Характеристика водных биоплёнки с проточной цитометрии

Проточная цитометрия в сочетании с визуального кластеризации предлагает простой в использовании и быстрый метод для изучения водных биопленки. Он может использоваться для определения характеристик биопленки, обнаружения изменений в структуре сообществ биопленки и абиотических частиц, встроенных в биопленки.

Аннотация

Биоплёнки являются динамические консорциумов микроорганизмов, которые играют ключевую роль в пресноводных экосистемах. Путем изменения их структуры сообщества, биоплёнки быстро реагировать на экологические изменения и таким образом может использоваться как показатели качества воды. В настоящее время оценки биопленки основана главным образом на комплексный и функциональный конечных точек, например фотосинтетической или дыхательной деятельности, которые не предоставляют информацию о структуре сообщества биопленки. Проточной цитометрии и вычислительной визуализации предлагают альтернативных, конфиденциальные и easy-to-use метод для оценки состава сообщества, особенно в фотоавтотрофная части пресноводных биопленки. Он требует только основные пробоподготовки, после чего весь образец выполняется через проточный цитометр. Одноклеточных оптических и флуоресцентные информация используется для компьютерной визуализации и биологическая интерпретация. Его основные преимущества перед другими методами являются скорость анализа и высоким содержанием информации природы. Проточной цитометрии предоставляет информацию о нескольких сотовых и биопленки черты в одном измерении: размер частиц, плотность, содержание пигмента, абиотические содержание в биопленки и грубый таксономической информации. Однако он не представить информацию о составе биопленки на уровне видов. Мы видим большой потенциал в использовании метода для мониторинга окружающей среды водных экосистем и как оценку первоначальных биопленки шаг, который информирует вниз по течению подробные расследования дополнительные и более подробные методами.

Введение

Биоплёнки являются динамические консорциумов микроорганизмов, которые играют ключевую роль в пресноводных экосистемах, начиная от первичного производства, питательных и очистки воды для влияния на распределение микроорганизмов и их биоразнообразия в экосистеме ¹. когда биоплёнки подвергаются к изменяющимся условиям окружающей среды или на раздражители, такие как химических веществ, их структуры сообщества быстро переходит к более терпимым видов²^,³. Их высокая чувствительность превращается биопленки в привлекательные модели систем для экологического мониторинга⁴, однако ни один из нынешних методов идеально подходит для фактически проследить динамику биопленки сообщества в быстрый и легкий путь.

Часто используемый набор методов для описания биоплёнки состоит из измерения функциональных и структурных конечных точек. На уровне всего сообщества активность фотосинтеза и дыхания, а также активность внеклеточных ферментов содержит информацию о функционального состояния биопленки⁵^,⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹. Накопление биомассы используется в качестве индикатора для общего роста биопленки. Структурные изменения в настоящее время измеряются, либо с помощью идентификации традиционных видов световой микроскопии или с нуклеотидом-методов (например, денатурации градиента гель-электрофорез (DGGE), автоматизированные рибосомных intergenic прокладку анализ (ARISA), метагеномики)¹⁰^,^,¹¹¹². Эти методы предоставляют информацию, но много времени для выполнения, или требуют специальных знаний или находятся в стадии разработки. Наконец новые методы для оценки внеклеточного полимерных веществ (EPS)¹³^,¹⁴ и биопленки архитектура¹, тогда как чувствительных, низкой пропускной способностью и еще не были разработаны к мониторинга целей.

Очевидно, что для полной характеристики пресноводных биопленки, это необходимо объединить несколько различных методов, которые обеспечивают понимание биопленки функции, состав и архитектуры. Для мониторинга окружающей среды, с другой стороны, метод быстрый и чувствительной, который способен обнаружить изменения в биопленки и включить основные биологические интерпретации сдвигов на уровне функциональных и структурных не требуется.

Мы разработали новый метод для определения характеристик микробных фототрофных компонента потока биоплёнки (перифитон), которая достаточно быстро для целей мониторинга и в то же время обеспечивает достаточную информацию о биопленки сообщества структура, позволяющая биологическая интерпретация¹⁵. Она основана на одной ячейки проточной цитометрии (FC) образцов биопленки и в сочетании с компьютерной визуализации и предоставляет информацию о оптические и флуоресцентные свойства биопленки на уровне одной ячейки.

Рабочий процесс после выборки биопленки состоит из подготовки проб в виде sonication, фиксация и размер-фильтрацию на основе образцов, следуют оценки выборки подачей cytometry. Полученные данные представить информацию о нескольких сотовых черты в одном измерении: размер частиц, плотность, содержание пигмента, абиотические содержание (например , частицы) биопленки. Этот набор данных не проанализированы через вычислительной визуализации с помощью визуальных стохастических соседа, встраивание (viSNE)¹⁶, который позволяет быстро и легко интерпретации данных. Хотя несколько недель требуются для настройки и оптимизации метода, после установки, он занимает всего несколько часов от сбора проб биопленки для интерпретации результатов.

Основные преимущества метода представленные над другими являются скорость анализа и высоким содержанием информации. Кроме того образцы можно хранить в течение нескольких недель после сбора без потери их оптических и флуоресценции свойства. Это может быть очень полезно, когда характеристика большое количество образцов не требуется, например большие выборки исследования или программы биомониторинга, но также может обеспечить значительное количество информации в небольших разведочных исследований.

Представленные протокол основывается на анализе потока гранулярных фототрофных биоплёнки (перифитон), собранных из разных мест потока. Многие действия протокола, например выбор мест для целей контроля зависит от целей исследования и поэтому не может быть предписано. Другие позволяют меньше свободы и требуют что внимательно следил за протокол, это стало ясно в протоколе подробно ниже.

Протокол начинается с выбора участков для мониторинга окружающей среды на основе биопленки. Следующий шаг заключается в настройке проточный цитометр (FC) таким образом, чтобы его размеры позволяют дискриминации между различными фототрофных организмы, живущие в биопленки в контролируемых условиях. Это осуществляется путем сбора образцов биопленки от сайтов, выявления флуоресцентные свойства различных видов в биопленки и Настройка потока цитометр с лазерами и фильтров, позволяющих измерение на соответствующие оптические длин волн. После установки, ФК биоплёнки может быть собраны из сайты периодически, оптические и флуоресцентные свойства единого частиц, присутствующих в биопленки, измеряется проточной цитометрии и данные анализируются визуального кластеризации. За лучшую интерпретацию результатов можно построить ФК справочной базы данных видов местных биопленки жизни и их фенотипы и использовать базу данных для выявления различных классификаций в ФК данных. Проверка возможна через флуоресценции-сортировка на основе выявленных кластеров одиночных клеток с помощью СУИМ и микроскопии основанные таксономической идентификации видов настоящего. На рисунке 1приводится схема протокола.

протокол

1. Выбор экосистемы и биопленки выборки

Выберите водной экосистемы интерес и найти участков отбора проб, где растут биопленки. Мелкие части потока с медленно среднего стока и каменистые русла биопленки вложения являются соответствующие¹⁷^,¹⁸.
Необязательно: Если сайт не имеет достаточно поверхности биопленки вложения, или уменьшить биоплёнки изменчивости в пределах сайта, место искусственных субстратов для биопленки вложения (например стекла слайды, керамическая плитка) на сайт, а убедившись, что они находятся в том же направлении, что касается потока воды и на аналогичных глубину и интенсивность света¹⁹.
Для определения экологических условий на участке отбора проб, использование переносных инструментов для измерения интенсивности света, температуры воды, проводимость, кислорода и pH прямо над поверхности биопленки должна отбираться из. В течение выборки принимать неоднократные меры (3 – 5) для вычисления среднего значения.
Дополнительно: Взять пробы воды с целью определения соответствующих параметров химии воды (растворенного органического углерода (Роу), K⁺⁺Na, Ca^{2 +}, мг^{2 +}, Cl^–, F-, т₄^{2 -}, PO₄^{2 -}, Нет₃^{2 -},₄SiO^{4 -}).
Использовать защитные перчатки, соберите сопоставимые камни (размер, форма и тип) от каждого сайта (или искусственных субстратов). Камни должны подвергаться аналогичные потока и условий освещения¹⁸.
Фильтр достаточно поток воды с сайта через 0,22 мкм фильтры, так что она готова для всех собранных образцов (например, 15 мл на сэмпл).
Использование мягкой зубной щеткой для удаления биопленки от субстрата в колбу (кисти до тех пор, пока все биопленки удаляется) с 15 мл отфильтрованных поток воды²⁰.
Исправьте образцы в 0.01% параформальдегида и 0,1% глютаральдегид²¹.

2. Определение параметров для оптимального потока гранулярных (FC)

Передавать световой микроскоп проб (с использованием 40 X / 0,75 цели; если необходимо использовать цель масло 100 × 1.3) и идентификации видов в образцы²²^,²³.
Определены порядок отдельных видов из соответствующей культуры коллекций (например экспериментальной Альгология и культуры сбора водорослей в Университет Goettingen [EPSAG] или водорослей культуры коллекции в кельнском университете [CCAC] Если Мониторинг осуществляется в экосистем Центральной Европы).
Растут моновидовые непрерывно в аналогичных экологических условиях (например, свет, температура, рН) в окружающую среду, которую биопленки образцы были взяты из. Оставаясь в пределах 1 ° C и 0,5 рН точку из проб окружающей среды рекомендуется.
Разойтись отсоединить/клетки, вставьте пробирок 15мл одного вида образцов и положить трубы в центре на водяной бане и погружаться, так что поверхности жидкого образца на том же уровне, как на поверхность ванны. Sonicate образцы для 1 мин в 45 кГц²⁴^,²⁵.
Запишите спектры поглощения и флуоресценции одного вида с помощью пластины читателя. Пожалуйста, обратитесь к плита читателя выбора для инструкций. В этом примере 96-луночных плоское дно прозрачный полистирол пластины были загружены с 200 мкл пример тома и поглощения была измерена. (Используются параметры: режим сканирования () флуоресценции; шаг волны выбросов размер 10 Нм, выбросов сканирования номер 30, полоса пропускания 20 Нм, получить 100, 25 вспышек, 20 США интеграции время или (b) оптической плотности сканирования режим; 25 вспышек, пропускной способности 9 Нм).
Настройка проточный цитометр с лазерами, дихроичных сплиттеры и фильтры, которые в сочетании охватывают все эти люминесцентные диапазонов, в которых различные виды имеют специфические свойства. Для Центральной Европы потоков, 405 нм, 488 нм и 638 Нм лазер принести полезные результаты.
Отрегулируйте настройки напряжения photomultipliers (не применимо для всех потоков цитофлуориметрами) и диапазон измеряемых fluorescences включить по крайней мере 99% всех событий образцов.
В качестве альтернативы если знания о видах в биопленке доступен, начните с шага 2.2. Если известны флуоресцентные свойства, начните с шага 2.6.

3. Дополнительно: Подготовка потока гранулярных справочной базы данных

Примечание: ФК не допускает таксономической идентификации клеток в биопленки. Справочной базы данных измерений ФК отдельных видов известно присутствовать в биопленки, выращенных в аналогичных условиях как биопленки, может помочь в интерпретации данных.

Ссылка: один вид
1. С помощью оптимизируемых параметров ФК в 2,5-7, измеряют оптические и флуоресцентные свойства отдельных видов (исправлено в низкотемпературном растворе глютаральдегида и параформальдегида и фильтруют через фильтры соответствующего размера для проточный цитометр).
2. Нормализовать данные из одного вида в так же, как данные из биоплёнки (см. шаг 6.1.2).
Ссылка: поврежденные и разрушающимися клеток
Одним из наиболее важных показателей здоровья биопленки представляет собой долю поврежденных умирающих клеток биопленки. Для количественной оценки этих клеток, может быть подготовлен справочник распадаясь клетки.
1. Возьмите 1 мл проб разреженных биоплёнки и центрифуги их при комнатной температуре на 8000 x g 10 минут в настольной центрифуги. Приостановить результате гранулы в 1 мл 90% этанола и хранить подвеска на ночь при 4 ° C. Повторите на следующий день.
2. Используя оптимизированные настройки ФК, измеряют оптические и флуоресцентные свойства поврежденных и разрушающимися клеток (фиксированной и фильтрация).
Ссылка: частицы
Примечание: если вы заинтересованы в мониторинге микропластика частиц в биопленке, проверить ли они достаточно отличаются от биотических частиц в оптических и флуоресценции свойства для идентификации.
1. Приостановить микропластика частицы согласно инструкциям производителя частицы и измерить их оптические и флуоресцентные свойства (с помощью параметров ФК от 2.7).
2. Добавить микропластика частиц в образце биопленки и оставить на ночь при 4 ° C.
3. Фильтр, подвеска и меру с теми же параметрами ФК как выше.

4. Образец подготовки и хранения

После того, как был создан ФК и ФК справочной базы данных готова, можно исходить с оценкой свежие биопленки образцов, собранных согласно шаги 1.1 – 7. Чтобы отсоединить/разогнать биопленки, передача 15 мл образцов от колбы (см. шаг 1.7) в пробирок.
Поместите каждую пробирку в центре на водяной бане и погрузите таким образом, чтобы поверхности жидкого образца на том же уровне, как на поверхность ванны. Sonicate образцы для 1 мин на 45 кГц.
Исправьте образцы в 0.01% параформальдегида и 0,1% глутаровый (сток в nanopure воды). Хранить при 4 ° С до готовности для анализа.
Важно: Использовать половину образцов для анализа проточной цитометрии и сохранить половину в хранилище для безопасности и проверки факультативных с сортировки активирован флуоресценции клеток и/или световой микроскопии (см. раздел 6).
Обратите внимание,: хранится в холодильнике, фиксированной биопленки образцы должны держать их оптические и флуоресцентные свойства до трех недель.

5. Запуск образца через FC

Если образцы хранились в холодильнике, sonicate их быстро или Пипетка несколько раз для разделения частиц. Фильтрации проб с 50 мкм фильтрами (размер фильтра зависит от ширины ФК капилляра) перед началом измерения.
Загрузить отдельные образцы (1-2 мл, это зависит от проточный цитометр используется) в проточный цитометр и измеряют оптические и флуоресцентные свойства каждой частицы. Повторите измерение в три раза за каждый биологических репликации (три технических репликация).
Экспорт данных из ФК в формате .csv.

6. Подготовка и данных корреляционный анализ

FC можно анализировать несколько параметров (например, сигнал площадь, высота, ширина) для каждой измеренной оптические свойства и диапазон флуоресценции. Запустить анализ корреляции на измеряемых переменных и хранить только те измерения, которые не соотносятся высоко. Это обычно удаляет все, но один параметр ФК (например, сигнал район), и может также удалить высоко коррелируют флуоресцентные измерения (обычно вытекающие из же лазер и соседних фильтры).

Запустите CYT как набор инструментов в Matlab:
1. Реплицирует импорта снижение ФК данных в формате CSV из всех образцов, которые должны быть проанализированы в CYT программного обеспечения¹⁶, включая все технические и биологические. (Нажмите кнопку +, *.csv файл фильтра, выберите файлы для импорта).
2. Трансформировать флуоресцентные каналы всех образцов, используя преобразование гиперболический арксинус. Значение кофактор должен быть выбран; 150 работ для наиболее фототрофных биопленки и цитофлуориметрами потока, но оптимизация может быть необходимо для конкретных экспериментальных установок и гетеротрофных биопленки. (Справа-мыши/преобразование/введите кофактор 150)
3. Для контроля качества визуально сравните (CYT) гистограммы отдельных образцов и отдельных каналов оптических и флуоресцентные чтобы убедиться, что есть без выбросов на уровне технического и биологического репликации. Нетипичные будет проявляться в значительно смещенные флуоресцентный/оптический распределения между реплицирует. (Выберите данные, выберите канал, участок)
  1. Альтернатива: запустить анализ главных компонент (СПС) на медианные значения флуоресцентные распределений и убедитесь, что технические и биологические реплицирует кластера вместе.
4. Объединить технические реплицирует в каждом биологических реплицировать и подвыборки биологических реплицирует, так что каждый представлен такое же количество частиц (клетки, клетки фрагмент и абиотических частицы) и таким образом, чтобы общее количество частиц анализируемой Стохастические сосед Барнс-Хата встраивания (bh СНЭ) — около 150000 (за лучший визуализации результатов²⁶). (Выбор данных, щелкните правой кнопкой мыши, слияния/подвыборки)
5. Для сравнения между образцами важно выбрать только те образцы, которые необходимо сравнить. Выберите образцы и запустить bh СНЭ²⁷. После того, как алгоритм является готовой, новые каналы, именованные bh-SNE1 и bh-SNE2 появляются. Это СНЭ координаты всех проанализированных частиц, которые могут быть использованы для визуализации данных в точечной (viSNE карту). (Выберите данные, выберите каналы, щелкните правой кнопкой мыши, bh СНЭ, да нормализованных данных)
6. В viSNE карте частицы располагаются согласно подобия и группируются в кластеры, визуально разделяемые. Проверьте свойства оптических/флуоресцентный кластеры и Марка и имя тех, которые хорошо отделены и имеют различные оптические/флюоресценцию свойства с помощью инструментов рисования в CYT. (Выберите канал bh-SNE1, bh-SNE2)
7. Необязательно: Если справочной базы данных видов Одноместный микробной (измеряется с один и тот же параметр проточной цитометрии и выросла в аналогичных условиях!), экспорт viSNE карт в Matlab и проецировать в справочную базу данных на карты. Таким образом особое кластеров может подключаться к конкретных видов/таксономических групп (скриптов, доступных для загрузки на https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Сессии/сохранить)
8. Устранение неполадок: Если анализ bh СНЭ не возвращает визуально отделимые кластеры, но один большой, слишком много частиц были использованы в СНЭ bh. Повторите попытку с меньшим количеством частиц на сэмпл. Если есть нет кластеры, но довольно редкой отдельных точек, увеличьте количество частиц используется.
Опционально: Вместо того чтобы полагаться на bh СНЭ для кластеризации, другие методы кластеризации (например, иерархические, основанный на центроид или плотности на базе кластеризации) могут быть использованы на нормализованных данных и затем накладывается на viSNE карте (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
После того, как были определены кластеры, подсчитать количество частиц в каждом кластере, принадлежащие каждой биологических репликации в каждом образце. Оценить различия между образцами, с помощью теста ANOVA и Тьюки с соответствующим (например, Холмс) коррекция для нескольких сравнения.

7. Дополнительно: Проверка интерпретации кластера с помощью сортировки активирован флуоресценции клеток

После того, как были определены кластеры, используйте активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) для сортировки их из образцов, при желании, условии, что СУИМ имеет аналогичные (или идентичных) конфигурацию лазеры и флуоресцентных фильтров.
Для каждого кластера, выявленных CYT обеспечивает оптические и флуоресцентные ворота, определяющие кластер. Используйте эти ворота разобраться частицы в каждом кластере с СУИМ и затем определить сортировки клеток с использованием световой микроскопии.

Результаты

С помощью процедуры, представленные здесь (рис. 1), были проанализированы образцы, взятые из нескольких сайтов местных потока в Швейцарии. На каждом сайте были приняты три аналогичных размеров камней (10-12 см), и биоплёнки были щеткой камни. Образцы были за...

Обсуждение

Протокол, в описанный выше относительно просто реализовать. Однако в то время как параметры представлены по умолчанию было показано, чтобы быть пригодным для всех фототрофных биопленки, испытаны до настоящего времени, оптимизация (как описано в протоколе) необходимо максимизировать и?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Представленная работа была поддержана SNF Ambizione стипендий (PZ00P2_142533) и Velux исследовательский грант (Amplebig). Мы хотели бы поблагодарить Bettina Вагнера за помощь с экспериментальной работы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 151410 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data