Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

요약

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

초록

Biofilms는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄. 그들의 사회 구조를 바꾸어 서, biofilms 환경 변화에 신속 하 게 대응 하 고 따라서 수 질의 지표로 사용할 수 있습니다. 현재, biofilm 평가 주로 기반으로 통합 및 기능 끝점, 광합성 이나 호흡 활동, biofilm 커뮤니티 구조에 정보를 제공 하지 않습니다를 합니다. Cytometry 및 전산 시각화 커뮤니티 구성, 특히 민물 biofilms의 photoautotrophic 부분에 대 한 평가 대 한 대안, 민감한, 그리고 사용 하기 쉬운 메서드를 제공합니다. 전체 샘플 교류 cytometer 통해 실행 후 기본 샘플 준비를 필요 합니다. 단일 셀 광과 형광 정보 전산 시각화 및 생물 학적 해석에 사용 됩니다. 다른 방법에 비해 주요 장점을 분석 하 고이 정보 콘텐츠 자연의 속도. Cytometry 단일 측정에 여러 휴대 및 biofilm 특성에 정보를 제공 합니다: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠, biofilm, 및 거친 분류학 정보 abiotic 콘텐츠. 그러나, 그것은 종 수준에 biofilm 구성에 정보를 제공 하지 않습니다. 우리 수생 생태계의 환경 모니터링을 위한 방법의 사용에서 높은 잠재력을 하류 알리는 단계 초기 biofilm 평가로 보완 하 고 더 상세한 방법으로 조사를 상세한.

서문

Biofilms는 미생물 및 생태계의 생물 다양성의 분포에 영향을 미치는 주요 생산, 영양소 사이클링, 및 물 정화에서 이르는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄 ¹. biofilms는 변화 하는 환경 조건 또는 화학 물질, 같은 스트레스에 노출 되 면 그들의 지역 사회 구조 신속 하 게 더 관대 종^2,3쪽으로 이동. 그러나 그들의 높은 감도 현재 방법의 아무도 완벽 하 게 실제로 biofilm 커뮤니티의 동적을 추적 하는 빠르고 쉬운 방법에 적합 한 biofilms 환경 모니터링⁴, 매력적인 모델 시스템으로 변합니다.

기능과 구조 끝점의 측정 biofilms 하 방법의 일반적으로 사용 되 세트에 의하여 이루어져 있다. 전체 사회의 수준에서 광합성 및 호흡 활동 뿐만 아니라 세포 외 효소의 활동 정보를 제공 합니다 biofilm^{5,6,7,8의 기능 상태에 ,9}. 바이오 매스 계산 전체 biofilm 성장 표시기로 사용 됩니다. 구조적인 변화는 현재 가벼운 현미경 검사 법 또는 뉴클레오티드 기반 기술 (예를 들어, 그라데이션 젤 전기 이동 법 (DGGE), 자동화 된 ribosomal intergenic 스페이서를 변성 시키기 전통적인 종 식별을 사용 하 여 측정 분석 (아리사) metagenomics)^10,,1112. 이러한 방법 정보를 제공 하지만 수행, 또는 특정 지식이 필요로 수 있습니다 또는 아직 개발 중인. 마지막으로, 세포 외 고분자 물질 (EPS)^13,14 와 biofilm 건축¹을 민감한, 동안 평가 대 한 새로운 방법을 낮은 처리량 고 쪽으로 아직 개발 하지 않은 목적을 모니터링합니다.

민물 biofilms의 완전 한 특성, 그것은 biofilm 기능, 구성 및 아키텍처에 대 한 통찰력을 제공 하는 여러 가지 다른 방법을 결합 하는 데 필요한 것이 분명 하다. 환경 모니터링, 다른 한편으로는 biofilm에서 변화를 감지 하 여 설정 기능 및 구조적 수준에서 교대의 기본적인 생물 학적 해석 수 있는 신속 하 고 중요 한 방법이 필요 합니다.

우리 스트림 biofilms (periphyton), 목적, 모니터링을 위한 충분히 빠른 이며 동시에 biofilm 커뮤니티에 충분 한 정보를 제공 한다 광합성의 미생물 지역 사회 특성에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다. 생물 학적 해석¹⁵수 있도록 구조입니다. 그것은 단일 셀 cytometry (FC) biofilm 샘플에 기반 하 고 전산 시각화 함께 단일 셀 수준에 biofilm의 광과 형광 속성에 정보를 제공 합니다.

Biofilm 샘플링 후 워크플로 샘플 준비 쥡니다, 고정, cytometry에 의해 샘플을 평가 하 여 다음 샘플의 크기 기반 필터링의 형태로 이루어져 있다. 단일 측정에 여러 세포 특성에 정보를 제공 하는 인수 데이터: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠는 biofilm에서 비 생물 적인 콘텐츠 (예: microplastics). 데이터의이 세트는 보다 시각적 확률적 이웃 (viSNE)¹⁶, 데이터의 신속 하 고 쉽게 해석 가능 하 게 포함을 사용 하 여 계산 시각화를 통해 분석. 몇 주를 설정 하 고 메서드를 최적화 하는 데 필요한 있지만 한번 설정 하 고, 결과 해석 하는 biofilm 샘플 수집에서 단 몇 시간 걸리는.

다른 사람 제시 방법의 주요 장점은 속도 분석 및이 정보 콘텐츠는. 또한, 샘플의 그들의 광 손실 및 형광 속성 없이 컬렉션 후 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 샘플의 많은 수의 큰 샘플링 연구 등 biomonitoring 프로그램 필요 하지만 상당한 양의 작은 예비 연구에 정보를 제공할 수 있습니다 때이 매우 유용할 수 있습니다.

제시 프로토콜 스트림의 다른 위치에서 수집 된 광합성 biofilms (periphyton)의 흐름-cytometric 분석을 기반으로 합니다. 프로토콜, 예를 들면 목적, 모니터링에 대 한 적절 한 사이트의 선택의 많은 단계 연구의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 그러므로 처방 될 수 없습니다. 다른 더 적은 자유를 허용 하 고 필요한 프로토콜은 밀접 하 게 뒤에, 상세한 프로토콜 아래에서 분명히 만든.

프로토콜은 biofilm 기반 환경 모니터링에 대 한 사이트의 선택과 시작합니다. 다음 단계는 set-up 교류 cytometer (FC)의 측정 사용 모니터링된 환경에서 biofilms에 살고 다른 광합성 유기 체 사이 차별. 이 사이트를 식별 하는 다른 종에 존재 하는 biofilm 고 교류 cytometer 레이저와 광학에 적절 한 측정을 사용할 수 있는 필터 설정의 형광 속성에서 biofilm 샘플을 수집 하 여 수행 됩니다. 파장입니다. Biofilms 수 FC 설정 후 사이트에서 주기적으로, cytometry에 의해 측정 하는 biofilm 및 시각적 클러스터링 분석 데이터에 단일 입자의 광학 및 형광 재산 수집. 결과의 더 나은 해석에 대 한 로컬 biofilm 살아있는 종의 FC 참조 데이터베이스 및 그들의 고기를 빌드하고 FC 데이터에서 다른 분류를 식별 하는 데이터베이스를 사용 가능 하다. 유효성 검사 FACS 및 현재 종의 분류학 식별 현미경-기반을 사용 하 여 단일 셀의 확인 된 클러스터의 정렬 형광 기반을 통해 가능 하다. 프로토콜의 회로도 그림 1에서 주어진 다.

프로토콜

1. 생태계 선택 및 Biofilm 샘플링

1. 관심의 수생 생태계를 선택 하 고 샘플링 사이트 biofilms 성장. 얕은 부분으로 스트림의 중간 물 흐름을 느리게 그리고 돌 streambed biofilm 첨부 파일에 대 한 적절 한^17,18.
2. 옵션: 없으면 사이트 충분 한 표면에 biofilm 첨부 파일에 대 한 또는 사이트 내에서 biofilms 가변성을 감소, biofilm 첨부 파일 (예: 유리 슬라이드, 세라믹 타일)에 대 한 인공 기판에 배치 사이트 있는지 하는 동안 그들은 물의 흐름에 관하여와 비슷한 깊이 빛의 강도¹⁹에서 같은 방향으로 배치 됩니다.
3. 샘플링 사이트, 빛의 강도 측정을 사용 하 여 휴대용 기기에서 환경 조건을 확인 하려면 물 온도, 전도도, 산소와 pH 표면 biofilm 바로 위에 샘플링입니다. 샘플링의 과정을 통해 조치를 반복 (3-5) 평균값을 계산 하려면.
4. 선택 사항: 관련 확인 받아 물 샘플 물 화학 매개 변수 (녹은 유기 탄소 (DOC), K⁺Na⁺, 캘리포니아^{2 +}, 마그네슘^{2 +}, Cl^-, F-, SO₄^2-, PO₄^2- , 아니₃^2-, SiO₄^4-).
5. 보호 장갑에 사용 하 여, 각 사이트 (또는 인공 기판)에서 유사한 돌 (크기, 모양, 및 형식)를 수집 합니다. 돌 비슷한 흐름을 조명 조건¹⁸노출 되어야 합니다.
6. 것 (예를 들어, 샘플 당 15 mL) 모든 수집 된 샘플에 대 한 준비 사이트에서 충분 한 스트림 물의 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
7. 부드러운 칫 솔을 사용 하 여 필터링 된 스트림 물²⁰의 15 mL로 플라스 크 (브러쉬 모든 biofilm 제거 될 때까지)에 biofilm 기판에서 제거.
8. 0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글²¹에 샘플을 수정.

2. 최적의 흐름-cytometric (FC) 매개 변수 결정

1. 가벼운 현미경을 하위 전송 (40 / 0.75 X를 사용 하 여 목표; 필요한 100 × 1.3 오일 목표를 사용 하 여) 종 샘플^22,23에 확인.
2. 주문 확인 적절 한 문화 컬렉션에서 단일 종 (예: 실험 조류학 및 Goettingen의 대학 [EPSAG]에 조류의 문화 컬렉션 또는 [CCAC] 쾰른 대학에서 문화 조류 컬렉션의 경우 모니터링 수행 됩니다 중앙 유럽 생태계에).
3. Biofilm 샘플에서 찍은 환경에 단일 종 비슷한 환경 조건 (예: 빛, 온도, pH)에서 지속적으로 성장. 1 ° C와 0.5 내 환경 샘플에서 pH 포인트는 것이 좋습니다.
4. 분리/분산 셀, 원심 분리기 튜브 단일 종 샘플의 15 mL를 넣고 하 고 물 욕조의 센터에 튜브를 넣어 잠수함, 그 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준. 45 kHz^24,25에서 1 분 샘플 sonicate
5. 플레이트 리더를 사용 하 여 단일 종의 흡 광도 및 형광 스펙트럼을 기록 합니다. 지침에 대 한 선택의 플레이트 리더를 참조 하십시오. 이 예제에서는에서 96 잘 플랫 바닥 투명 polystyrol 접시 200 µ L 샘플 볼륨으로 로드 하 고 흡 광도 측정 했다. (사용 되는 설정: (a) 형광 스캔 모드; 방출 파장 단계 10 nm, 방출 스캔 번호 30, 대역폭 20 nm 크기, 100, 25 섬광, 20 미국 통합 시간 또는 흡 광도 (b) 스캔 모드; 25 섬광, 대역폭 9 nm).
6. 레이저, dichroic 스플리터와 필터를 조합에 다른 종 특정 속성을가지고 있는 모든 그 형광 범위를 커버 흐름 cytometer를 설정 합니다. 중앙 유럽 스트림에서 405 nm, 488 nm 및 638 nm 레이저 유용한 결과 얻을.
7. Photomultipliers (모든 교류 cytometers은 적용 되지 않음)의 전압 설정 및 측정된 fluorescences의 범위는 샘플의 모든 이벤트의 99% 이상 포함 하도록 조정 합니다.
8. 또는, 종은 biofilms에 존재에 대 한 지식을 사용할 수 있는 경우 단계 2.2 시작. 형광 속성 알고 있는 단계 2.6 시작 합니다.

3. 선택 사항: 흐름 cytometric 참조 데이터베이스 준비

참고: FC는 biofilm에 셀의 분류학 id를 허용 하지 않습니다. Biofilms로 유사한 조건에서 성장 된 biofilms에 존재 알려진 단일 종의 FC 측정 참조 데이터베이스는 데이터의 해석으로 도울 수 있다.

1. 참고: 단일 종
   1. 2.5-7에 최적화 된 FC 매개 변수를 사용 하 여, 단일 종 (paraformaldehyde에도 고정 및 교류 cytometer에 대 한 적절 한 크기의 필터를 통해 필터링)의 광학 속성과 형광을 측정.
   2. 같은 방식으로 데이터 (단계 6.1.2 참조) biofilms에서 단일 종에서 데이터를 정상화.
2. 참조: 손상 되 고 부패 셀
   Biofilm 건강의 가장 중요 한 지표 중 하나는 biofilm에 손상/죽어가는 세포의 일부분입니다. 이러한 셀을 계량, 부패 셀의 참조를 준비 수 있습니다.
   1. 1 mL 희석된 biofilms의 샘플이 고 탁상 원심 분리기에서 10 분 동안 그들을 실 온에서 8000 x g 에서 원심. 1 mL 90% 에탄올에 결과 펠 릿을 일시 중단 하 고 4 ° c.에 하룻밤 정지를 저장 다음날에 반복 합니다.
   2. 최적화 된 FC 설정을 사용 하 여, 손상 되 고 부패 셀 (고정 및 필터링)의 광학 속성과 형광 측정 합니다.
3. 참고: microplastics
   참고:: 는 biofilms에 microplastic 입자 모니터링에 관심이, 그들은 충분히 다른 지 여부를 확인 광학에 생물 입자 및 식별에 대 한 형광 속성에서.
   1. Microplastics 프로듀서의 지시에 따라 microplastic 입자를 일시 중단 하 고 (2.7에서 FC 매개 변수를 사용 하 여) 그들의 광학 및 형광 속성을 측정 한다.
   2. Biofilm 샘플을 microplastic 입자를 추가 하 고 위에 밤에 4 ° c.
   3. 펜션과 같은 FC 매개 변수로 위의 측정값을 필터링 합니다.

4. 샘플 준비와 저장

1. FC 설정 이며 FC 참조 데이터베이스 준비, 일단 하나 1.1-7 단계에 따라 수집 된 신선한 biofilm 샘플의 평가 함께 진행할 수 있습니다. 분리/분산 된 biofilm, 원심 분리기 튜브 샘플의 15 mL 플라스 크 (단계 1.7 참조)에서 전송.
2. 물 목욕의 센터에 각 튜브를 넣고는 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준에 잠수함. 1 분 45 khz 샘플 sonicate
3. 0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글 (nanopure 물에 재고)에서 샘플을 수정. 분석에 대 한 준비까지 4 ° C에서 저장 합니다.
4. 중요:-cytometry 분석에 대 한 샘플의 절반을 사용 하 고 절반 형광 활성화 된 세포 분류 또는 가벼운 현미경 검사 법 (제 6 항 참조) 선택적 유효성 검사에 대 한 스토리지 안전에 대 한 유지.
   :: 을 참고 냉장고에 저장, 고정된 biofilm 샘플 유지 한다 그들의 광학 및 형광 속성 3 주 최대.

5. FC를 통해 샘플을 실행합니다.

1. 샘플은 냉장고에 저장, 신속 하 게 그들을 sonicate 또는 여러 번 입자를 분리 하기 위하여 플라스틱. 측정 하기 전에 50 μ m 필터 (필터 크기는 FC 모 세관의 너비에 따라 달라 집니다)는 하위를 필터링 합니다.
2. 개별 샘플을 로드 (1-2 mL,이에 따라 달라 집니다 사용 교류 cytometer) 교류 cytometer로 각 입자의 광학 및 형광 특성을 측정 하 고. 각 생물 복제 (3 기술 복제) 당 3 회 측정을 반복 합니다.
3. FC.csv 형식에서에서 데이터를 내보냅니다.

6. 데이터 준비 및 상관 관계 분석

FC 각 측정된 광학 속성 및 형광 범위에 대 한 여러 매개 변수 (예를 들면, 신호 면적, 높이, 너비) 분석할 수 있습니다. 측정된 변수에 상관 관계 분석을 실행 하 고만 높은 상관 없습니다 그 측정을 유지. 이 보통 한 FC 매개 변수 (예를 들면, 신호 지역) 제외 하 고 모두 제거 하 고 상관 수 있다 또한 제거 높은 형광 측정 (일반적으로 동일한 레이저에서 형태소 및 필터 인접).

1. Matlab에서 도구 상자 CYT 실행:
   1. CYT 소프트웨어¹⁶, 모든 기술 등 생물 학적으로 분석 하는 모든 샘플에서.csv 형식에서 가져오기 감소 FC 데이터 복제 합니다. (클릭 +, 파일 필터 *.csv 가져오기 파일을 선택).
   2. 하이퍼볼릭 아크사인 변환을 사용 하 여 모든 샘플의 형광 채널 변환. 공동 인자 값; 선택할 필요가 150 일 가장 광합성 biofilms 및 교류 cytometers 하지만 최적화에 대 한 특정 실험 설정 및 이렇게 biofilms에 대 한 필요할 수 있습니다. (오른쪽-클릭/변환/입력 cofactor 150)
   3. 품질 관리에 대 한 시각 비교 (CYT)에서 개별 샘플 및 확인 거기 아무 outliers 복제 기술 및 생물 학적 수준에서 개별 광과 형광 채널의 히스토그램. Outliers는 복제 사이 크게 이동한 형광/광학 배포판에서 매니 페스트 것입니다. (데이터, 선택 채널, 플롯을 선택)
      1. 대안: 형광 배포판의 중간 값에 주성분 분석 (PCA)를 실행 하 고 기술 및 생물 복제 클러스터 함께 있는지 확인 하십시오.
   4. 기술 각 생물 복제에 복제 병합 및 subsample 생물학 복제, 각각 입자 (셀, 셀 조각 및 abiotic 입자)의 동일한 수로 표시 되 고 입자의 총 수에 의해 분석 반 즈-헛 확률적 이웃 (bh-SNE) 포함 (최고의 시각화 결과²⁶)에 대 한 약 150, 000 이다. (데이터, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 병합/Subsample 선택)
   5. 샘플 사이의 비교에 대 한 그것은 비교 하는 샘플만을 선택 하는 것이 중요입니다. 샘플을 선택 하 고 bh SNE²⁷실행. 알고리즘 완료, 새로운 채널은, 일단 명명 된 bh SNE1와 bh SNE2 나타납니다. 이들은 점도 (viSNE 지도)에서 데이터를 시각화 하는 데 사용할 수 있습니다 모든 분석 된 입자의 SNE 좌표. (데이터, 채널, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, bh SNE, 정규화 된 데이터 예)
   6. ViSNE 지도에서 입자는 유사성에 따라 배치 하 고 시각적으로 분리 클러스터로 그룹화 합니다. CYT에서 사용할 수 있는 그리기 도구를 사용 하 여 다른 광/형광 속성 있고 잘 분리 되어 그의 클러스터와 마크와 이름 광/형광 속성 검사 합니다. (선택 채널 bh-SNE1, bh-SNE2)
   7. 옵션: 하나의 미생물 종 (같은-cytometry 설정 측정 및 유사한 조건 하에서 성장!)의 참조 데이터베이스를 사용할 수 있으면 viSNE 지도 Matlab으로 내보내고 지도에 참조 데이터베이스 프로젝트. 이 방법에서는, 특정 클러스터 특정 종/분류학 그룹 (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis에서 다운로드에 사용할 수 있는 스크립트)에 연결할 수 있습니다. (세션/저장)
   8. 문제 해결: bh SNE 분석은 시각적으로 분리 클러스터, 하지만 하나의 큰 하나를 반환 하지 않으면, 너무 많은 입자에서에서 사용 되었다 bh SNE. 샘플 당 적은 입자와 다시를 시도 하십시오. 클러스터, 하지만 오히려 스파스 개별 포인트 경우 사용 하는 입자의 수를 늘립니다.
2. 선택 사항: bh-SNE는 클러스터링에 사용 하는 대신 다른 클러스터링 방법 (예를 들어계층 구조, 중심 기반 또는 밀도 기반 클러스터링) 정규화 된 데이터에 사용 하 고 수 다음 viSNE (https://github.com/에 겹쳐 anzezupanic/FC_analysis)입니다.
3. 클러스터 확인 한 후, 각 샘플에 각 생물 복제에 속한 각 클러스터에 있는 입자의 수를 계산 합니다. 적절 한 (예를 들어, 홈즈)와 ANOVA와 Tukey의 테스트를 사용 하 여 샘플 간의 차이 평가 여러 비교에 대 한 수정.

7. 선택 사항: 유효성 검사 형광 활성화 된 세포 분류를 사용 하 여 클러스터 해석의

1. 클러스터 확인 한 후, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여는 FACS 구성이 비슷한 (또는 동일한) 레이저 및 형광 필터는 원하는 경우 샘플에서 그들을 정렬.
2. 식별 된 각 클러스터 CYT 광과 형광 게이츠를 클러스터를 정의 하는 제공 합니다. 이 게이트를 사용 하 여 각 클러스터는 FACS에 입자를 밖으로 정렬 한 다음 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 정렬된 셀을 식별.

결과

(그림 1)을 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 스위스에서 로컬 스트림의 여러 사이트에서 샘플 분석 했다. 각 사이트에서 3 개의 비슷한 크기의 돌 (10-12 cm) 찍은, 그리고 biofilms 돌 닦 했다. 샘플 다음 sonicated, 고정, 필터링 되었고 나중 cytometry에 의해 분석. 교류 cytometer와 사용 하는 참조 데이터베이스의 설치 이전 종이¹⁵에 설명 된 ?...

토론

위에서 설명한 프로토콜은 구현 하려면 상대적으로 간단 합니다. 그러나, 표시 기본 설정을 모든 광합성 biofilm 지금까지 테스트에 적합 하도록 표시 되었습니다, 하는 동안 최적화 (프로토콜에서 설명) 하는 대로 방법에서 얻은 정보를 최대화 하기 위해 필요 하다. 실제로, biofilms의 광과 형광 속성 환경 조건 (계절, 온도, 물의 화학 성분)¹에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서,이 가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data