Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Resumo

Análise de isótopo carbono e oxigênio estável de carbonato de esmalte do dente humano e animal tem sido usado como um proxy para cada dieta e reconstrução ambiental. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada e documentação visual de granel e sequencial do dente esmalte amostragem bem como pré-tratamento de amostras arqueológicas e paleontológicas.

Resumo

Análise de isótopo carbono e oxigênio estável de carbonato de esmalte do dente humano e animal foi aplicado em pesquisa de paleoambientais e paleodietary, paleoecológica, de períodos históricos recentes para mais de 10 milhões anos atrás. Granel abordagens fornecem uma amostra representativa para o período de mineralização do esmalte, enquanto amostras sequenciais dentro de um dente podem rastrear mudanças dietéticas e ambientais durante este período. Embora essas metodologias foram amplamente aplicadas e descritas em arqueologia, paleontologia e ecologia, há não orientações explícitas para ajudar na seleção de equipamentos de laboratório necessários e para descrever minuciosamente detalhado laboratório amostragem e protocolos. Neste artigo, Nós documentamos textualmente e visualmente, todo o processo de amostragem através de triagem de pré-tratamento e LGMA tornar a metodologia mais amplamente disponível para pesquisadores, considerando sua aplicação em uma variedade de configurações de laboratório.

Introdução

Análises de isótopo carbono e oxigênio estáveis de carbonato de esmalte do dente tem sido usada para estudar o passado humano de ingestão, desmame e mobilidade, bem como dependência da fauna de vegetação, o movimento de animais e pecuária foddering. Esses aplicativos foram exaustivamente discutidos e revisados para uma variedade de condições ambientais, indicando os efeitos da aridez local, temperatura, fontes de água e vegetação composições^{1,2, 3,4,5,6}. A diversidade de aplicações potenciais em arqueologia e paleontologia, bem como a boa preservação do carbonato de esmalte do dente, fêz um material atrativo para o isótopo estável de trabalho³. Métodos de amostragem, pré-tratamento e rastreio de diagénese são brevemente descritos em algumas das anteriores Publicações^1,7. No entanto, completa manifestações verbais e visuais permanecem em grande parte indisponíveis, particularmente para pessoas fora de laboratórios de ciência arqueológica e entre grupos de laboratório com financiamento limitado, onde está a aumentar o interesse no uso desta técnica ⁵.

Esmalte do dente é principalmente composta de hidroxiapatita (bioapatite) cristalitos⁸ maior do que aqueles no osso, tornando-os mais resistentes para post-mortem LGMA iônico substituições e contaminação³. Estudos modernos têm demonstrado que medições de isótopos (δ¹³C) carbono estável do dente da fauna esmalte confiantemente registro animal dieta e comportamento^9,10. O valor de isótopo (δ¹⁸O) oxigênio estável do esmalte do dente é determinado pela composição isotópica do oxigênio da água ingerida, que inclui a água na planta e alimentos de origem animal, água potável, respiração, bem como vários impactos ambientais sobre a água que pode levar a ainda mais o fracionamento isotópico (EG., aridez, temperatura, altitude, quantidade de precipitação, localização continental)¹¹. Isso a tornou um método popular para reconstrução dietético e ambiental na pesquisa arqueológica, paleoecológica e paleontológica.

O período de formação do esmalte de dente é relativamente curto (anos) e difere dependendo do dente a ser amostrado. Para os seres humanos, primeiro molar esmalte mineralizes entre o nascimento e os 3 anos de idade, pré-molares mineralize entre 1,5 e 7 anos de idade, segundo molares mineralize entre 2,5 e 8 anos de idade e terceiros molares mineralize durante a adolescência, entre 7 e 16 anos,¹² . Tendo em conta que formas de esmalte do dente incrementalmente ao longo de seu período de formação, pode ser amostrado em massa ao longo do eixo de crescimento inteira ou amostrado sequencialmente, a fim de investigar as mudanças na dieta e ambiente que ocorreram durante o período de formação¹³ . Mudanças dietéticas ordenadas cronologicamente dentro de um determinado dente são observável para seres humanos e outros animais^1,14, fornecendo informações sobre inter-anual variação sazonal e dietética.

Enquanto o esmalte é geralmente resistente a diagénese, isotópicas modificações resultantes do ambiente enterro são possíveis e foram observadas^15,16, fazendo verificações experimentais e pré-tratamento escolhas útil. Enquanto não é o método só está disponível, Fourier transform espectroscopia de infravermelho (FTIR), particularmente no modo de transmissão atenuadas, surgiu como uma forma rápida, barata e relativamente acessível método para avaliar grafismos alteração no esmalte do dente, particularmente em contextos paleontológica^17,18,19,20. No entanto, detalhada de protocolos e padrões de gravação permanecem relativamente inacessíveis para muitas pessoas, fora os campos da ciência geoquímica ou material.

Tempos de reação e os produtos químicos empregados por pesquisadores no pré-tratamento do esmalte do dente também variam consideravelmente na literatura, muitas vezes com limitada consideração sobre o que esta variabilidade pode fazer ao carbono estável e valores de isótopos de oxigênio da amostra^{21 ,22}. Aqui, nós relatamos uma abordagem que usa diluir o ácido acético (0,1 M) para o pré-tratamento das amostras de pó de esmalte. No entanto, dado que as diferenças nas medições isotópicas resultantes de pré-tratamento são relativamente menores para o esmalte do dente, é melhor para os pesquisadores a seguir os protocolos para conjuntos de dados com os quais desejam comparar seus dados para¹¹. Além disso, onde pequenas amostras sequenciais são tomadas, particularmente em amostras do Holoceno, sem pré-tratamento pode ser escolhido (sequência de testes-piloto LGMA) para evitar o desperdício de amostra.

Embora os métodos que nós relatamos aqui não são de modo novos, para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que uma completa documentação escrita e visual de granel e amostragem sequencial, pré-tratamento escolhas e métodos de seleção LGMA (sob a forma de FTIR) para dente esmalte se tornaram amplamente disponíveis para um público variado e acadêmico. Enquanto esperamos que nossos esforços fará com que esta abordagem mais facilmente acessível a um número maior de indivíduos e laboratórios, pesquisadores que deseja aplicar e publicar esta técnica devem estar cientes do mínimo relatórios padrões, considerações LGMA, e requisitos de apresentação visualizadosm em outro lugar²⁰, bem como o potenciais interpretativas complexidades que serão exclusivo para sua região de estudo, táxons analisadas e tempo de período⁵.

Protocolo

O seguinte protocolo segue as diretrizes do laboratório de espectrometria de massa de isótopo luz no Instituto Max Planck para a ciência da história humana. Permissões de ética adequado dos comitês nacionais e internacionais devem ser procuradas para análises envolvendo ameaçadas modernos ou históricos de espécimes da fauna e para a utilização de material arqueológico e da fauna de interesse para as partes interessadas contemporâneas . Neste trabalho, as amostras utilizadas foram encontrados fósseis e arqueológicos. Não há seres humanos vivos foram utilizados neste estudo e éticas, institucionais e governamentais permissões tem sido adquiridas para qualquer análise destrutiva.

1. volume de amostragem

Nota: Para os seres humanos e animais, o método básico de granel dente esmalte amostragem é a aplicação de uma broca para a borda bucal do dente.

1. Limpe a superfície externa do dente (~0.1 mm) usando um tiro blaster de alumínio ou por abrasão suave usando a instalação de broca. Use uma broca Hand-Held com uma limpo com ponta de diamante broca (veja abaixo), da mesmo forma, ligada através de um mandril para a afinação de broca. Certifique-se de que a abrasão gentil e até mesmo é executada como uma ranhura paralela ao eixo de crescimento inteira (Figura 1 e Figura 2).
2. Tente, sempre que possível, ao aplicar o método para a mesma porção de dente para cada ser humano ou animal amostrado.
   Nota: Na pesquisa da paleodietary humana, terceiros molares são geralmente favorecidos como representante de tarde juvenil/adulto dieta enquanto primeiros molares são evitados devido à desmama efeitos²³. O dente preferencial para cada táxon e o período de vida representada, irá variar com as amostras disponíveis e pergunta sob estudo.
3. Broca em um local bem ventilado, enquanto usava uma máscara para evitar a inalação do pó de esmalte do dente. Use óculos de protecção para proteger os olhos. Esteja ciente de que a quantidade de pó de amostra perfurado irá variar dependendo do equipamento utilizado para análise, protocolo de pré-tratamento e tamanho do dente. Perfurar a baixa velocidade para evitar o aquecimento da amostra.
   Nota: Aproximadamente, 4-8 mg de pó de amostra é uma meta apropriada para múltiplas análises usando um sistema de preparação e introdução de gás on-line para espectrometria de massa de razão isotópica e testes LGMA. Esteja ciente de que a velocidade da broca escolhida dependerá a fragilidade da amostra e exigirá algum nível de tentativa e erro. Em geral, uma broca Hand-Held, duas de cinco barras de força são suficientes. Perfurar o pó de dente sobre um pedaço de papel alumínio limpo ou papel de pesagem.
4. Recolher o pó resultante do esmalte e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que tem sido tarado num equilíbrio adequadamente exato antes da perfuração. Etiquete cada tubo com a designação de amostra (Figura 3). Registre o peso de números e esmalte de amostra em um caderno de laboratório, bem como um banco de dados eletrônico.
5. Antes de perfurar cada dente novo, limpe os bocados de broca utilizada primeiro usando 0,5 M de HCl em um tecido robusto. Em seguida, lave o bocado de broca com um solvente orgânico (tais como acetona, metanol ou etanol) usando um tecido robusto.
6. Seguindo uma perfuração sentado, limpe a área de trabalho completamente usando um dedicado aspirador, ou uma vassoura e. Limpe o espaço de amostragem com metanol. Vácuo ou pulverizar levemente a broca com ar comprimido para remover poeira e amostra em pó entre as amostras.

2. sequencial amostragem

Nota: Amostragem sequencial pode ser abordada em uma variedade de formas e dependerá do táxon ser amostrado, o tamanho do dente, bem como a resolução temporal desejada.

1. Limpe a superfície do dente sendo amostrado removendo uma muito fina camada (~0.1 mm) do esmalte do dente exterior.
2. As amostras ao longo da superfície bucal perpendicular ao eixo de crescimento do dente, fugindo da junção de raiz de esmalte para o topo da coroa da broca. Broca faixas horizontais perpendiculares ao eixo de crescimento, com cada amostra, resultando em um sulco de largura de 1-2 mm em toda a camada de esmalte (Figura 1 e Figura 4). Tome cuidado para evitar perfuração através do esmalte em dentina como ele iria contaminar a amostra e a medida resultante.
   Nota: O número de amostras colhidas irá variar dependendo da resolução desejada, mas c. 10 representa uma meta apropriada para estudar as mudanças sazonais em δ¹³C e valores de¹⁸O δ para um hypsodont do tamanho de gado domesticado.
3. Escolha a broca adequada para cada amostra, como a largura da linha de amostragem é determinada pelo diâmetro da broca.
4. Usar uma configuração de equipamento para dentes mais delicados que requerem um maior número de amostras elementares (Figura 2) (EG., dentes humanos), bem como para perfuração mais estável. Configure o suporte de equipamento que mantém a broca firmemente, com a broca a apontar para baixo.
   Nota: Enquanto quatro amostras podem ser facilmente obtidas um molar humano permanente usando uma abordagem à mão²⁴, amostragem mais refinada requer um equipamento ou CO₂ abordagem de ablação do laser que não serão discutidos aqui¹⁴. Outra abordagem comum é usar um semi-automático microsampling²⁵.
5. Segure o dente ou anexar a uma pinça. Pressione o esmalte do dente contra a broca e aplique pressão. As amostras são perfuradas incrementalmente ao longo da superfície bucal partir do ápice (superfície oclusal) para a base da coroa no local da junção esmalte-raiz (ERJ). Replica a mesma amostra estratégia várias vezes cada consecutivos linha paralela à linha de amostra anterior de perfuração de perfuração. Use uma broca de diamante cilíndrico pequeno para dentes delicados, tais como molares de ovelha, com um diâmetro de 1 mm (Figura 1).
6. Medir a distância de cada linha de amostragem do ERJ usando pinças e gravar essa distância para comparação.
7. Siga as etapas 1.3-1.6 acima.
   Nota: Se dentes pequenos, delicados estão sendo analisados e métodos de verificação de pré-tratamento e LGMA não são aplicados, amostras tão pequenas quanto 1-4 mg irão produzir resultados fiáveis em uma afinação de preparação e introdução de gás on-line para análise de carbonato. Modificado sistemas automatizados-periférico podem facilitar o uso de pesos de amostra ainda mais baixos, mas são inevitavelmente limitados pela proporção de carbonato na esmalte estudados (4 a 5% em peso)^26,27. Os investigadores devem consultar o laboratório onde as amostras são vai ser medido para determinar a quantidade de amostra necessária.

3. método de Fourier reflectância Total infravermelho transformar do espectrometria/atenuada

1. Para o método de reflectância Total atenuada, estabelecer um fundo de câmara de amostra, ou sob vácuo ou em condições atmosféricas normais.
2. Coloque aproximadamente 1 mg de esmalte do dente sobre o cristal de diamante na câmara de amostra usando uma espátula. Baixe e fixe o post da amostra até que haja uma conexão firme entre o post, a amostra e a placa de diamante. Feche a câmara de amostra, com ou sem um vácuo a ser criada, dependendo da configuração ou disponibilidade.
3. Medir os espectros FTIR da amostra 64 vezes para o número de onda variando entre 400 e 4.000 cm^-1. O número desejado de repetições irá variar com base nos objetivos do estudo, embora a análise de três repetições, idealmente com alíquotas diferentes sendo tomadas e depois voltou para o tubo de microcentrifugadora habitação a amostra, irá garantir resultados robustos.
4. Limpe a espátula com metanol entre cada alíquota e entre cada amostra.
5. Realize uma correção de linha de base usando o software disponível. O software automaticamente subtrai o fundo de câmara de amostra do perfil de FTIR resultante. Para garantir melhor reprodutibilidade, só esmalte espectros com uma absorvância mínimo de 0,06 para a maior banda de fosfato em ~cm 1035^-1 devem ter em conta.
6. Monitore a presença da calcita de carbonato secundário contaminante comum em todas as amostras, verificando para um pico em 711 cm^-1.
7. Após a análise, cuidadosamente retornar as amostras de seus tubos microcentrifuga usando um dispositivo de aspiração ou espátula e levar para a próxima etapa do pré-tratamento ou análise.
8. Exportar os dados brutos do comprimento de onda e intensidade, como um arquivo. csv (ou similar) e usar para calcular os índices de interesse (índices comumente usados incluem A-site índice de fosfato, B-site índice de fosfato, fosfato, índice de cristalinidade, água-Amida no índice de fosfato, e CO₃/PO₄ índice^17,18,19) (tabela 1).
9. Comparar o FTIR resultados de amostras as fóssil ou arqueológicas para crescendo datasets do esmalte do dente da fauna moderna agora disponível na literatura^19,20 para determinar a natureza e a extensão da alteração LGMA para o esmalte amostrado.

4. pré-tratamento ácido acético simples (0,1 M)

1. Pese o pó de esmalte para cada amostra em um tubo de microcentrifugadora usando um equilíbrio conforme apropriado. Rotule o tubo adequadamente. Esmalte pó deve ser terreno no mesmo grau, com partículas de um tamanho similar.
   Nota: Muitos pesquisadores utilizam um agente oxidante, tais como o descorante diluído (NaClO) ou 30% peróxido de hidrogênio (H₂O₂) para remover os produtos orgânicos de uma amostra e isto deve ser adicionado neste ponto. Não só podem estes reagentes alteram o carbono estável e valores de isótopos de oxigênio de uma amostra, porém, espectros de amostras de colágeno ósseo em um sistema de preparação e introdução de gás on-line demonstram que o ácido fosfórico 100% utilizado em carbonato medição não reage com amostras orgânicas (Figura 5), sugerindo que este passo é desnecessário.
2. Adicione 0,1 mL de 0,1 M de ácido acético (por 1 mg de esmalte) para cada amostra com uma pipeta. Evite tocar as amostras com a pipeta. Se a amostra e a pipeta entram em contato, use uma pipeta de nova para a próxima amostra para evitar a contaminação cruzada.
3. Agitar, por meio de agitação ou um agitador eletrônico (Figura 3) e depois deixar as amostras durante 10 min. do pó de esmalte não deve ser deixado em ácido acético por um período prolongado de tempo ao (> 4 h).
4. Coloca as amostras em microcentrifuga por 2 min a 13.700 x g.
   Nota: Uma alternativa de baixo custo é a utilização de uma mini centrífuga para 4 min a 3.500 x g, que detém menos de amostras, mas é menos demorado ao lidar com conjuntos de amostra grande.
5. Quando o programa microcentrifuga para, substitua o ácido acético com 2 mL de água ultrapura, usando uma pipeta limpa, então microcentrifuga as amostras por 2 min a 13.700 x g.
6. Mudar a água ultrapura mais duas vezes, como antes e testar a neutralidade. Remova o fluido restante usando uma pipeta (sem perturbar o sobrenadante).
   Nota: Um total de três lavagens com água ultrapura é o procedimento padrão para obter a neutralidade. A amostra deve ser lavada até neutralidade é alcançada.
7. Cortar folhas de Parafilm (1 cm x 1 cm) e coloque sobre cada tubo de microcentrifugadora. Faça um pequeno furo no centro usando um objeto afiado, de modo que a amostra seca adequadamente.
8. Coloque os tubos em um congelamento mais seco para remover qualquer fluido remanescente.
   Nota: Se um congelamento mais seco não é disponível, gentil o forno de secagem (40 ° C) também é uma possibilidade e não deve ter quaisquer efeitos adversos sobre o carbono estável e dados de isótopos de oxigênio.
9. Uma vez seco, remova o Parafilm e feche as tampas microcentrifuga. Certifique-se que a rotulagem do tubo está correto e re-escrever se necessário.
   Nota: Esta é a fase final antes do armazenamento para a pesagem de fora, que em laboratórios com fundos limitados pode ser o último estágio antes da distribuição das amostras para análise em outro lugar.

5. pesagem e medição de amostras e padrões

1. Usando uma espátula, pese cerca de 2 mg de pó de esmalte sobre um disco de estanho em um equilíbrio sensível a 0,001 mg (Figura 6). Então cuidadosamente transferi a amostra para um frasco de vidro borosilicato resistente a ácido fosfórico. Essa quantidade de esmalte é necessária para produzir resultados fiáveis devido a proporção relativamente pequena de carbonato no esmalte do dente.
2. Limpar a espátula entre amostras usando metanol e usar um disco limpo ou pesando navio para cada amostra.
3. Pese 0,2 mg de uma norma internacional, tais como a AIEA NBS18, AIEA 603, AIEA CO8 ou Merck CaCO₃. Uma norma interna feita de esmalte homogeneizado de um dente grande pode ser usada como bem²⁰. Para uma execução completa de 76 amostras e padrões, 61 amostras de uso e 15 normas, que devem ser uniformemente distribuídas por toda a corrida. Vários estudos têm relatado números adequados de normas e detalhes em pesquisa arqueológica^20,28.
   Nota: O repetido tratamento prévio e análise de um esmalte no padrão de casa, através de um número de pistas de amostras arqueológicas, também é susceptível de fornecer uma medida adequada de precisão para as amostras estudadas²⁰.
4. Aperte as tampas especialmente projetados, acessíveis para a agulha até o septo é apertado mas não sugado para dentro do frasco. Não aperte a tampa como a pressão sobre o septo ficará muito forte e, finalmente, pode resultar em uma agulha quebrada durante a análise. Colocar os frascos em uma ordem listada dentro de um bloco de aquecimento a 70 ° C. A ordem e os pesos das amostras devem ser registados confiantemente de entrada para o software de computador.
5. Medir as amostras seguindo três etapas: 1) nivelado encha as amostras com hélio puro, 2) Adicionar o ácido fosfórico, 3) medir a amostra.
   1. Lave as amostras com hélio puro (grau 5.0) com um fluxo de 100 mL/min para 5 min retirar o ar ambiente.
   2. Adicionar 4-5 gotas de ácido fosfórico (99%, densidade 1,85 g/mL) para a amostra contendo carbonato. Começa a reação entre a amostra e H₃PO₄ . Durante a reação, o CO₂ é liberado que carrega o valor isotópico do íon carbonato CO₃^{2 -} da amostra.
   3. Espere 1h por amostra, até que seja atingido o equilíbrio de CO₂ . Depois de 1 h, as amostras devem ser medidas para obter resultados fiáveis. Durante a aquisição, uma mistura de amostra de gás e ele passa para o dispositivo. Uma fase de secagem Remove água de mistura de gases a amostra.
   4. Medir a amostra, iniciando com três picos de CO₂ , gás de referência com uma composição isotópica conhecida. Pico de intensidade deve ser 4000 mV para coincidir com a intensidade dos picos de amostra (entre 4000 a 8000 mV). Os três picos de gás de referência devem ser 20 s longa e 30 s separados. Siga com a definição do intervalo de medição da amostra. Medir a amostra 10 vezes para 5 s cada e 55 s separados. Certifique-se de que a altura do pico diminui ao longo do tempo, indicando o transporte adequado da mistura de amostra/hélio (Figura 5).
      Nota: Durante a medição, o software calcula a composição isotópica da amostra, comparando o valor conhecido isotópico, a altura do pico e a área do pico do gás de referência com a altura do pico e área dos picos das amostras. O cru ¹³C /¹²C e ¹⁸O /¹⁶O composição da amostra é calculada.
6. Normalize as amostras após a medição.
   Nota: Isto é importante porque o gás de referência não sofrer o mesmo caminho de químico e físico, como a amostra de gás quando introduzidos pelo espectrômetro de massa. Portanto, é essencial que as amostras são calibradas Adicionalmente aos padrões internacionais (etapa 5.3) que sofrem o mesmo tratamento físico e químico dentro de um prazo que a amostra se²⁰. Estas normas internacionais carbonato permitem a calibração de dois pontos de amostras para a balança de medição delta internacional e a avaliação da precisão e repetibilidade ao longo de um determinado prazo.

Resultados

Usando o procedimento de amostragem apresentado acima, amostras de esmalte incremental bioapatite estavam preparadas. A análise de bioapatite em esmalte depende da precisão da amostragem, se a granel ou incremental. Neste caso, optámos por apresentar os resultados das amostras arqueológicas (duas ovelhas) de diferentes zonas climáticas. Incrementais amostras foram analisadas a partir de segundo molares ovelhas e rotuladas, começando com o ERJ (Figura 4)...

Discussão

Os desafios da bem sucedida de amostragem (granel e incremental) da dentição depende do acesso ao conhecimento sobre técnicas de perfuração e preparação, juntamente com o investimento em equipamentos de custo relativamente baixo da amostra. Estes desafios são facilmente superáveis quando clara instruções estão disponíveis relativas à amostras e pré-tratamento de abordagens. Neste artigo, nós esperamos ter disseminado estes de forma clara e concisa para pesquisadores novos para esses métodos. Estudiosos a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dremel Micro	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro
Diamond-tipped drill bit	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point
1.5 mL micro-centrifuge tube	Sigma Aldrich		https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&region=DE&gclid=EAIaIQobChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE
Methanol			Linear Formula: CH3OH
Acetic Acid			Linear Formula: CH3CO2H
Dremel rig set-up (workstation)	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation
Microcentrifuge	Thermo Scientific		http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401
Mini-centrifuge	Sprout		http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4
Freeze drier	Zirbus Technology		http://www.zirbus.com