
2. Única espécie de ordem identificado de coleções de cultura apropriado (por exemplo, a ficologia Experimental e coleção de cultura de algas na Universidade de Goettingen, [EPSAG] ou coleção de cultura de algas na Universidade de Colónia [CCAC] se monitoramento é realizado na centrais europeus ecossistemas).
3. Cresce a única espécie continuamente em condições ambientais semelhantes (por exemplo, luz, temperatura, pH) para o ambiente, que as amostras de biofilme foram retiradas. Ficar dentro de 1 ° C e 0,5 ponto de pH das amostras ambientais é recomendado.
4. Para desanexar/dispersar as células, colocar tubos de centrífuga de 15 mL de amostras da espécie única e colocar os tubos no centro de um banho de água e mergulhe, para que a superfície líquida da amostra no mesmo nível que a superfície da banheira. Proceda à sonicação amostras para 1 min a 45 kHz^24,25.
5. Grave os espectros de absorção e fluorescência da espécie única usando um leitor de placa. Refira por favor o leitor de placas de escolha para obter instruções. Neste exemplo, placas de polistirol transparente de fundo plano 96 poços foram carregadas com volume de amostra 200 µ l e a absorbância foi medida. (Configurações usadas: modo de varredura de fluorescência (a); passo de comprimento de onda de emissão tamanho 10 nm, emissão verificação número 30, largura de banda de 20 nm, ganho 100, 25 flashes, 20 e.u. modo de varredura de tempo ou a absorvância (b) integração; 25 flashes, largura de banda 9 nm).
6. Configurar o citômetro de fluxo com lasers, dicroicas divisores e filtros que, em combinação, cobrem todos os intervalos fluorescentes em que espécies diferentes têm propriedades específicas. Para fluxos europeus centrais, um 405 nm, 488 nm e 638 nm do laser produzem resultados úteis.
7. Ajuste a configuração de tensão da photomultipliers (não aplicável a todos os citômetros) e o intervalo das fluorescences medidos para incluir pelo menos 99% de todos os eventos das amostras.
8. Alternativamente, se o conhecimento sobre as espécies presentes em biofilmes a estiver disponível, inicie com passo 2.2. Se Propriedades fluorescentes são conhecidas, começa com passo 2.6.

3. opcional: Preparação de um banco de dados de referência de fluxo cytometric

Nota: FC não permite identificação taxonômica das células presentes no biofilme. Um banco de dados de referência das medições FC da única espécie conhecida de estar presentes em biofilmes, cultivadas em condições similares, como os biofilmes, pode ajudar com a interpretação dos dados.

1. Referência: única espécie
   1. Usando os parâmetros otimizados de FC criado em 2.5 – 7, medir as propriedades ópticas e fluorescentes de única espécie (fixo em paraformaldeído e glutaraldeído e filtrada através de filtros de tamanho apropriado para o citômetro de fluxo).
   2. Normalize os dados de uma única espécie, da mesma forma como os dados das biofilmes (consulte a etapa 6.1.2).
2. Referência: células danificadas e decadentes
   Um dos mais importantes indicadores de saúde de biofilme é a fração de células danificadas/morrendo presentes no biofilme. Para quantificar estas células, uma referência de decomposição de células pode ser preparada.
   1. Leve subamostras de 1ml de biofilmes diluídos e centrifugue-los à temperatura ambiente a 8.000 x g durante 10 minutos em um centrifugador do tabletop. Suspender o sedimento resultante em 1 mL de etanol a 90% e armazenar a suspensão durante a noite a 4 ° C. Repita no dia seguinte.
   2. Usando as configurações de FC otimizadas, medir as propriedades ópticas e fluorescentes das células danificadas e decadentes (fixos e filtrada).
3. Referência: microplastics
   Nota: se estiver interessado em monitoramento de partículas microplástico nos biofilmes, verifique se eles diferem bastante de partículas bióticas em óptica e propriedades de fluorescência para identificação.
   1. Suspender as partículas de microplástico de acordo com as instruções do produtor microplastics e medir suas propriedades ópticas e fluorescentes (usando parâmetros FC de 2.7).
   2. Adicionar as partículas de microplástico para a amostra de biofilme e deixar durante a noite a 4 ° C.
   3. Filtre a suspensão e a medida com os mesmos parâmetros FC como acima.

4. preparação e armazenamento da amostra

1. Uma vez que o FC foi criado e o banco de dados de referência FC está pronto, um pode prosseguir com a avaliação das amostras de biofilme fresco, recolhidos de acordo com as etapas 1.1 – 7. Para desanexar/dispersar o biofilme, transferi 15 mL das amostras dos frascos (ver passo 1.7) para tubos de centrífuga.
2. Coloque cada tubo no centro de um banho de água e mergulhe para que a superfície líquida da amostra no mesmo nível que a superfície da banheira. Proceda à sonicação amostras para 1 min a 45 kHz.
3. Corrigi as amostras em 0,01% paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído (estoque em água nanopure). Armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para análise.
4. Importante: Use metade das amostras para análise de citometria de fluxo e manter metade em armazenamento para segurança e validação opcional com fluorescência-ativado da pilha triagem e/ou microscopia de luz (ver secção 6).
   NOTE: armazenados na geladeira, as amostras de biofilme fixo devem manter suas propriedades óticas e fluorescentes por até três semanas.

5. executar a amostra através do FC

1. Se as amostras foram armazenadas na geladeira, proceda à sonicação-los rapidamente ou Pipetar várias vezes para separar as partículas. Filtro subamostras com 50 μm filtros (filtro tamanho depende da largura do FC capilar) antes de medir.
2. Carregar as amostras individuais (1 a 2 mL, isso depende o citômetro de fluxo usado) para o citômetro de fluxo e medir as propriedades ópticas e fluorescentes de cada partícula. Repita a medição três vezes por cada replicar biológica (três repetições técnicas).
3. Exporte os dados do FC em formato CSV.

6. dados preparação e análise de correlação

FC pode analisar diversos parâmetros (por exemplo, área do sinal, altura, largura) para cada intervalo de fluorescência e medida Propriedade ótica. Executar uma análise de correlação das variáveis de medida e manter apenas aquelas medidas que não são altamente correlacionadas. Isso geralmente remove todos, mas um parâmetro FC (por exemplo, área de sinal) e pode também remover altamente correlacionados medições fluorescentes (geralmente decorrentes do mesmo laser e vizinhos filtros).

1. Execute CYT como uma caixa de ferramentas no Matlab:
   1. Replica os dados de importação do FC reduzida em formato CSV de todas as amostras que devem ser analisados para o CYT software¹⁶, incluindo todos os técnicos e biológicos. (Clique +, arquivo filtro *. csv, selecione arquivos de importação).
   2. Transforme os canais fluorescentes das amostras usando a transformação arco seno hiperbólico. O valor do cofactor precisa ser selecionado; 150 obras para mais fototróficas biofilmes e citômetros, mas otimização podem ser necessárias para configurações experimentais particulares e biofilmes heterotróficos. (Right-Click/Transform/digite cofator 150)
   3. Para controle de qualidade, compare visualmente (na CYT) os histogramas de amostras individuais e canais individuais de ópticas e fluorescentes para certificar-se que existem sem outliers a nível técnico e biológico de replicação. Outliers se manifestará nas distribuições fluorescente/óptica significativamente deslocadas entre as repetições. (Selecione o plano de dados, selecione canal)
      1. Alternativa: executar uma análise de componentes principais (PCA) sobre os valores medianos de distribuições fluorescentes e certifique-se que técnicas e biológicas repetições cluster juntos.
   4. Mesclar o técnico Replica em cada replicar biológica e subamostra que Replica o biológico, para que cada um é representado pelo mesmo número de partículas (células, fragmento de célula e abióticas partículas) e para que o número total de partículas analisadas pelo Barnes-cabana estocástico vizinho incorporação (bh-PND) é cerca de 150.000 (para melhor visualização resultados²⁶). (Selecione a mesclagem de dados, botão direito do mouse, / subamostra)
   5. Para comparação entre as amostras, é importante selecionar somente as amostras que devem ser comparados. Selecione as amostras e executar bh-PND²⁷. Uma vez que o algoritmo é terminados, novos canais, nomeado SNE1-bh e bh-SNE2 aparecem. Estas são as coordenadas do PND de todas as partículas analisadas, que podem ser usadas para visualizar os dados em um gráfico de dispersão (mapa viSNE). (Selecionar dados, selecionar canais, botão direito do mouse, bh-PND, sim de dados normalizados)
   6. No mapa de viSNE, partículas são posicionadas de acordo com a similaridade e agrupadas em clusters visualmente separáveis. Inspecione as propriedades ópticas/fluorescente dos aglomerados e marca e nome aqueles que são bem separadas e têm propriedades diferentes óptica/fluorescência usando as ferramentas de desenho disponíveis na CYT. (Selecione canal bh-SNE1, bh-SNE2)
   7. Opcional: Se um banco de dados de referência da única espécie microbiana (medido com a mesma configuração de citometria de fluxo e cultivadas em condições similares!) está disponível, exportar os mapas viSNE em Matlab e do projeto do banco de dados de referência para os mapas. Desta forma, clusters de particulares podem ser conectados aos grupos taxonômicos/espécie particular (scripts disponíveis para download em https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sessão/salvar)
   8. Solução de problemas: Se a análise de bh-PND não retornar conjuntos visualmente separáveis, mas um grande, muitas partículas foram usadas em bh-PND. Tente novamente com menos partículas por amostra. Se não houver nenhum aglomerados, mas bastante escassos pontos individuais, aumente o número de partículas usado.
2. Opcional: Em vez de depender de bh-PND para o clustering, outros métodos de clusters (por exemplo, hierárquico, baseado no centroide ou densidade à base de clustering) podem ser usados nos dados normalizados e então sobrepostos no mapa viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
3. Uma vez que os clusters foram identificados, conte o número de partículas em cada cluster pertencentes a cada biológico replicar em cada amostra. Avaliar as diferenças entre as amostras, utilizando o teste ANOVA e Tukey com apropriado (por exemplo, Holmes) correção para comparação múltipla.

7. opcional: Validação de Cluster interpretação usando a classificação de fluorescência-ativado da pilha

1. Uma vez que os clusters foram identificados, use fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação para classificá-los fora das amostras, se desejado, desde que o FACS tem uma configuração semelhante (ou idêntica) de lasers e filtros fluorescentes.
2. Para cada cluster identificado, CYT fornece portas ópticas e fluorescentes que definem o cluster. Use estes portões para classificar para fora as partículas em cada cluster com o FACS e então identificar as células classificadas utilizando microscopia de luz.

Resultados

Usando o procedimento aqui apresentado (Figura 1), foram analisadas amostras retiradas de vários sites de um córrego local na Suíça. Em cada local, três pedras de tamanhos similares (10 a 12 cm) foram tiradas, e biofilmes foram rebateu as pedras. As amostras foram então lisadosm, fixo, filtrada e posteriormente analisaram por citometria de fluxo. A configuração do citômetro de fluxo e banco de dados de referência utilizados foram os mesmos conforme ...

Discussão

O protocolo descrito acima é relativamente simples de implementar. No entanto, enquanto as configurações padrão apresentados foram mostradas para ser apropriado para todos fototróficas biofilme testado até agora, otimização (conforme descrito no protocolo) é necessária para maximizar as informações obtidas com o método. Com efeito, as propriedades ópticas e fluorescentes de biofilmes podem variar, dependendo de condições ambientais (temporada, temperatura, composição química da água)^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data